兩種等溫擴(kuò)增技術(shù)在二代測序病毒鑒定中的應(yīng)用

鄒曉輝 趙翔 馮兆民 王大燕 舒躍龍

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心，衛(wèi)計委醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗室

兩種等溫擴(kuò)增技術(shù)在二代測序病毒鑒定中的應(yīng)用

鄒曉輝 趙翔 馮兆民 王大燕 舒躍龍

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心，衛(wèi)計委醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗室

目的 評估兩種等溫擴(kuò)增方法在二代測序（Next generation sequencing，NGS）病毒鑒定中的應(yīng)用，為利用二代測序進(jìn)行病毒鑒定提供參考。方法 選取了兩份病原已知的重癥肺炎病人咽拭子，分別采用單引物等溫擴(kuò)增（Sing1e primer isotherma1 amp1ification，SPIA）和多重置換等溫擴(kuò)增（Mu1tip1e disp1acement amp1ification，MDA）的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行NGS測序和宏基因組學(xué)分析。結(jié)果 SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物片段較短，擴(kuò)增效率較低；而MDA擴(kuò)增的產(chǎn)物片段較長，擴(kuò)增效率也高。SPIA法在兩份樣本中均檢測到目標(biāo)病原，且目標(biāo)病原基因組覆蓋度較高。MDA在其中一份樣本中未能檢測出目標(biāo)病原。結(jié)論 SPIA與MDA擴(kuò)增方法均可用于NGS病原鑒定。SPIA法擴(kuò)增效率較低，成本較高，但檢測病原的能力高于MDA。

【主題詞】 等溫擴(kuò)增；下一代測序；病原鑒定

Fund program：Chinese Nationa1 Key Program of Mega Infectious Disease of the Nationa1 12th Five-Year P1an（2014ZX10004002）

近年來，下一代測序技術(shù)（Next generation sequencing，NGS）得到了飛速發(fā)展，極大的促進(jìn)了其在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用［1］。NGS技術(shù)結(jié)合高靈敏度的核酸擴(kuò)增，可以極大的提高臨床實(shí)驗室發(fā)現(xiàn)病原的能力。目前，NGS越來越多的用于臨床實(shí)驗室病原鑒定，并取得了一系列成果［2］。NGS技術(shù)已經(jīng)成為臨床病原鑒定的一種重要技術(shù)手段，得到了各個國家的高度重視［3］。

單引物等溫擴(kuò)增（sing1e primer isotherma1 amp1ificatio，SPIA）［4］和多重置換擴(kuò)增（Mu1tip1edisp1acement amp1ification，MDA）［5］是近年來發(fā)展較好的兩種等溫擴(kuò)增技術(shù)。本研究利用兩份病原已知的臨床樣本來評估兩種等溫擴(kuò)增方法在臨床病原鑒定中的應(yīng)用，為臨床利用NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)病原提供了參考。

1 材料與方法

1.1樣本信息 兩份咽拭子樣本均來自臨床重癥肺炎病人。RT-PCR方法鑒定樣本A為冠狀病毒229E（Coronavirus-229E）和 副流感病毒 2型（Parainf1uenza virus 2，PIV2）兩種病毒混合感染；樣本B為鼻病毒（Rhinovirus，RnV）感染。咽拭子采集后保存于病毒采樣液中，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2樣本核酸提取和擴(kuò)增 樣本RNA采用德國Qiagen公司的 RNeasy Mini Kit試劑盒提取，并用NEB公司DNase I消化宿主DNA。RNA采用文獻(xiàn)中介紹的SPIA［6］和MDA［7］法進(jìn)行等溫隨機(jī)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物采用 Qiagen公司 MinE1ute Reaction C1eanup Kit純化。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物濃度用Life techno1ogies公司的Qubit? dsDNA HS分析試劑盒定量。

1.3二代測序及數(shù)據(jù)分析 等溫擴(kuò)增產(chǎn)物采用Ion Torrent PGM（平均讀長為200 bp）或I11umina MiSeq （PE250）測序。NGS數(shù)據(jù)采用 CLC genomics workbench 7.5軟件進(jìn)行分析。首先將100 bp以下和質(zhì)量值（Phred qua1ity score）低于20的reads去除，剩余的reads進(jìn)行de novo組裝。取片段長度超過500 bp的Contig進(jìn)行NCBI nr數(shù)據(jù)庫BLAST。取BLAST檢索到的病毒基因組為參考基因組進(jìn)行mapping比對。

