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      基于核酸雜交的病毒基因組特異性純化富集方法的初步研究

      2016-08-19 08:12:12王利靜劉林李建東李偉紅張碩梁米芳李德新
      關(guān)鍵詞:緩沖液探針核酸

      王利靜 劉林 李建東 李偉紅 張碩 梁米芳 李德新

      102206北京,中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

      基于核酸雜交的病毒基因組特異性純化富集方法的初步研究

      王利靜 劉林 李建東 李偉紅 張碩 梁米芳 李德新

      102206北京,中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

      目的 探索實(shí)驗(yàn)室高通量檢測(cè)前臨床樣本中病毒核酸特異性純化富集的方法。方法

      以負(fù)鏈RNA病毒發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)為模擬樣本,針對(duì)病毒基因組S、M和L三個(gè)片段設(shè)計(jì)雜交探針,并進(jìn)行5'端生物素修飾,與鏈霉親和素修飾磁珠共價(jià)結(jié)合,純化樣本中SFTSV核酸,比較研究特異性純化富集對(duì)樣本二代測(cè)序效果的影響。結(jié)果 cDNA文庫(kù)制備時(shí)全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增前或后進(jìn)行特異性富集純化均較不開(kāi)展富集純化有顯著改善,有效數(shù)據(jù)比例分別為5.57%、6.39%、2.71%,差別具有顯著性(χ2=9 799.8,P<0.001)。對(duì)全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增前或后進(jìn)行特異性富集純化對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析時(shí)發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增后進(jìn)行純化優(yōu)于擴(kuò)增前(P<0.001)。結(jié)論 基于核酸雜交的病毒基因組特異性富集純化方法可有效降低二代測(cè)序中背景值,提高測(cè)序效率,具有高通量檢測(cè)前特異性純化富集樣本的作用。

      【主題詞】 病毒基因組;純化;富集;二代測(cè)序

      Fund programs:China Mega-Project for Infectious Diseases Grants from the Ministry of Science and Techno1ogy and the Ministry of Hea1th:Emergency response and detection p1atform construction for infectious disease(2013ZX10004-101)

      基因組高通量測(cè)序即二代測(cè)序技術(shù)(Next-Generation sequencing techniques,NGS)在病原體篩查鑒定以及基因組信息相關(guān)的研究方面應(yīng)用日趨廣泛,具有高分辨率、高敏感性和高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)[1]。病毒基因組高通量測(cè)序前樣本處理及cDNA文庫(kù)構(gòu)建一般采用基于隨機(jī)引物的擴(kuò)增技術(shù)[2-3]建庫(kù)提高二代測(cè)序技術(shù)的病原體篩查檢測(cè)效率,需要在測(cè)序前的樣本處理、測(cè)序過(guò)程以及序列結(jié)果分析等方面進(jìn)行優(yōu)化完善。本研究以負(fù)鏈RNA病毒發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)為模擬樣本,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性雜交探針,建立基于磁性微球的特異性富集純化病毒基因組的方法。并通過(guò)不同處理間SFTSV三個(gè)片段質(zhì)量比例比值及二代測(cè)序中有效數(shù)據(jù)比例的比較,以期在測(cè)序前建庫(kù)處理中,達(dá)到純化富集核酸樣本,有效降低二代測(cè)序非目的數(shù)據(jù)目的。

      1 材料與方法

      1.1模擬樣本的制備 以SFTSV HB29毒株為模擬標(biāo)本,經(jīng)vero細(xì)胞培養(yǎng)后,收獲上清,將培養(yǎng)上清13000/min、4℃、離心10 min,取上清經(jīng)0.22微米濾器過(guò)濾,收取待用。

