偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立及應(yīng)用

周杰英 林應(yīng)標(biāo) 曹友德 段招軍

423000郴州，湖南省郴州市第一人民醫(yī)院（周杰英，林應(yīng)標(biāo)）；410005長(zhǎng)沙，湖南省人民醫(yī)院（曹友德）；100050北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（段招軍）

偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立及應(yīng)用

周杰英 林應(yīng)標(biāo) 曹友德 段招軍

423000郴州，湖南省郴州市第一人民醫(yī)院（周杰英，林應(yīng)標(biāo)）；410005長(zhǎng)沙，湖南省人民醫(yī)院（曹友德）；100050北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（段招軍）

目的 建立偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），并檢測(cè)臨床樣本，了解偏肺病毒感染患兒的臨床流行病學(xué)特點(diǎn)。方法 針對(duì)保守基因F合成引物和探針，制備偏肺病毒轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)線性范圍、最低檢測(cè)限、重復(fù)性、靈敏度和特異性。對(duì)采集自2010年12月至2011年11月蘭州地區(qū)急性呼吸道疾病患兒的222份下呼吸道臨床標(biāo)本進(jìn)行偏肺病毒篩查，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行常見呼吸道病毒的共感染篩查，并對(duì)偏肺病毒進(jìn)行相關(guān)流行病學(xué)分析。結(jié)果 方法線性檢測(cè)范圍是10-108拷貝/μ1，最低檢測(cè)限是10拷貝/μ1，曲線相關(guān)系數(shù)是1，擴(kuò)增效率是91.62%，Ct值組內(nèi)CV值小于2%。以傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果為參照，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性和特異性分別是100%和96.17%。偏肺病毒檢出22例（9.46%），其中男童13例（5.86%），女童8例（3.60%）。春、夏、秋、冬的檢出率分別是15.71%、0%、5.08%、11.11%。偏肺病毒載量與混合感染、疾病種類、臨床癥狀差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 該方法是檢測(cè)偏肺病毒靈敏度、特異性和重復(fù)性均較好的方法；偏肺病毒在蘭州地區(qū)兒童呼吸道感染中占有重要地位，長(zhǎng)期系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

【主題詞】 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR；偏肺病毒

人偏肺病毒（HMPV），2001年由荷蘭學(xué)者Vanden Hoogen等［1］首次從兒童呼吸道感染標(biāo)本中分離，對(duì)所有年齡階段的個(gè)體均易感，能夠引起發(fā)燒、咳嗽、喘息、氣促、氣喘和寒顫［2］等癥狀，尤其在幼兒、老年人、免疫功能缺陷和器官移植患者中可以引起嚴(yán)重的呼吸道感染性疾病。人偏肺病毒屬于副粘病毒科肺病毒亞科偏肺病毒屬，是具有包膜包裹的RNA病毒，病毒基因組長(zhǎng)13kb，包含有9個(gè)開放閱讀框架和8個(gè)基因，編碼9個(gè)蛋白質(zhì)，分別為：P

蛋白，N蛋白，M蛋白，F(xiàn)蛋白，G蛋白，L蛋白，M2-1，M2-2，SH蛋白［3，4］。近些年來(lái)，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光

PCR已經(jīng)成功運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室偏肺病毒檢測(cè)中，顯著提高了偏肺病毒的檢測(cè)效率。本研究以蘭州12歲以下急性呼吸道感染住院患兒為研究對(duì)象，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)偏肺病毒并進(jìn)行相關(guān)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，這對(duì)偏肺病毒的檢測(cè)和控制具有科研和監(jiān)測(cè)的雙重意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 樣本來(lái)自2010年12月至2011年11月甘肅蘭州某醫(yī)院222份急性呼吸道疾病患兒的下呼吸道臨床標(biāo)本。患者年齡從1天至12歲，男性133例，女性89例。臨床診斷包括：急性支氣管肺炎98例，急性喘息性支氣管肺炎85例，急性上呼吸道感染9例，新生兒肺炎9例，大葉性肺炎7例，哮喘3例，急性化膿性扁桃體炎2例，遷徙行支氣管炎2例，支氣管哮喘2例，急性皰疹性咽峽炎2例，遷延性支氣管炎1例，多臟器功能竭1例，重癥肺炎1例。