2 結(jié)果

2.1SPIA與MDA擴(kuò)增效率比較 取5 μ1 SPIA 與MDA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物主要分布在200～500 bp之間，條帶亮度較??；而MDA擴(kuò)增的產(chǎn)物大部分均大于2 000 bp，且條帶較亮，擴(kuò)增效率高 （圖1）。DNA定量結(jié)果顯示，SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物量為400～600 ng，而MDA擴(kuò)增產(chǎn)物量為5～8 μg。

圖1　SPIA與MDA擴(kuò)增兩份臨床樣本（A和B）產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Ge1 e1ectrophoresis of amp1ification products from SPIA and MDA（Samp1e A and B）

2.2兩種等溫擴(kuò)增方法對目標(biāo)病毒的鑒定 兩份樣本RNA通過SPIA和MDA擴(kuò)增后進(jìn)行二代測序，共獲得了178 814～3 565 305 reads（表1）。對于樣本A的兩種病毒229E和PIV2，SPIA分別組裝出4和15條相應(yīng)的contig，并分別獲得了116和11 102條相應(yīng)病毒 reads；而MDA未能組裝出229E的contig，但獲得了21條229E的reads。對于樣本B，SPIA擴(kuò)增可組裝出1條長達(dá)2 747 bp的contig，并獲得139 reads，而MDA未能發(fā)現(xiàn)目的病毒RnV的contig和reads。在各個樣本中，SPIA匹配上的各個病毒的reads數(shù)目明顯高于MDA。

2.1兩種檢測方法覆蓋度的分析 為了進(jìn)一步觀察SPIA和MDA兩種擴(kuò)增方法對病毒基因組覆蓋度的影響，我們對樣本A中的兩種病毒進(jìn)行了病毒基因組覆蓋度分析（表2）。結(jié)果顯示，對于229E病毒，SPIA可獲得12.2%的基因組覆蓋，MDA只覆蓋了7.4%的基因組區(qū)域。對于PIV2病毒，SPIA可獲得86.7%的基因組覆蓋，且大部分區(qū)域覆蓋深度高于5×；而MDA覆蓋了79.60%的區(qū)域，且大部分區(qū)域覆蓋度低于5×。

3 討論

臨床樣本由于采集量受限，在進(jìn)行NGS測序時一般需先進(jìn)行核酸擴(kuò)增，特別是拭子類的樣本，病毒含量較低，直接提取的核酸量一般不能滿足NGS的測序的最低起始量要求，因此，測序之前進(jìn)行核酸擴(kuò)增是NGS測序的常規(guī)步驟。傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增容易造成模板擴(kuò)增的偏移，不利于后續(xù)的檢測。等溫擴(kuò)增技術(shù)具有較好的均一性，在近年來得到了越來越多的應(yīng)用［8］。本研究利用咽拭子樣本，比較近年來發(fā)展較快的兩種等溫擴(kuò)增方法在NGS病原檢測上的應(yīng)用，為臨床實(shí)驗室開展NGS病原檢測提供了方法學(xué)參考。

RT-PCR是現(xiàn)階段臨床檢測病原微生物的主要手段［9］，而 NGS技術(shù)在近年來使用越來越多［10］。本研究比較了這兩種比較成熟的等溫擴(kuò)增技術(shù)在NGS病原鑒定中的應(yīng)用，結(jié)果顯示在兩份臨床樣本中，SPIA檢測到病原的能力均高于MDA擴(kuò)增，但其擴(kuò)增效率較低。本研究的MDA和SPIA擴(kuò)增均未能獲得病毒的全基因組序列，這可能與測序數(shù)據(jù)中的宿主基因組成分過高有關(guān)。通過樣本預(yù)處理的方法去除宿主基因組成分，并加大測序的數(shù)據(jù)量，可以有效提高基因組的覆蓋度。

表1　SPIA和MDA擴(kuò)增產(chǎn)物病毒分布Tab.1 Virus identified from the SPIA and MDA product using NGS

表2　SPIA和MDA擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)病毒覆蓋度分析（樣本A）Tab.2 Coverage ana1ysis of the two virus in samp1e A amp1ified by SPIA and MDA

總之，本研究比較了SPIA和MDA兩種等溫擴(kuò)增方法在NGS病原檢測上的應(yīng)用。SPIA與MDA均具有檢測病原的能力，但SPIA用于NGS病原檢測的能力高于MDA。在今后的使用中，可以根據(jù)測序平臺、測序成本和測序通量選擇合適的擴(kuò)增方法。

［1］ Quinones-Mateu ME，Avi1a S，Reyes-Teran G，et a1.Deep sequencing：becoming a critica1 too1 in c1inica1 viro1ogy.J C1in Viro1，2014，61：9-19.doi：10.1016/j.jcv.2014.06.013.