      1.2核酸雜交探針從Genbank下載白蛉病毒屬中可引起出血熱的病毒(SFTSV)、Rift Va11ey fever virus(RVFV)、Heart1and virus(HLV)基因組序列,應(yīng)用Mega 6.0軟件分別對(duì)S、M、L三個(gè)片段進(jìn)行序列比對(duì),在相對(duì)保守區(qū)域,設(shè)計(jì)針對(duì)三個(gè)片段的雜交探針。根據(jù)三個(gè)片段長(zhǎng)度不等,分別設(shè)計(jì)出1、2、3條不等的探針,并應(yīng)用primerprimier 5.0對(duì)特異性探針進(jìn)行評(píng)價(jià)比較,由上海生物工程生物公司合成,對(duì)探針5′端進(jìn)行生物素修飾。

      1.3SFTSV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 用于絕對(duì)定量標(biāo)本中的SFTSV S、M、L片段的引物探針序列來(lái)自文獻(xiàn)[4]。使用AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit(App1ied Biosystems,USA)在 CFX96 Rea1 Time System(Bio-Rad,USA)儀器上進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系的總體積為25 μ1,引物濃度為0.4μmo1/1,探針濃度為0.12μmo1/1,模板為5 μ1,其余成分參考試劑盒說(shuō)明。反應(yīng)條件為95℃ 10 min;95℃15 s,60℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)。分別利用含有SFTSV S、M、L片段的質(zhì)粒,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到各片段對(duì)應(yīng)的模板RNA。再經(jīng)Nanodrop定量后,根據(jù)模板的堿基長(zhǎng)度,通過(guò)相應(yīng)公式

      換算為拷貝數(shù)/μ1,將體外轉(zhuǎn)錄得到的模板RNA,經(jīng)過(guò)定量、換算和DEPC處理水進(jìn)行10倍梯稀釋至濃度為103~1010拷貝/μ1的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,以此為模板,進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,以得到的CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.4核酸提取 取收集的 HB29毒株上清使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Germany)按照產(chǎn)品說(shuō)明書分別進(jìn)行 SFTSV及 vero細(xì)胞 RNA提取,使用

      Nanodrop進(jìn)行RNA定量。二者核酸以1:3比例混合以模擬臨床樣本。

      1.5核酸純化 取樣本核酸3 000 ng,混于50 μ1漂洗/結(jié)合緩沖液中65℃加熱10 min,冰浴3 min;取50 μ1鏈霉親和素磁珠于離心管中,加入100 μ1漂洗結(jié)合緩沖液,渦旋漂洗,置磁場(chǎng),棄上清;分別取10 μ1(8 pmo1/μ1)生物素標(biāo)記的探針,置于磁珠,室溫孵育10 min,混勻,置磁場(chǎng),棄上清;將上述總RNA樣本置于結(jié)合探針的磁珠里,雜交溫度(60℃)下孵育30 min,混勻,置磁場(chǎng),棄上清,加入100 μ1漂洗/結(jié)合緩沖液(保持60℃),渦旋振蕩,置磁場(chǎng),棄上清;依次用漂洗/結(jié)合緩沖液及低鹽緩沖液(保持60℃)重復(fù)漂洗,棄上清;后加40 μ1去離子水,95℃,加熱1 min解離探針與RNA;置磁場(chǎng),轉(zhuǎn)移上清于離心管中。

      1.6全 轉(zhuǎn) 錄 組 擴(kuò) 增 (wholetranscriptome amplification,WTA)使用 REPLI-g?WTA Sing1e Ce11 Handbook(Qiagen,Germany)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增。取核酸 RNA 8 μ1,加入3 μ1變性緩沖液,95℃加熱3 min,后向反應(yīng)體系中加入2 μ1去gDNA緩沖液,42℃加熱10 min;向反應(yīng)體系中加入4 μ1逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶緩沖液,2 μ1隨機(jī)引物,1 μ1逆轉(zhuǎn)錄酶混合液,42℃,60 min,95℃熱失活3 min,向前述反應(yīng)產(chǎn)物中加入8 μ1連接酶緩沖液,2 μ1連接酶混合液,24℃,30 min,95℃熱失活5 min,加入29 μ1,REpL1-g sc反應(yīng)緩沖液,1 μ1 REpL1-g Sensi Phi DNA聚合酶,30℃,,2 h,65℃,熱失活5 min,全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增。