1.2試劑及儀器 偏肺病毒陽(yáng)性標(biāo)本由中國(guó)疾病控制中心惠贈(zèng)；DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于日本TaKaRa公司，T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；體外轉(zhuǎn)錄和RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)App1ied Biosystems公司；PCR產(chǎn)物純化、質(zhì)粒提取及核酸雙提試劑盒購(gòu)自德國(guó) Qiagen公司。美國(guó) App1ied Biosystems公司的Stepone p1us擴(kuò)增儀。

1.3引物和探針 引物及探針序列：HMPVF：CAA GTG TGA CAT TGC TGA YCT RAA；HMPVR：ACT GCC GCA CAA CAT TTA GRA A；HMPVPb：TGG CYG TYA GCT TCA GTC AAT TCA ACA GA［2］，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)78 bp，位于人偏肺病毒F基因段。

1.4偏肺病毒反應(yīng)體系及條件 反應(yīng)體系：10 μ1緩沖液，0.8 μ1酶混合液，3.6 μ1水，引物各（20 μmo1/L）0.4 μ1，探針（10 μmo1/L）0.4 μ1，模板4.4 μ1。50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃ 變性15 s和60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)并采集熒光信號(hào)。

1.5體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 將提取的偏肺病毒核酸RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化，其純化產(chǎn)物與含有T7啟動(dòng)子的pGEM-T載體4℃孵育18 h進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物與感受態(tài)大腸埃希菌DH5α轉(zhuǎn)化構(gòu)建質(zhì)粒，將轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌DH5α涂布于含有Amp/IPTG/X-ga1的LB培養(yǎng)平板上，37℃孵育12 h，挑取陽(yáng)性克隆增菌、抽提質(zhì)粒及測(cè)序，37℃孵育2 h進(jìn)行酶切（PUVⅡ酶）獲得相應(yīng)的DNA片段，體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化使用Mega Sript T7 invitro transription及Mega C1ear kit試劑盒，純化后的RNA使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定吸光度值，純度A260/A280比值在1.8-2.0間符合要求的RNA作為偏肺病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6臨床評(píng)價(jià)和流行病學(xué)分析 傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果證實(shí)為目的基因的即為陽(yáng)性，否則為陰性，以此為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果進(jìn)行靈敏度和特異度分析。結(jié)合病例資料對(duì)偏肺病毒的流行病學(xué)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。

2 結(jié)果

2.1熒光RT-PCR靈敏度分析 將偏肺病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍稀釋，在病毒載量10～108拷貝/μ1內(nèi)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線相關(guān)系數(shù)是1，擴(kuò)增效率是91.62%，說(shuō)明本方法在10 ～108拷貝/μ1濃度范圍內(nèi)有很好的線性相關(guān)性。偏肺病毒線性范圍檢測(cè)下限是10拷貝/μ1。更低的濃度（10-1拷貝/μ1）能夠被檢測(cè)到，但并不是所有的重復(fù)（6次）都能夠被檢測(cè)到，所以不能認(rèn)為10-1拷貝/μ1是最低的檢測(cè)限［4］。

2.2熒光RT-PCR特異性分析 建立的偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量方法與鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、博卡病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型、偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型、甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠狀病毒（NL63，HKU1，OC43，229E）陽(yáng)性核酸均無(wú)特異性擴(kuò)增曲線，說(shuō)明了偏肺病毒與這些病毒無(wú)交叉反應(yīng)，證明了偏肺病毒的引物和探針具有較高的特異性。

2.3熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線的重復(fù)性 選擇104-108拷貝/μ1 5個(gè)濃度梯度做6個(gè)重復(fù)，計(jì)算變異系數(shù)。偏肺病毒Ct值的變異系數(shù)均小于2%，說(shuō)明相同濃度的Ct值離散程度小，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

