LPS對(duì)體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
——對(duì)建立支架內(nèi)再狹窄炎癥細(xì)胞模型的探索

李紅梅，王顯

LPS對(duì)體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
——對(duì)建立支架內(nèi)再狹窄炎癥細(xì)胞模型的探索

李紅梅1，2，王顯1，2

目的 探索LPS作用不同時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）炎癥因子表達(dá)的影響，為支架置入術(shù)后再狹窄炎癥細(xì)胞活化模型的建立提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。方法 體外培養(yǎng)的HCASMC 3～5代，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用不同濃度（0.01，0.1，0.5，1.0，10）μg/ml的LPS作用不同時(shí)間（6 h，24 h，48 h），通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子白介素6 （IL-6）、白介素1β（IL-1β）以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)變化。結(jié)果 對(duì)照組只有少量的IL-1β分泌。加入不同濃度LPS刺激后，與對(duì)照組比較，干預(yù)6 h的各LPS濃度組IL-1β表達(dá)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。而干預(yù)24 h或48 h的各LPS濃度組與對(duì)照組相比IL-1β表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。對(duì)照組有少量IL-6分泌。加入不同濃度LPS刺激后，與對(duì)照組比較，0.5μg/ml濃度組LPS干預(yù)6 h、24 h、48 h均可顯著誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)增加，1 μg/ml濃度組則在24 h、48 h刺激條件下表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。對(duì)照組有少量TNF-α的分泌，加入LPS干預(yù)后，TNF-α的變化趨勢(shì)與IL-6相一致。結(jié)論 0.5μg/ml和1μg/ml濃度的LPS刺激24 h或48 h使HCASMC 的IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)增加，可作為構(gòu)建HCASMC炎癥活化模型的參考。

脂多糖；人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；炎癥因子；細(xì)胞模型

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病引發(fā)的急性心血管事件是嚴(yán)重危害人類生命健康的頭號(hào)殺手，經(jīng)導(dǎo)管支架置入術(shù)成為目前治療的有效途徑，其中藥物洗脫支架的出現(xiàn)更是成為介入史上跨時(shí)代的標(biāo)志。隨著研究逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)藥物洗脫支架在抑制平滑肌細(xì)胞增殖遷移的同時(shí)也延緩了內(nèi)皮化進(jìn)程，術(shù)后遺留的10%～20%再狹窄率以及延遲性支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)成為介入領(lǐng)域廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［1］。目前，支架內(nèi)再狹窄和支架血栓與炎癥因子之間的密切關(guān)系越來越受到關(guān)注，人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）增殖遷移導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生過程由HCASMC炎性激活啟動(dòng)，因此，建立HCASMC炎性活化模型對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的深入研究具有重要意義。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，也是Toll樣受體4 （toll 1ike receptors-4，TLR4）的特異性配體，二者結(jié)合后可將LPS信號(hào)由細(xì)胞外傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，通過一系列信號(hào)通路使NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子激活，繼而啟動(dòng)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和血管損傷［2-5］。本研究選用不同濃度LPS作用不同時(shí)間于體外培養(yǎng)的HCASMC，觀察不同條件下LPS對(duì)HCASMC上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6三種炎癥因子表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1主要材料

1.1.1主要試劑 HCASMC（貨號(hào)：FC-0031）、平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、胰酶抑制劑、凍存液均購自美國(guó)Lifeline公司；磷酸鹽緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)脂多糖1mg/ml（貨號(hào)：L6529），Sigma（L2880）；人 IL-6 ELISA試劑盒（貨號(hào)：SEA079Hu，96T），人IL-1β ELISA試劑盒（貨號(hào)：SEA563Hu，96T），人TNF-α ELISA試劑盒（貨號(hào)：SEA133Hu，96T），均購自武漢USCN公司。

1.1.2主要儀器 超凈工作臺(tái)CJT-E-Ⅱ（北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus CKX×41）、低速離心機(jī)LD4-2（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）、培養(yǎng)箱（MCO-20AIC，SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低溫冰箱（美國(guó)REVCO Legaci）、電熱恒溫水箱（HH.W21.420）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Clinicbio 128C）、十萬分之一精密電子分析天平（日本島津AEC-45SM）、漩渦混勻器（北京金北德工貿(mào)有限公司）。