      1.7Ion Torrent測(cè)序 將樣本分別加入1.8倍體積AMPure XP Beads進(jìn)行純化;定量后分別取100 ng純化的三種樣本核酸酶切純化產(chǎn)物;應(yīng)用加接頭試劑盒,末端補(bǔ)平兩端加接頭,加入 1.8倍體積AMPure XP Beads純化;運(yùn)行E-Ge1選擇回收片段(約350 bp),對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)定量。取5 pmo1的工作庫(kù)進(jìn)行油包水PCR,最后將帶有模板的微粒溶液離心使其進(jìn)入到318C芯片的微孔中,上機(jī)測(cè)序。

      1.8實(shí)驗(yàn)分組 按照對(duì)樣本處理的方式不同,分為A、B、C、D四組。其中樣本A:提核酸RNA后,不做任何處理;樣本B:提核酸RNA,探針純化,WTA,建庫(kù),上機(jī)測(cè)序;樣本C:提核酸RNA,WTA,探針純化,建庫(kù),上機(jī)測(cè)序;樣本D:提核酸RNA,WTA,建庫(kù),上機(jī)測(cè)序。

      1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用分類樣本卡方檢驗(yàn)對(duì)樣本不同有效數(shù)據(jù)比例進(jìn)行比較。采用 IBM SPSS statistics 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異。

      2 結(jié)果

      2.1雜交探針 根據(jù)S、M、L三個(gè)片段的保守區(qū),設(shè)計(jì)病毒的純化探針。5'端生物素修飾。序列如下:S1:ACAATSATKWKCTTNGYATCCTTCNCCCA;M1:TGTGGWGGAG CDGCVTGYGGSTGYTTTAATG;M2:TTGYTACTCYTGCATBRCAGGGGCCAVAGTCW GC;L1:ATHTTYGTCMTWATCAAGCCSACYAM;L2:TTGGSATTTAYCCTCAGAGAARTCMACAG;L3:CA GGHACWSTGGGDGGMTTCAGCAAG。序列中出現(xiàn)兼并堿基,其中S表示G C,K表示G T,N表示A C G T,Y表示C T,D表示G A T,V表示G A C,W表示A T,H表示A T C,M表示A C。

      2.2熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

      分別以三個(gè)片段的RNA標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X),以Ct值的平均值為縱坐標(biāo)(Y),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。三個(gè)片段標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為S:y= -3.497x+39.797,R2=0.995;M:y=-3.498x+ 43.882,R2=0.998;L:y=-3.576x+49.539,R2= 0.998。相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上,具有很好的線性關(guān)系。

      2.3SFTSV樣本中三個(gè)片段質(zhì)量比例比較

      根據(jù)三個(gè)片段標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本測(cè)得的Ct值,計(jì)算得各樣本拷貝數(shù)。再由上述公式分別計(jì)算得樣本中SFTSV三個(gè)片段的濃度,進(jìn)而計(jì)算得三個(gè)片段的質(zhì)量比例(各片段濃度與總濃度比值),詳見(jiàn)表1。WTA前,純化樣本B相較于未純化樣本A,SFTSV三個(gè)片段質(zhì)量比例的比值分別為0.1、0.6、0.3;WTA前,純化樣本C相較于未純化樣本D,SFTSV三個(gè)片段質(zhì)量比例的比值分別為2.0、3.6、2.3;WTA后純化樣本C相較于WTA前純化樣本B,SFTSV三個(gè)片段質(zhì)量比例的比值分別為74、18、46。上述結(jié)果提示對(duì)樣本進(jìn)行核酸純化處理能夠降低非目的核酸的含量,且WTA后再對(duì)其進(jìn)行純化,效果更好。