2.4偏肺病毒熒光RT-PCR臨床評(píng)估分析 傳統(tǒng)PCR測(cè)得的13份偏肺病毒陽(yáng)性標(biāo)本和209份陰性標(biāo)本，偏肺病毒熒光RT-PCR將13份陽(yáng)性標(biāo)本全部檢出，并從209份陰性標(biāo)本檢出8份，說(shuō)明兩種方法有較好的符合率，且RT-PCR方法的靈敏度比傳統(tǒng)PCR高。傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果證實(shí)為目的基因的即為陽(yáng)性，否則為陰性，以此為判斷標(biāo)準(zhǔn)，偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性和特異性分別是100%和96.17%。說(shuō)明偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有較好的靈敏度和特異性。

2.5偏肺病毒流行病學(xué)分析 在222份急性呼吸道疾病患兒的下呼吸道臨床標(biāo)本共檢出偏肺病毒感染的小兒呼吸道患者21例，其中男童 13例（5.86%），女童8例（3.60%），總檢出率為9.46%。男女童偏肺病毒檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.32，P＞0.05）。偏肺病毒陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行其他呼吸道病毒的篩查，合并感染呼吸道合胞病毒（7例）、副流感Ⅲ病毒（5例）、腺病毒（4例）、副流感病毒（3例）、乙型流感病毒（1例）、博卡病毒（1例）。可見，偏肺病毒感染的小兒呼吸道患者中合并感染位于前三位的分別是呼吸道合胞病毒、副流感病毒和腺病毒。春、夏、秋、冬的檢出率分別是 15.71%（11/ 70）、0%（0/32）、5.08%（3/59）、11.11%（7/63），偏肺病毒檢出的季節(jié)分布結(jié)果見圖1。將春夏秋冬四季偏肺病毒陽(yáng)性率進(jìn)行多組率和兩組間率的比較，春、秋、冬三季偏肺病毒陽(yáng)性率高于夏季陽(yáng)性率。蘭州地區(qū)急性呼吸道疾病患兒感染偏肺病毒多發(fā)生在春、冬兩季，其次為秋季。

21份陽(yáng)性標(biāo)本的 Ct均值是 24.71（15.52-32.24），所檢出的最大載量為1.5×106拷貝/μ1，最小載量為1.2×101拷貝/μ1，平均載量為1.2×105拷貝/μ1。從混合感染的角度分析，偏肺病毒RNA載量在102拷貝/μ1及以上和以下的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從疾病種類（上呼吸道疾病、支氣管炎、喘息性支氣管炎、肺炎）分析，偏肺病毒RNA載量在102拷貝/μ1及以上和以下的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從臨床癥狀（發(fā)熱、喘息、氣促、氣喘）分析，偏肺病毒RNA載量在102拷貝/μ1及以上和以下的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

偏肺病毒引起的臨床癥狀和隸屬肺病毒屬的呼吸道合胞病毒相似，可以引起上呼吸道感染性疾病、嚴(yán)重者可導(dǎo)致肺炎［1］、毛細(xì)支氣管炎及喘息性肺炎。偏肺病毒與肺部疾病及慢性阻塞性肺炎有相關(guān)性，在病毒感染的3～5 d可以引起間質(zhì)性肺炎或者肺泡炎，2～3周后會(huì)引起細(xì)支氣管炎［5］。本研究在21例偏肺病毒感染患兒中，有9例患兒診斷為喘息性支氣管炎，提示偏肺病毒可能是引起兒童急性喘息的病原體之一。偏肺病毒感染主要發(fā)生在春冬季［6，7］，與本研究的偏肺病毒感染主要發(fā)生在春、冬季一致。男女童偏肺病毒檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蘭州地區(qū)2010年12月至2011年11月偏肺病毒檢出率（9.46%）稍低于蘭州2011年 12月至2012年11月檢出率（12.14%）［8］（均采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)），但高于傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)蘭州地區(qū)2006-2009年偏肺病毒檢出率（0.4%-7.1%）［9-11］，檢出率的高低可能與檢測(cè)方法的靈敏度有關(guān)。在合并感染的分析中，發(fā)現(xiàn)合并腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的情況較多，這與以前的研究相一致，進(jìn)一步說(shuō)明了腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒是引起兒童呼吸道疾病的常見病毒。另外，本研究進(jìn)行了疾病病毒載量和感染疾病種類和臨床特征的相關(guān)性研究，偏肺病毒載量和混合感染、疾病種類、臨床癥狀差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有限，所以需要更多的研究來(lái)探討病毒載量和病情嚴(yán)重關(guān)系。偏肺病毒的檢測(cè)和控制具有科研和監(jiān)測(cè)的雙重意義，目前HMPV感染臨床的快速診斷以及相關(guān)的血清學(xué)研究還非常欠缺。鑒于HMPV在下呼吸道感染占有重要的地位，需加強(qiáng)對(duì)該病毒的系統(tǒng)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。

