中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和膿毒癥患兒人副腸孤病毒和非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒感染的特征

吳迪 宋秦偉 張又 錢淵 丁雅馨 趙林清 鄧潔 王芳 孫宇 朱汝南

100020北京，首都兒科研究所病毒研究室兒童病毒病病原學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和膿毒癥患兒人副腸孤病毒和非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒感染的特征

吳迪 宋秦偉 張又 錢淵 丁雅馨 趙林清 鄧潔 王芳 孫宇 朱汝南

100020北京，首都兒科研究所病毒研究室兒童病毒病病原學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 通過(guò)檢測(cè)患兒腦脊液和血清標(biāo)本中的HPeV和NPEV，結(jié)合臨床探討其在兒童中的感染特征。方法 收集2014年1月至12月首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院來(lái)自600例16歲以下懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染或膿毒癥患兒的腦脊液標(biāo)本543份和血清標(biāo)本173份，其中116例患兒同時(shí)收集到腦脊液和血清標(biāo)本。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR和巢式RT-PCR的方法對(duì)HPeV和NPEV進(jìn)行篩查及分型。結(jié)果 在最終診斷為CNS感染的136例患兒中，HPeV陽(yáng)性率為1.5%，NPEV陽(yáng)性率為16.9%；診斷為膿毒癥的51例患兒中，HPeV陽(yáng)性率為5.9%，NPEV陽(yáng)性率為3.9%；其他診斷的413例患兒中，HPeV陽(yáng)性率為3.4%，NPEV陽(yáng)性率為2.9%。HPeV感染患兒以0月～＜3月年齡組最多，而NPEV則以3歲～＜7歲組最多。NPEV感染的高峰為7月～9月，而HPeV感染的高峰為11月和12月。結(jié)論 HPeV感染患兒年齡低于NPEV感染患兒，HPeV和NPEV可在兒童中引起膿毒癥或CNS感染等嚴(yán)重疾病。

【主題詞】 人副腸孤病毒；非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒；中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；膿毒癥；兒童

Fund programs：Beijing Municipa1 Hea1th Bureau“Advanced Personne1 Training Program”（2013-3-087）；Beijing Municipa1 Science&Techno1ogy Commission（Z111107056811041）

人副腸孤病毒（Human parechovirus，HPeV）和腸道病毒（enteroviruses，EV）同屬小RNA病毒科。血清學(xué)研究表明，1歲以內(nèi)的兒童體內(nèi)抗HPeV抗體陽(yáng)性率最低［1］，因此低齡兒童成為HPeV感染的主要對(duì)象。HPeV感染后主要引起胃腸道和呼吸道癥狀，但也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centra1 nervous system，CNS）感染［2］以及膿毒癥等較嚴(yán)重的疾?。?］。EV型別繁多，其感染同樣可引起諸如腦炎、腦膜炎、偏癱、心肌炎、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病和出疹性疾病等。鼻病毒雖被劃分為EV屬范疇，但是其主要造成呼吸系統(tǒng)感染［4］；脊髓灰質(zhì)炎病毒雖屬于EV屬，但在全球范圍內(nèi)已被基本根除［5］，因此本研究只對(duì)非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒（non-po1io enteroviruses，NPEV）進(jìn)行分析。

HPeV與NPEV雖在兒童中廣泛流行，其感染常被臨床所忽略。因此，本研究通過(guò)對(duì)首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院（北京）就診的懷疑病毒所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染或膿毒癥患兒的腦脊液和血液標(biāo)本進(jìn)行HPeV和NPEV篩查，以了解HPeV和NPEV在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和膿毒癥中的作用，并分析其感染特征，以期為臨床的診治及預(yù)防監(jiān)控提供依據(jù)。

1 方法與材料

1.1標(biāo)本及臨床資料的來(lái)源 收集2014年1月1日至2014年12月31日，在首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院就診且懷疑為病毒感染引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染或膿毒癥患兒，并送至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單純皰疹病毒（herpes simp1ex virus，HSV）常規(guī)篩查的腦脊液標(biāo)本和/或血清標(biāo)本，對(duì)HSV檢測(cè)為陰性的標(biāo)本進(jìn)行HPeV和NPEV病毒的平行篩查。共收集到來(lái)自600例患兒的543份腦脊液標(biāo)本和173例份血清標(biāo)本。其中，136例患兒最終診斷為CNS感染，51例患兒診斷為膿毒癥，413例患兒診斷為其他疾病。136例CNS感染患兒中有128例采集到腦脊液標(biāo)本，43例采集到血清標(biāo)本，其中35例同時(shí)采集到腦脊液和血清標(biāo)本。51例膿毒癥患兒中有42例采集到腦脊液標(biāo)本，19例采集到血清標(biāo)本，其中10例同時(shí)采集到腦脊液和血清標(biāo)本。其他診斷的413例患兒中，373例采集到腦脊液標(biāo)本，111例采集到血清標(biāo)本，其中71例同時(shí)采集到腦脊液和血清標(biāo)本。所有標(biāo)本均保存于-40℃。臨床資料通過(guò)查閱住院患兒的病例獲得。本研究項(xiàng)目通過(guò)了首都兒科研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2核酸提取及cDNA合成 腦脊液及血清無(wú)特殊處理，使用QIAamp Vira1 RNA Mini Kit（Qiagen公司，德國(guó)）提取核酸。核酸保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂秒S機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20℃。