［2］ Jacob HJ.Next-generation sequencing for c1inica1 diagnostics.N Eng1JMed，2013，369：1557-1558.doi：10.1056/ NEJMe1310846.

［3］ Go1dberg B，Sichtig H，Geyer C，et a1.Making the Leap from Research Laboratory to C1inic：Cha11enges and Opportunities for Next-Generation Sequencing in Infectious Disease Diagnostics. MBio，2015，6：e01888-15.doi：10.1128/mBio.01888-15.

［4］ Barker CS，Griffin C，Do1ganov GM，et a1.Increased DNA microarray hybridization specificity using sscDNA targets.BMC Genomics，2005，6：57.doi：10.1186/1471-2164-6-57.

［5］ Dean FB，Hosono S，F(xiàn)ang L，et a1.Comprehensive human genome amp1ification using mu1tip1e disp1acement amp1ification. Proc Nat1AcadSciUSA，2002，99：5261-5266.doi：10.1073/pnas.082089499.

［6］ Kurn N，Chen P，Heath JD，et a1.Nove1 isotherma1，1inear nuc1eicacidamp1ificationsystemsforhigh1ymu1tip1exed app1ications.C1inChem，2005，51：1973-1981.doi：10.1373/c1inchem.2005.053694.

［7］ Zo11 J，Rahamat-LangendoenJ，AhoutI，eta1.Direct mu1tip1exed who1e genome sequencing of respiratory tract samp1es revea1s fu11 vira1 genomic information.J C1in Viro1，2015，66：6-11.doi：10.1016/j.jcv.2015.02.010.

［8］ 聶凱，滕智平，曾毅，等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展及其在病原檢測中的應(yīng)用.中華實(shí)驗和臨床病毒學(xué)雜志，2013，27：316-318.doi：10.3760/cma.j.issn.1003-9279. 2013.04.025

［9］ 龐正：病毒性出血熱多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法的建立.中國疾病預(yù)防控制中心，2013.

［10］ Thorburn F，Bennett S，Modha S，et a1.The use of next generation sequencing in the diagnosis and typing of respiratory infections.J C1in Viro1，2015，69：96-100.doi：10.1016/j. jcv.2015.06.082.

Application of two isothermal amplification methods in pathogen identification using the next generation sequencing

Zou Xiaohui，Zhao Xiang，F(xiàn)eng Zhaomin，Wang Dayan，Shu YuelongNatonal Influenza Center，National Institute for Viral Disdease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Key Laboratory for Medical Virology，National Health and Family Planning Commission，Beijing 102206，China

Shu Yuelong，Email：yshu@cnic.org.cn

Objective This study eva1uated two isotherma1 amp1ification methods for their abi1ity to identify targeted virus in the c1inica1 samp1es，which provided a reference for other researchers using NGS in c1inica1 diagnostics.Methods Nasopharyngea1 swabs from two patients with severe pneumonia were amp1ified with Sing1e Primer Isotherma1 Amp1ification（SPIA）method and Mu1tip1e Disp1acement Amp1ification （MDA）approaches and further proceeded to NGS and metagenomics ana1ysis to identify targeted virus. Results The SPIA produced shorter fragments than MDA，and had a 1ower amp1ification efficiency.The SPIA successfu11y identified targeted viruses in the two c1inica1 samp1es tested，whi1e MDA fai1ed to detect that in one of the samp1es.Conclusions Both SPIA and MDA cou1d be app1ied to pathogen identification using NGS in the c1inica1 diagnostics.SPIA possessed 1ower amp1ification efficiency and higher economic cost，but had higher capacity to discover the causing agents in the c1inica1 samp1e.

Isotherma1 amp1ification；Next generation sequencing；Pathogen identification

“十二五”重大傳染病專項“人感染新型流感防控技術(shù)研究（2014ZX10001002）

舒躍龍，Emai1：yshu@cnic.org.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.029

2016-01-05）