云煙87大小孢子形成和雌雄配子體發(fā)育觀察

吉志超，李祖任，高凱悅，張依楠，廖海民

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025)

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云煙87大小孢子形成和雌雄配子體發(fā)育觀察

吉志超，李祖任，高凱悅，張依楠，廖海民*

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025)

采取不同發(fā)育階段烤煙云煙87的花器官，采用常規(guī)石蠟切片法對其解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：烤煙云煙87花藥壁發(fā)育類型為基本型，分化完全的花藥壁由表皮、纖維層、中層和絨氈層構(gòu)成，后者為腺質(zhì)型絨氈層類型。小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂類型為同時(shí)型，四分體呈四面體型和十字交叉型，成熟花粉粒為二細(xì)胞型?？緹熢茻?7的胚珠為倒生胚珠，薄珠心，胚珠多數(shù)；大孢子母細(xì)胞由孢原細(xì)胞直接生成，胚囊發(fā)育類型為蓼型。

云煙87；大孢子；小孢子；雄配子體；雌配子體

云煙87是以云煙2號(母本)和K326(父本)雜交選育而成，2000年12月經(jīng)國家品種審定委員會審定[1]，該品種結(jié)合了其母本和父本的優(yōu)點(diǎn)，具有抗病性強(qiáng)、品質(zhì)高、烘烤較易且適宜廣泛種植等特點(diǎn)[2]。根據(jù)貴州省煙草公司數(shù)據(jù)資料，2015年貴州省烤煙主栽品種主要有四種：云煙87、K326、云煙85、南江3號，其中云煙87占40%，約80萬畝。目前，對云煙87的研究主要集中在栽培、烘烤和品種特征等方面[1-6]，廖菊夠等[7]對迪勃納氏煙草大小孢子發(fā)生及雌雄配子發(fā)育過程進(jìn)行觀察研究，尚未見有關(guān)云煙87的胚胎學(xué)方面的研究報(bào)道。

大小孢子形成和雌雄配子體發(fā)育是植物進(jìn)行生殖繁育的重要階段，研究云煙87的配子體發(fā)育規(guī)律既可以了解其生殖生長進(jìn)程，同時(shí)也為研究煙草雜交育種提供理論基礎(chǔ)。運(yùn)用石蠟切片技術(shù)對云煙87大小孢子的發(fā)生和雌雄配子體的發(fā)育進(jìn)行了研究，以期了解該物種的生殖和繁衍特性，研究結(jié)果將為控制花期，制定有效的田間栽培措施，以及煙草種質(zhì)資源的保持和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

烤煙云煙87，來源為清鎮(zhèn)市煙草公司現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)蘆荻基地單元。取云煙87處在盛花期大小不同的花蕾，將雌蕊和雄蕊分離出，置于50%FAA固定液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)采用石蠟切片法[8]。經(jīng)過乙醇濃度遞增脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片(厚度8～10 μm)、番紅-固綠染色、中性樹膠封片等過程。再用Olympus DP26顯微鏡觀察并拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1小孢子發(fā)生和雄配子體的形成

烤煙云煙87的花為兩性花，每朵花中包含5個雄蕊，每個花藥具4個花粉囊(圖1-1)。小孢子發(fā)生起始于雄蕊原基，由一群具有旺盛分裂能力的細(xì)胞構(gòu)成。雄蕊原基細(xì)胞不斷分裂逐漸呈四棱形，在其四個角隅處分化產(chǎn)生核大、質(zhì)濃的孢原細(xì)胞(圖1-2)，孢原細(xì)胞進(jìn)行平周分裂形成初生壁細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞，緊貼表皮為初生壁細(xì)胞，其內(nèi)方為初生造孢細(xì)胞(圖1-3)。

初生造孢細(xì)胞經(jīng)多次有絲分裂形成小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞呈多邊形、體積較大、細(xì)胞核較為明顯(圖1-4)。小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成小孢子，減數(shù)分裂的第一次分裂不產(chǎn)生細(xì)胞壁，其胞質(zhì)分裂類型為同時(shí)型(圖1-6)。第二次分裂產(chǎn)生四個子細(xì)胞，在四個子核之間產(chǎn)生細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)彼此分離。形成的4個小孢子聚集在一起，為四分體時(shí)期，四分體呈四面體型和十字交叉型，其中四面體型較多(圖1-7)。以后，四分體的胼胝質(zhì)壁溶解，分離為四個小孢子(圖1-8)。剛被釋放出小孢子形狀不規(guī)則，體積較小，著色比較淺。之后小孢子的體積逐漸增大，呈圓形，表面具3個萌發(fā)溝(圖1-9)。剛開始小孢子早期細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，為單核中央期(圖1-9)，隨后由于中央大液泡形成，液泡把細(xì)胞核擠到了緊貼細(xì)胞壁的一側(cè)(圖1-10)。之后小孢子細(xì)胞發(fā)生一次不對稱的有絲分裂，進(jìn)入雙核期，位于花粉粒中央的核為營養(yǎng)核，位于花粉粒貼近細(xì)胞壁位置的核為生殖核，因此烤煙云煙87的花粉粒屬于二細(xì)胞型花粉(圖1-11)。