圖1　偏肺病毒檢出季節(jié)分布Fig.1 Month1y distribution of Metapneumovirus infection

與傳統(tǒng)PCR方法相比較，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有能夠定量，檢測(cè)線性范圍寬、靈敏度高、特異性高、重復(fù)性好及快速簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。盡管實(shí)時(shí)熒光PCR獲得的陽(yáng)性結(jié)果和現(xiàn)有知識(shí)并不完全一致，但是這種敏感的方法至少讓我們獲得了更多的經(jīng)驗(yàn)，我們有可能發(fā)現(xiàn)新病原或者以前沒有發(fā)現(xiàn)的病原［11］。本研究探針標(biāo)記選擇FAM/BHQ標(biāo)記，BHQ作為淬滅基團(tuán)具有無(wú)本底熒光的特點(diǎn)，與本身發(fā)光的TAMRA淬滅基團(tuán)相比，BHQ具有提高檢測(cè)靈敏性的優(yōu)勢(shì)。

本研究成功建立和估以偏肺病毒為模板的RTPCR定量方法，具有靈敏度高、特異性好及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)偏肺病毒快速有效的方法，HMPV在兒童下呼吸道感染中也占有重要的地位，因此逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量方法在臨床早期診斷和疾病的監(jiān)測(cè)、預(yù)防領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。

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Establishment and application of Real-time quantitative PCR for human Metapneumovirus detection

Zhou Jieying，Lin Yingbiao，Cao Youde，Duan Zhaojun The First People's Hospital of Chenzhou，Chenzhou 423000，China（Zhou JY，Lin YB）；Hunan Provincial People′s Hospital，Changsha 410005，China（Cao YD）；National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China（Duan ZJ）.

Cao Youde，Email：youde120@aliyun.com；Duan Zhaojun，Email：zhaojund@ 126.com

Objective To estab1ish and eva1uate a Metapneumovirus rea1-time quantitative reverse transcription po1ymerase chain reaction（RT-PCR），detect c1inica1 specimens and exp1ore the c1inica1 preva1ence characteristics of Metapneumovirus-infected chi1dren.Methods The primers and probes which targeted the conserved genes F were designed，RNA standards were prepared to estab1ish a standard curve，the sensitivity，specificity and reproducibi1ity had been tested.222 1ower respiratory c1inica1 specimens were co11ected from chi1dren in Lanzhou area with ARI.Metapneumovirus and co-infection viruses were detected simu1taneous1y；further Metapneumovirus re1ated epidemio1ogy was studied.Results Metapneumovirus 1inear detection range was 10-108copies/μ1，the 1owest detection 1imit was 10 copies/μ1，the corre1ation coefficient was 1，the amp1ification efficiency was 91.62%，the CV of Ct va1ue was 1ess than 2%.Take conventiona1 PCR product sequence resu1ts as reference，rea1-time quantitative RT-PCR sensitivity and specificity were 100%and 96.17%.Metapneumovirus detection rate were 9.46%，13 cases for boys （5.86%），8 case for gir1s（3.60%）.The detection rate of spring，summer，autumn and winter were 15.71%，0%，5.08%，11.11%.There were no significant differences between the Metapneumovirus vira1 1oad and mixed infection or the types of disease，c1inica1 symptoms.Conclusions Metapneumovirus rea1-time quantitative RT-PCR has been confirmed as a sensitive and specific method.Metapneumovirus was an important agent of chi1dren respiratory tract infection in Lanzhou region.We shou1d take the 1ong-termsystematic survei11ance serious1y.

Rea1-time quantitative reverse transcription PCR；Metapneumovirus

曹友德，Emai1：youde120@a1iyun.com；段招軍，Emai1：zhaojund@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.026

2015-12-18）