1.2方法

1.2.1人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將保存于液氮罐中的細(xì)胞取出后立刻放到干冰上，將管子浸入37℃水浴中，待細(xì)胞懸液融化后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶并放入培養(yǎng)箱中（37℃，5% CO2）培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基。之后2～3 d傳代一次，實(shí)驗(yàn)選用3～5代細(xì)胞。

1.2.2試驗(yàn)分組和LPS干預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)置對(duì)照組（LPS刺激0 h）、LPS刺激組。對(duì)照組為細(xì)胞和正常培養(yǎng)基，不加LPS，LPS組加細(xì)胞和溶解有不同濃度LPS的培養(yǎng)基，刺激不同時(shí)間（0.01 μg/ml-6 h組、0.1 μg/ml-6 h組、0.5 μg/ ml-6 h組、1 μg/ml-6 h組、10 μg/ml-6 h組、0.01 μg/ml-24 h組、0.1 μg/ml-24 h組、0.5 μg/ml-24 h組、1 μg/ml-24 h組、10 μg/ml-24 h組、0.01 μg/ml-48 h組、0.1 μg/ml-48 h組、0.5 μg/ml-48 h組、1 μg/ml-48 h組、10 μg/ml-48 h組）。接種細(xì)胞：當(dāng)細(xì)胞數(shù)占整個(gè)瓶底70%～80%時(shí)將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于三塊6孔板，3 ml細(xì)胞懸液/孔，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日取出三塊6孔板以無菌PBS沖洗2遍，對(duì)照組加入100μl新鮮培養(yǎng)基，LPS組每孔加入等體積濃度的LPS溶液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。其中6孔板一用LPS刺激6 h，6孔板二用LPS刺激24 h，6孔板三用LPS刺激48 h。

1.3ELISA法檢測(cè)炎癥因子表達(dá) 6孔板達(dá)到各自LPS刺激時(shí)間后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，4℃ 12000r/ min離心20 min，吸出上清液待測(cè)。ELISA加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和測(cè)試孔。標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，余孔加細(xì)胞上清100 μL，設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育2 h。棄去液體，甩干，加檢測(cè)溶液A工作液100 μL，蓋上覆膜溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μL的洗滌液重復(fù)洗板3次，每孔加檢測(cè)溶液B工作液100 μL，溫育30 min。洗板5次后每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3～4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3～4孔梯度不明顯時(shí)，加終止溶液50 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD）值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度LPS作用不同時(shí)間對(duì)HCASMC生長(zhǎng)的影響 通過倒置相差顯微鏡觀察，貼壁的HCASMC為梭形生長(zhǎng)，伸展性好，透明度好，呈致密束狀排列，不同濃度LPS刺激不同時(shí)間后，HCASMC形態(tài)保持不變，但生長(zhǎng)速度有不同程度的加快，細(xì)胞排列更為緊密（圖1）。

2.2不同濃度LPS作用不同時(shí)間對(duì)HCASMC炎癥因子IL-1β表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組只有少量的IL-1β分泌。加入不同濃度LPS刺激后，與對(duì)照組比較，干預(yù)6 h的各LPS濃度組IL-1β表達(dá)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。而干預(yù)24 h或48 h的各LPS濃度組與對(duì)照組相比IL-1β表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），但其促炎癥作用并未體現(xiàn)出濃度依賴性（圖2，表1）。

圖1　不同濃度LPS作用不同時(shí)間的HCASMC

圖2　LPS對(duì)HCASMC炎性活化過程中IL-1β表達(dá)的影響（與對(duì)照組比較，aP＜0.05）

表1　不同濃度 LPS作用不同時(shí)間對(duì)HCASMC炎癥因子IL-1β表達(dá)的影響

2.3不同濃度LPS作用不同時(shí)間對(duì)HCASMC炎癥因子IL-6表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組有少量IL-6分泌。加入不同濃度LPS刺激后，與對(duì)照組比較，0.5μg/ml濃度組LPS干預(yù)6 h、24 h、48 h均可顯著誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)增加，1 μg/ml濃度組則在24 h、48 h刺激條件下表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。LPS促炎癥作用仍未見濃度依賴性（圖3，表2）。