初生壁細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行多次垂周分裂和平周分裂形成多層細(xì)胞，這些細(xì)胞和位于最外層的表皮構(gòu)成花藥壁。早期的花藥壁由外向內(nèi)依次是：表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層(圖1-5)。

表皮位于最外層，為一層排列緊密的細(xì)胞構(gòu)成，其外壁上具有角質(zhì)膜，具有保護(hù)功能(圖1-5)。藥室內(nèi)壁緊貼表皮，在中層之外，細(xì)胞較大，為一層細(xì)胞(圖1-5)。在花藥成熟時(shí)，藥室內(nèi)壁細(xì)胞的內(nèi)切向壁和徑向壁出現(xiàn)加厚，分化成纖維層(圖1-11)。在花粉囊的連接處則不形成纖維層，仍保持薄壁狀態(tài)，以后此處開裂，花粉粒從此散出(圖1-12)。中層位于絨氈層和藥室內(nèi)壁之間，由2層細(xì)胞構(gòu)成，中層在小孢子發(fā)育過程中會逐漸解體(圖1-5)。位于花藥壁最內(nèi)層的細(xì)胞為絨氈層，由一層體積較大且質(zhì)濃厚的細(xì)胞構(gòu)成。絨氈層的細(xì)胞具有分泌功能，對小孢子的發(fā)生有重要的作用。早期的絨氈層細(xì)胞是單核的，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，絨氈層細(xì)胞活動開始活躍，細(xì)胞由單核變成兩核或多核(圖1-7)，當(dāng)減數(shù)分裂快結(jié)束時(shí)，也就是快到小孢子時(shí)期時(shí)，絨氈層開始出現(xiàn)退化(圖1-9)，在小孢子發(fā)育的晚期，也就是花粉成熟時(shí)，絨氈層完全退化(圖1-12)。小孢子發(fā)生進(jìn)程中，絨氈層細(xì)胞的原生質(zhì)一直在其原位置，到花粉成熟時(shí)，細(xì)胞壁解體，細(xì)胞自溶，屬于腺質(zhì)絨氈層類型。

2.2大孢子發(fā)生和雌配子的形成

烤煙云煙87子房由2個心皮合生成，2室，中軸胎座，倒生胚珠，多數(shù)胚珠(圖2-1，2)。在胚珠的珠孔端，表皮下面的一個細(xì)胞分化形成孢原細(xì)胞，其細(xì)胞的體積比周圍細(xì)胞大，質(zhì)濃厚，核明顯，這個細(xì)胞不經(jīng)過分裂直接成為大孢子母細(xì)胞(圖2-3，4)。大孢子母細(xì)胞在進(jìn)行減數(shù)分裂形成大孢子前，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞周圍被胼胝質(zhì)包圍。

當(dāng)大孢子母細(xì)胞體積增大到一定階段，即進(jìn)行減數(shù)分裂，減數(shù)第一次分裂形成二分體(圖2-5)，二分體繼續(xù)分裂，經(jīng)減數(shù)第二次分裂形成四分體，四分體呈一字線排列(圖2-6，7)。4個大孢子中有3個退化，近合點(diǎn)端大孢子繼續(xù)發(fā)育為功能大孢子，此種胚囊發(fā)育類型為單孢子胚囊(圖2-8)。

功能大孢子的細(xì)胞核發(fā)生連續(xù)的3次有絲分裂。第一次有絲分裂形成二核胚囊(圖2-9)，二核胚囊體積進(jìn)一步增大，兩個細(xì)胞核分別移向珠孔端和合點(diǎn)端，第二次有絲分裂形成四核胚囊(圖2-10)，第三次有絲分裂形成八核胚囊，此時(shí)在大孢子母細(xì)胞中的珠孔端和合點(diǎn)端分別具有四個核，之后這兩端分別有一個核向胚囊中央移動并相互靠攏，構(gòu)成含有兩個核的中央細(xì)胞，剩下合點(diǎn)端的3個核形成3個反足細(xì)胞，珠孔端的3個細(xì)胞核形成3個卵器，包括2個助細(xì)胞和1個卵細(xì)胞，其中助細(xì)胞靠近珠孔，卵細(xì)胞靠近中央細(xì)胞。至此，一個含有7細(xì)胞8核的成熟胚囊形成(圖2-11，12)。