1.3HPeV篩查及分型 采用針對(duì)HPeV 5'非編碼區(qū)中基因保守區(qū)域的引物對(duì)腦脊液和血清標(biāo)本進(jìn)行篩查，并采用基于基因變異顯著的衣殼蛋白基因（VP）3和1交界區(qū)的引物對(duì)篩查為陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行分型［6］。將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4EV篩查及分型 采用本實(shí)驗(yàn)室參考文獻(xiàn)所設(shè)計(jì)的引物［7］和針對(duì)EV5'非編碼區(qū)中基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物，對(duì)腦脊液和血清標(biāo)本進(jìn)行 EV的篩查。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 測(cè)序得到的序列在GenBank中進(jìn)行B1ast序列比對(duì)。采用SPSS20.0對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料組間比較。

以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HPeV和NPEV的檢測(cè)結(jié)果 從不同類型標(biāo)本中HPeV和NPEV的篩查結(jié)果分析，543份腦脊液標(biāo)本僅檢測(cè)出1份HPeV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0.2%，未能收集到該患兒血清標(biāo)本；32份NPEV陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為5.9%，其中10例患兒收集到血清標(biāo)本，但NPEV結(jié)果為陰性。在173份血清標(biāo)本中共檢測(cè)出18份HPeV陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為10.4%，其中10例收集到腦脊液標(biāo)本，但 HPeV均為陰性；5例NPEV陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為2.9%，其中4例患兒收集到腦脊液標(biāo)本，但NPEV均為陰性。經(jīng)對(duì)HPeV 和NPEV篩查為陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行分型PCR擴(kuò)增、測(cè)序和序列比對(duì)，進(jìn)行進(jìn)一步分型，結(jié)果見表1。

2.2不同臨床診斷病例中HPeV和NPEV的檢測(cè)

結(jié)果 在最終診斷為CNS感染的136例患兒中，有2例為HPeV陽(yáng)性，占1.5%；23例為NPEV陽(yáng)性，占16.9%。在診斷為膿毒癥的51例患兒中，3例為HPeV陽(yáng)性，占5.9%；2例為NPEV陽(yáng)性，占3.9%。其他診斷的413例患兒中，14例為HPeV陽(yáng)性，占3.4%；12例為NPEV陽(yáng)性，占2.9%。HPeV主要檢出于血清標(biāo)本，而NPEV則主要檢出于腦脊液標(biāo)本。

2.3HPeV和NPEV感染患兒的年齡和季節(jié)分布

在年齡分布上，NPEV陽(yáng)性的患兒相對(duì)年長(zhǎng)于HPeV陽(yáng)性的患兒（P＜0.001）。HPeV陽(yáng)性患兒以0～＜3個(gè)月組，占63.2%（12/19）；而NPEV陽(yáng)性患兒則以3～＜7歲年齡組最多，占48.6%（18/37）。全年均可檢出NPEV，主要集中在7-9月，而HPeV的檢出主要集中在11月和12月。

表1　HPeV和NPEV陽(yáng)性標(biāo)本分型及病例診斷Tab.1 Types and diagnosis of human parechovirus（HPeV）and non-po1io enteroviruses（NPEV）

2.4HPeV和NPEV患兒的臨床特征及影像學(xué)改變 通過(guò)對(duì)HPeV或NPEV陽(yáng)性患兒病歷資料的查閱，綜合分析感染HPeV和NPEV患兒的臨床表現(xiàn)特征、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)以及影像學(xué)資料（表2）。結(jié)果顯示，HPeV和NPEV感染后常見癥狀為發(fā)熱，部分患兒可出現(xiàn)抽搐和頸抵抗等神經(jīng)系統(tǒng)陽(yáng)性癥狀。腦脊液的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示，NPEV感染后患兒的腦脊液白細(xì)胞數(shù)高于HPeV感染后患兒（P =0.006），但腦脊液生化改變無(wú)顯著差異。9例HPeV陽(yáng)性患兒進(jìn)行了神經(jīng)影像學(xué)檢查（CT/MRI），其中5例出現(xiàn)病理性改變。30例NPEV陽(yáng)性患兒進(jìn)行了神經(jīng)影像學(xué)檢查，其中10例出現(xiàn)了病理性改變。