      2.4高通量測(cè)序結(jié)果

      核酸樣本經(jīng)過(guò)磁珠的純化處理后,所測(cè)得樣本序列reads數(shù)中,目的核酸序列所占有的有效reads數(shù)是不同的。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)卡方檢驗(yàn),三種處理間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表2。其中純化樣本B與樣本C所測(cè)得的有效數(shù)據(jù)比例均大于不經(jīng)過(guò)純化樣本D所測(cè)得的有效數(shù)據(jù)比例,說(shuō)明經(jīng)過(guò)純化后樣本中非目的核酸序列得到了棄除,樣本更純凈,背景含量更低。且樣本B與C進(jìn)行比較,測(cè)得的有效數(shù)據(jù)成分樣本C高于樣本B,提示在WTA后對(duì)樣本進(jìn)行探針純化,純化效果更好,約為樣本D有效數(shù)據(jù)比例的2.5倍。

      表1 WTA前后樣本間SFTSV三個(gè)片段質(zhì)量比例Tab.1 Mass proportion of SFTSV three fragments in the samp1es before and after WTA

      表2 三種不同處理間SFTSV有效成分比例比較Tab.2 Comparison of SFTSV effective component proportion in three different treatment groups

      3 討論

      臨床樣本除含有所研究目的核酸外,還含有人類細(xì)胞基因組,其他微生物核酸等,樣本含有的核酸種類繁多,各自含量不等,背景復(fù)雜。非特異PCR技術(shù)通過(guò)非特異的引物與模板DNA錯(cuò)配而進(jìn)行復(fù)制的技術(shù)的廣泛應(yīng)用,故病毒基因組擴(kuò)增的同時(shí),樣本中源自宿主細(xì)胞或其他微生物的DNA及RNA片段也得以大量擴(kuò)增,甚至占據(jù)擴(kuò)增優(yōu)勢(shì),這樣大大增加了序列結(jié)果中非目的基因數(shù)據(jù),浪費(fèi)檢測(cè)試劑成本,延長(zhǎng)數(shù)據(jù)分析時(shí)間,影響高通量測(cè)序效果。

      本研究以SFTSV培養(yǎng)上清為模擬標(biāo)本,應(yīng)用鏈霉親和素修飾磁珠與生物素修飾探針共價(jià)結(jié)合的原理純化核酸樣本,通過(guò)比較純化前后樣本目的核酸有效成分比例來(lái)評(píng)價(jià)背景值降低及純化富集效果。WTA前純化樣本B相較于非純化樣本A,SFTSV三個(gè)片段的有效成分比例的比值分別為0.1、0.6、0.3,均小于1,WTA后純化樣本C相較于非純化樣本D,SFTSV三個(gè)片段的質(zhì)量比例的比值分別為2.0、3.6、2.3,均大于1。WTA前對(duì)樣本進(jìn)行純化處理會(huì)使得樣本在一定程度去除非目的核酸的同時(shí),目的核酸損失量也較大,這對(duì)目的核酸含量本身不高的臨床樣本是不利的;而WTA后,SFTSV三個(gè)片段的質(zhì)量比例的比值均>1,提示W(wǎng)TA后對(duì)樣本核酸進(jìn)行純化處理,效果較好。在進(jìn)一步的二代測(cè)序結(jié)果中,驗(yàn)證了上述結(jié)果。二代測(cè)序結(jié)果得到WTA前純化樣本B,WTA后純化樣本C及不進(jìn)行純化樣本D三者測(cè)序結(jié)果有效數(shù)據(jù)比例分別為5.57%、6.39%、2.71%,也就說(shuō)明三種不同處理,對(duì)樣本核酸的純化即背景值降低效果有不同的影響。其中WTA后進(jìn)行的純化,背景值降低效果最好,有效數(shù)據(jù)比例最高,約為樣本C有效數(shù)據(jù)比例的2.5倍。二代測(cè)序中,因背景非目的核酸數(shù)據(jù)占據(jù)較高,成本較高[5],使其廣泛應(yīng)用得到限制。故可將上述基于磁性微球純化方法應(yīng)用于建庫(kù)處理中,降低測(cè)序的時(shí)間及資金成本。同時(shí)特異性純化富集目的核酸樣本,可減少背景值即減少無(wú)效數(shù)據(jù)的含量,提高有效數(shù)據(jù)比例,進(jìn)而提高檢測(cè)效率。