2.4不同濃度LPS作用不同時(shí)間對(duì)HCASMC炎癥因子TNF-α表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組有少量TNF-α的分泌，加入LPS干預(yù)后，TNF-α的變化趨勢(shì)與IL-6相一致。與對(duì)照組比較，0.5μg/ml濃度組LPS干預(yù)6 h、24 h、48 h后顯著誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)增加，1μg/ml濃度組干預(yù)24 h、48 h炎癥因子TNF-α表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），其余各組無明顯變化（圖4，表3）。

圖3　LPS對(duì)HCASMC炎性活化過程中IL-6表達(dá)的影響（與對(duì)照組比較，aP＜0.05）

表2　不同濃度 LPS作用不同時(shí)間對(duì)HCASMC炎癥因子IL-6表達(dá)的影響

圖4　 LPS對(duì)HCASMC炎性活化過程中TNF-α表達(dá)的影響（與對(duì)照組比較，aP＜0.05）

3 討論

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）作為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的重要治療手段。然而置入金屬裸支架后仍有30%的再狹窄率，置入藥物涂層支架后再狹窄率也在8%～9%左右，嚴(yán)重影響介入治療遠(yuǎn)期療效［6，7］。PCI術(shù)后再狹窄是一種多因素、多種機(jī)制共同參與的過程。一般認(rèn)為再狹窄是局部血管損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，主要包括炎癥反應(yīng)、血栓形成、新生內(nèi)膜形成及血管重塑等病理過程［8］，其中炎癥反應(yīng)是再狹窄發(fā)生的重要病理機(jī)制［9］，而平滑肌細(xì)胞又在這一過程中發(fā)揮重要作用。

平滑肌細(xì)胞的分化、成熟及對(duì)外界環(huán)境改變所做出的調(diào)節(jié)，是一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控過程［10］。當(dāng)各種原因?qū)е卵軗p傷，可激活平滑肌細(xì)胞炎癥相關(guān)通路，引起細(xì)胞增殖，而過度增殖又可促進(jìn)動(dòng)脈壁炎癥，最終導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生［11-13］。因此，聚焦冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)行深入研究，有望進(jìn)一步拓展再狹窄的防治空間。

TLRs是研究較多的參與炎癥反應(yīng)且與先天免疫有關(guān)的模式識(shí)別受體家族。TLRs（包括TLR2和TLR4）能識(shí)別病原體，在病原體入侵機(jī)體的早期即可啟動(dòng)先天免疫。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4能識(shí)別組織細(xì)胞損傷后釋放的內(nèi)源性配基和一些危險(xiǎn)信號(hào)，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖與分化等［3，14-16］。TLR4可被LPS激活，引起自身的二聚化與MyD88結(jié)合，MyD88通過其死域與白介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）結(jié)合，導(dǎo)致IRAK的自身磷酸化，激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（TRAF6），促使有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族活化，其中核轉(zhuǎn)錄因子-κB （NF-κB）誘導(dǎo)激酶激活I(lǐng)-κB家族α、β激酶，導(dǎo)致I-κB磷酸化而降解，使NF-κB移位到細(xì)胞核，啟動(dòng)TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和血管損傷［3-5］。因此，以TLR4受體激動(dòng)劑LPS誘導(dǎo)HCASMC活化，建立穩(wěn)定的細(xì)胞病態(tài)活化模型，可為再狹窄的后續(xù)深入研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)。