圖1　云煙87小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

1.花橫切；2.孢原細(xì)胞出現(xiàn),箭頭示孢原細(xì)胞；3.花藥橫切，出現(xiàn)初生壁細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞；4.小孢子母細(xì)胞時(shí)期；5.分化完全的花藥壁；6.小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期；7.四分體時(shí)期；8.四分體分離為四個小孢子，箭頭示四分體剛分離；9.小孢子具3個萌發(fā)溝；10.雙核期初始；11.二細(xì)胞型花粉；12.成熟花粉時(shí)期

PC.周緣細(xì)胞；SC.造孢細(xì)胞；MMC.小孢子母細(xì)胞；Ep.表皮；En.藥室內(nèi)壁；MI.中層；Ta.絨氈層細(xì)胞；Ty.四分體

圖2　云煙87大孢子發(fā)生和雌配子體的形成

1.子房橫切；2.心皮縱切；3.孢原細(xì)胞時(shí)期，箭頭示孢原細(xì)胞；4.大孢子母細(xì)胞；5.二分體時(shí)期，箭頭示二分體；6.四分體早期，箭頭示四分體呈一字線排列；7.四分體晚期，箭頭示近合點(diǎn)端一個大孢子與其余三個大孢子分離；8.功能大孢子；9.二核胚囊；10.四核胚囊，箭頭示合點(diǎn)端和珠孔端分別具有兩個核；11.成熟胚囊，箭頭示卵器；12.成熟胚囊，示反足細(xì)胞、極核

Me.大孢子母細(xì)胞；OI.株被；EC.卵細(xì)胞；Sy.助細(xì)胞；PN.極核；AC.反足細(xì)胞

3　結(jié)論與討論

云煙87在小孢子發(fā)生過程中，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂類型為同時(shí)型[9]。根據(jù)Davis[10]對被子植物花藥壁發(fā)育類型的劃分，云煙87的花藥壁發(fā)育屬于基本類型。在云煙87雄配子體形成過程中，小孢子依次經(jīng)歷的過程為：四分體、單核中央期、單核靠邊期、雙核期，分化成熟的花粉為二細(xì)胞型花粉。成熟花粉粒的生殖細(xì)胞在花粉管中分裂形成2個精子， 這種花粉類型約占被子植物1/3[11]。 這與全雪麗[12]等對煙草吉煙9號品種小孢子的發(fā)育研究基本一致。這為煙草雜交育種及云煙87的單倍體育種研究提供依據(jù)。

云煙87的大孢子母細(xì)胞由珠心表皮下的孢原細(xì)胞直接形成，屬于薄珠心類型[9]。大孢子母細(xì)胞為單孢子胚囊型，70%被子植物的胚囊為該類型[13]。在雌配子體的形成過程中，單孢子胚囊中的未退化的大孢子發(fā)育為功能大孢子，功能大孢子經(jīng)過3次連續(xù)的有絲分裂，形成7細(xì)胞8核胚囊，因此胚囊發(fā)育屬于蓼型胚囊。符合對茄科植物胚胎學(xué)特征的描述，只是與辣椒的7細(xì)胞7核胚囊[14]不同。通過對比云煙87大小孢子的發(fā)育時(shí)間，發(fā)現(xiàn)當(dāng)雄蕊發(fā)育為四分體時(shí)，雌蕊開始發(fā)育。與廖菊夠[15]等對迪勃納氏煙草描述小孢子發(fā)育早于大孢子有所不同。

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The Megasporogenesis and Microsporogensis of Flue-cured Tobaccovar. Yunyan87 and Its Male and Female Gametophyte Formation

JIZhi-chao,LIZu-ren,GAOKai-yue,ZHANGYi-nan,LIAOHai-min*

(CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Anatomical structure of the floral organ of Flue-cured tobacco var. Yunyan 87 at different development stage was studied by common plant paraffin section. The results showed that,the anther wall wasdefined as basis development type,which contained glandulartapetummiddle layer,endotheca and epidermis. The meiosis of microspore mother cells was the simultaneous type,the tetrad arranged as tetrahedral or decussate tetrad. The mature pollens belong to 2-cell type.The ovule of Flue-cured tobacco var. Yunyan 87 wasanatropous,thin nucellus and numerous. The megaspore mother cell wasdeveloped from the archesporial cell and the megaspore at the chalazal end developed into the polygonum type embryosac.

Yunyan87;Megaspore;Microspore;Femalegametophyte;Male gametophyte

1008-0457(2016)03-0039-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.007

2016-03-04；修回日期：2016-04-08

貴陽市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與農(nóng)村科技計(jì)劃(2013筑科合同[2013102]4-6號)。

廖海民(1965-)，男，博士，教授，主要研究方向：植物分類及形態(tài)解剖學(xué)研究；E-mail: lhaimin@163.com。

Q944.5

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