      本研究中所用的探針為兼并探針,一種探針就可用來(lái)富集純化多種病毒,可減少探針間相互雜交干擾。然而這種特異性富集的方法也存在新病毒或變異較大的病毒難以被探針捕捉而被遺漏的缺陷。因此開(kāi)展已知病原體篩查檢測(cè)時(shí)需增加探針池的容量與多樣性,同時(shí)要嚴(yán)格設(shè)計(jì)探針,避免各屬間純化探針相互干擾等現(xiàn)象。對(duì)臨床血清樣本及屬內(nèi)其他病毒進(jìn)行檢測(cè)可以驗(yàn)證該方法的實(shí)用性。

      [1] Rothberg J M,Leamon J H.The deve1opment and impact of 454 sequencing.NatBiotechno1,2008,26:1117-1124,doi:10.1038/nbt1485.

      [2] Dean F B,Ne1son J R,Gies1er T L,et a1.Rapid amp1ification of p1asmid and phage DNA using Phi 29 DNA po1ymerase and mu1tip1y-primed ro11ing circ1e amp1ification.Genome Res,2001,11:1095-1099.

      [3] Detter J C,Jett J M,Lucas S M,et a1.Isotherma1 stranddisp1acementamp1ificationapp1icationsforhigh-throughput genomics.Genomics,2002,80:691-698.

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      [5] Bea1e S,Sanderson D,Sanniti A,et a1.A scoping study to exp1ore thecost-effectivenessofnext-generationsequencing compared with traditiona1 genetic testing for the diagnosis of 1earning disabi1ities in chi1dren.Hea1th Techno1 Assess,2015,19:1-90,doi:10.3310/hta19460.

      Preliminary study of specific purification and enrichment method for viral genome based on nucleic
      acid hybridization

      Wang Lijing,Liu Lin,Li Jiandong,Li Weihong,Zhang Shou,Liang Mifang,
      Li DexinNational Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China

      orresponding author:Li Dexin,Email:lidx@chinacdc.cn

      Objective To exp1ore the specific purification and enrichment method for the vira1 genome in c1inica1 samp1es before high-throughput detection.Methods The negative chain RNA virus fever with thrombocytopenia syndrome(SFTSV)as was taken the simu1ate samp1es and the hybridization probes of the segment S,M and L were desiqned respective1y,modified the probes with biotin in 5'ends to cova1ent bonded with streptavidin magnetic beads to purify the vira1 genome and compared the inf1uence of specific purification on the effect of high-throughput detection.Results Specific enrichment and purification for vira1 genome before sequencing can significant1y increase the proportion of va1id data and who1e genome coverage.The va1id data proportions of the groups purified before or after who1e transcriptome amp1ification (WTA)were improved significant1y compared to group without purifying.The va1id data proportion respective1y were 5.57%,6.39%,2.71%,and the difference was significant((χ2=9799.8,P<0.001)). And the effect of the group purified after who1e transcriptome amp1ification was better than group purified before who1e transcriptome amp1ification(P<0.001).Conclusions Vira1 genome specific enrichment and purification method based on nuc1eic acid hybridization can effective1y reduce the background va1ues in the second generation sequencing,improve the sequencing efficiency and p1ay the ro1e of purification and enriching the nuc1eic acid in samp1es specifica11y before high-throughput detection.

      Vira1 genome;Enrichment;Purification;Next-Generation sequencing

      傳染病防治科技重大專項(xiàng):重大傳染病應(yīng)急處置檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)(2013ZX10004-101)

      李德新,Emai1:1idx@chinacdc.cn

      10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.025C

      2016-02-24)

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