3 討論

NPEV和HPeV在全球范圍內(nèi)廣泛流行［8，9］，但目前我國(guó)對(duì)于HPeV的研究仍然十分有限，因此對(duì)HPeV和NPEV的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)是十分必要的。

表2　HPeV和NPEV患兒的臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)改變Tab.2 C1inica1 characteristics，imaging and 1aboratory profi1es of human parechovirus infection（HPeV）andnon-po1io enteroviruses（NPEV）

本研究對(duì)2014年本研究室所收集的懷疑CNS感染或膿毒癥患兒的543份腦脊液標(biāo)本和173份血清標(biāo)本進(jìn)行了HPeV以及NPEV的篩查與分型，并結(jié)合臨床特征進(jìn)行了綜合分析。本研究中NPEV感染患兒的年齡大于HPeV感染患兒，且感染患兒的年齡范圍更廣泛，與Han等人［10］的研究結(jié)果顯示一致。國(guó)內(nèi)外大部分的研究顯示［11］，NPEV感染主要在夏秋季節(jié)高發(fā)，HPeV-1高發(fā)于秋冬季節(jié)，HPeV-3型高發(fā)于夏季。在本研究中NPEV感染主要在7-9月，與其他研究結(jié)果相一致。而本研究中成功分型的HPeV-1和未能成功分型的HPeV在11月和12月檢出最多。本研究HPeV分型成功率較低，可能是病毒載量過(guò)低、分型方法本身的局限性所造成，但也不排除是病毒突變或新型別的產(chǎn)生所造成。

在病毒性CNS感染中NPEV是最常見的病原體，而CV-B5、E-6、E9、E30為最常見的型別［12］。本研究中NPEV在CNS感染患兒中陽(yáng)性率最高，其中以CV-B5和E-6所占比例最高，進(jìn)一步證實(shí)B組NPEV與 CNS感染關(guān)聯(lián)緊密；在膿毒癥患兒中，HPeV陽(yáng)性率高于NPEV，這與文獻(xiàn)報(bào)道HPeV是膿毒癥患兒中最為常見的病毒病原一致。HPeV主要檢出于血清標(biāo)本，而NPEV則主要檢出于腦脊液標(biāo)本，因此，同時(shí)對(duì)腦脊液和血清進(jìn)行HPeV和NPEV的檢測(cè)有利于提高病原的檢出率，也提示NPEV更容易侵入CNS而造成CNS感染，而HPeV感染后所造成的疾病譜較廣。

發(fā)熱是感染NPEV和HPeV后的最常見癥狀，除此以外神經(jīng)系統(tǒng)癥狀如抽搐、頸抵抗、巴氏征、布氏征也可出現(xiàn)。在Harva1a等的研究中［13］，絕大多數(shù)感染NPEV或HPeV的患兒未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)改變，而在本研究中約三分之一感染NPEV和/或HPeV患兒經(jīng)神經(jīng)影像學(xué)檢查出現(xiàn)了神經(jīng)系統(tǒng)感染性改變。在本研究中有部分HPeV或NPEV陽(yáng)性的患兒出院診斷為頭痛和抽搐，這些患兒雖未診斷為CNS感染，但隨著病程的發(fā)展，也并不能排除最終造成CNS感染的可能性。

目前，HPeV和NPEV的感染尚未在臨床引起足夠重視，且新生兒以及兒童的CNS感染缺乏特異性，易造成漏診。因此，在臨床醫(yī)療中應(yīng)對(duì)HPeV和NPEV感染引起足夠的重視，及時(shí)對(duì)懷疑CNS感染或膿毒癥患兒的腦脊液和/或血清標(biāo)本進(jìn)行HPeV 和NPEV篩查，盡早確定病原，以便及時(shí)采取有效的治療措施。

［1］ Westerhuis B，Ko1ehmainen P，Benschop K，et a1.Human parechovirus seropreva1ence in Fin1and and the Nether1ands.J C1in Viro1，2013，58：211-5.doi：10.1016/j.jcv.2013. 06.036.

［2］ 李愛云，陳宗波，劉慶新，等.無(wú)菌性腦膜炎和腦炎病人腦脊液腸道病毒RNA的檢測(cè)及其臨床意義.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2001，15：371-373.doi：10.3760/cma.j.issn. 1003-9279.2001.04.021.

［3］ 羅雷，朱汝南，趙林清，等.人副腸孤病毒與兒童膿毒癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的相關(guān)性.中華兒科學(xué)雜志，2014，52：444-448.doi：10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2014.06.010.