本研究基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用MTT法篩選出LPS作用于HCASMC的無毒性濃度范圍，繼而在此范圍內(nèi)利用ELISA法測(cè)定不同濃度（0.01，0.1，0.5，1.0，10）μg/ml的LPS在不同時(shí)間（6 h，24 h，48 h）作用于HCASMC后，觀察其培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β以及TNF-α的表達(dá)，從而精篩出建立HCASMC炎癥細(xì)胞模型所需激動(dòng)劑LPS的較適宜濃度和作用時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)，一定條件下的LPS可使HCASMC炎癥通路激活，并誘導(dǎo)特定的炎癥因子分泌增加，其對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響與作用濃度和刺激時(shí)間有關(guān)。濃度范圍在（0.01，0.1，0.5，1.0，10）μg/ml 的LPS無論是刺激24 h或是48 h，均可顯著誘導(dǎo)HCASMC表達(dá)IL-1β，0.5μg/ml的LPS干預(yù)6 h、24 h、48 h可顯著誘導(dǎo)IL-6、TNF-α的表達(dá)，而1 μg/ml的LPS則在24 h、48 h刺激條件下大量誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子IL-6和TNF-α。綜合上述結(jié)果，0.5 μg/ml和1 μg/ml濃度的LPS刺激24 h或48 h可同時(shí)誘導(dǎo)HCASMC產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α。此外，本條件下造出的模型性能穩(wěn)定，可作為構(gòu)建HCASMC炎性活化模型的參考，為多細(xì)胞因子途徑抗炎藥物的篩選提供依據(jù)。但本研究?jī)H對(duì)LPS激活HCASMC的TLRs-MyD88炎癥信號(hào)通路下游產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和篩選，尚未對(duì)該通路中游、上游蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行深入研究，且未篩選出LPS誘導(dǎo)HCASMC炎癥活化細(xì)胞模型的最佳刺激條件，僅是進(jìn)一步縮窄了LPS造模的濃度和時(shí)間范圍，因此需進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

表3　不同濃度 LPS作用不同時(shí)間對(duì)HCASMC炎癥因子TNF-α表達(dá)的影響

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本文編輯：姚雪莉

Influence of lipopolysaccharide （LPS） on expressions of inflammatory factors of in vitro human coronary artery smooth muscle cells （HCASMC）： an investigation on establishing in-stent restenosis inflammationcell model

LI Hong-Mei*， WANG Xian. *Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China.

WANG Xian， E-mail： wx650515@163.com

Objective To investigate the influence of lipopolysaccharide （LPS）， at different time points， on expressions of inflammatory factors of in vitro human coronary artery smooth muscle cells （HCASMC）， and provide the test data for the establishment of inflammation activation model after stenting. Methods HCASMC was cultured in vitro for 3-5 generations， and seeded onto 6-well plates. LPS in different doses （0.01， 0.1， 0.5， 1.0， 10） μg/mL was added at different time points （6 h， 24 h， 48 h）. The expressions of interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were detected by using ELISA. Results There was only less IL-1β secreted in control group. Compared with control group， the expression of IL-1β had no significant changes in different-dose LPS groups after LPS intervention for 6 h （all P＞0.05）， while after LPS intervention for 24 h or 48 h， the expression of IL-1β increased significantly in different-dose LPS groups （all P＜0.05）. There was only less IL-6 secreted in control group. Compared with control group， the expression of IL-6 increased significantly in 0.5 μg/mL group after LPS intervention for 6 h， 24 h and 48 h， and increased in 1 μg/mL group after LPS intervention for 24 h and 48 h （all P＜0.05）. There was only less TNF-α secreted in control group. After LPS intervention，the change trend of TNF-α was the same as that of IL-6. Conclusion LPS intervention in doses of 0.5 μg/mL and 1 μg/mL for 24 h or 48 h can improve the expressions of IL-6， IL-1β and TNF-α， which can be taken as a reference for establishing inflammation activation model after stenting.

Lipopolysaccharide； Human coronary artery smooth muscle cells； Inflammatory factors； Cell model

R816.2

A

1674-4055（2016）03-0297-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273913）；北京中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放課題（2013-ZDXKKF-27）

1100700 北京，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院；2100700北京，北京中醫(yī)藥大學(xué)心血管病研究所

王顯，E-mail：wx650515@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.03.11