［4］ Bruning AH，Thomas XV，van der Linden L，et a1.C1inica1，viro1ogica1andepidemio1ogica1characteristicsofrhinovirus infections in ear1y chi1dhood：A comparison between nonhospita1ised and hospita1ised chi1dren.J C1in Viro1，2015，73：120-126.doi：10.1016/j.jcv.2015.10.024.

［5］ Previsani N，Tangermann RH，Ta11is G，et a1.Wor1d Hea1th Organization Guide1ines for Containment of Po1iovirus Fo11owing Type-Specific Po1io Eradication-Wor1dwide，2015.MMWR Morb Morta1 Wk1y Rep，2015，64：913-7.

［6］ Harva1a H，Robertson I，McWi11iam LEC，et a1.Epidemio1ogy and c1inica1associationsofhumanparechovirusrespiratory infections.J C1in Microbio1，2008，46：3446-53.doi：10.1128/ JCM.01207-08.

［7］ 朱汝南，錢淵，鄧潔，等.北京市兒童手足口病與腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型感染有關(guān).中華流行病學(xué)雜志，2007，28：1004-1008.doi：10.3760/j.issn：0254-6450. 2007.10.017.

［8］ 張棟梁，章青，李丹地，等.腹瀉住院患兒中檢測(cè)到人雙?？刹《?中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2009，23：112-114. doi：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.02.112.

［9］ van der Sanden SM，Koopmans MP，van der Avoort HG. Detection of human enteroviruses and parechoviruses as part of the nationa1 enterovirus survei11ance in the Nether1ands，1996-2011.Eur J C1in Microbio1 Infect Dis，2013，32：1525-31.doi：10.1007/s10096-013-1906-9.

［10］ Han TH，Chung JY，You SJ，et a1.Human parechovirus-3 infection in chi1dren，South Korea.J C1in Viro1，2013，58：194-9.doi：10.1016/j.jcv.2013.05.023.

［11］ 羅雷，朱汝南.人副腸孤病毒的研究進(jìn)展.中國(guó)病毒病雜志，2013，3：310-316.

［12］ Biauku1a VL，Tikoduadua L，Azzopardi K，et a1.Meningitis in chi1dreninFiji：etio1ogy，epidemio1ogy，andneuro1ogica1 seque1ae.Int J Infect Dis，2012，16：e289-95.doi：10.1016/j. ijid.2011.12.013.

［13］ Harva1a H，Griffiths M，So1omon T，et a1.Distinct systemic and centra1 nervous system disease patterns inenterovirus and parechovirus infected chi1dren.J Infect，2014，69：69-74.doi：10.1016/j.jinf.2014.02.017.

Characteristics of human parechovirus and non-polio enteroviruses infections in children suspected central nervous system infections or sepsis in 2014 of Beijing

Wu Di，Song Qinwei，Zhang You，QianYuan，Ding Yaxin，Zhao Linqing，Deng Jie，Wang Fang，Sun Yu，Zhu Runan Laboratory of Virology，Capital Institute of Pediatrics，Beijing Key Laboratory of Etiology of Viral Diseases in Children，Beijing 100020，China

Zhu Runan，Email：runanzhu@163.com

Objective To better understand the characteristics of HPeV and NPEV infections by detecting HPeV and NPEV in cerebrospina1 f1uids（CSF）and b1ood samp1es.Methods A tota1 of 543 CSF and 173 b1ood samp1es were co11ected from 600 chi1dren younger than 16 years o1d who were suspected as vira1 CNS infection or sepsis from January to December in 2014 in Beijing，in which CSF and b1ood samp1es were co11ected simu1taneous1y from 116 chi1dren.Rea1-time RT-PCR and transcription-nested PCR（RT-nPCR）were performed to detect HPeV and NPEV.Results HPeV and NPEV were detected in 1.5%and 16.9%in 136 chi1dren diagnosed as CNS infectious diseases，5.9%and 3.9%in 51 chi1dren diagnosed as sepsis，and 3.4%and 2.9%in 413 chi1dren with other diagnosis.HPeVs were main1y detected in chi1dren under 3 months of age，whi1e NPEVs were frequent1y detected in chi1dren aged 3～＜7 years.The majority of NPEV infections occurred in the period from Ju1y to September，whi1e most of HPeV infections happened in November and December.Conclusions The data indicated that chi1dren with HPeV infections were younger than those with NPEV infections and that both HPeV and NPEV may cause CNS infections and sepsis in chi1dren.

Human parechovirus；Non-po1io enteroviruses；Centra1 nervous system infections；Sepsis；Chi1dren

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人員培養(yǎng)計(jì)劃（2013-3-078）；北京市科技計(jì)劃（Z111107056811041）

朱汝南，Emai1：runanzhu@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.011

2015-12-29）