秀麗隱桿線蟲-白念珠菌感染模型用于抗真菌藥效評(píng)價(jià)的研究

畢爽　胡淦海　胡丹丹　姜遠(yuǎn)英　王彥

(中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

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秀麗隱桿線蟲-白念珠菌感染模型用于抗真菌藥效評(píng)價(jià)的研究

畢爽胡淦海胡丹丹姜遠(yuǎn)英王彥

(中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

目的觀察秀麗隱桿線蟲-白念珠菌感染模型用于抗真菌藥效評(píng)價(jià)的可靠性和穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)該模型在抗真菌藥物研發(fā)中的應(yīng)用價(jià)值。方法使線蟲吞食白念珠菌造成致死性感染，建立線蟲-白念珠菌感染模型，選用4種臨床常見的抗真菌藥物 (氟康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈和5-氟胞嘧啶)和白念珠菌群體感應(yīng)分子法尼醇對(duì)感染后線蟲進(jìn)行治療，觀察線蟲存活狀態(tài)，記錄生存率從而評(píng)價(jià)抗真菌藥效。結(jié)果白念珠菌感染線蟲后生成菌絲穿破線蟲體表造成線蟲死亡。氟康唑、卡泊芬凈和5-氟胞嘧啶治療后線蟲體內(nèi)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)呈現(xiàn)不同程度的抑制狀態(tài)，線蟲生存率有提高且存在量效關(guān)系。兩性霉素B在該模型中也表現(xiàn)出了明顯的體內(nèi)抗真菌作用，但16 μg/mL、32 μg/mL的高濃度兩性霉素B表現(xiàn)出毒性。法尼醇能夠抑制線蟲體內(nèi)白念珠菌菌絲形成，但對(duì)線蟲保護(hù)作用較弱。結(jié)論秀麗隱桿線蟲-白念珠菌感染模型用于體內(nèi)抗真菌藥效評(píng)價(jià)方法可靠，并具有通量高、成本低、周期短等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。

秀麗隱桿線蟲；白念珠菌；感染模型；抗真菌藥物

[Chin J Mycol，2016，11(3):135-139]

隨著器官移植、侵入性診療技術(shù)的發(fā)展，免疫抑制劑的廣泛使用，以及艾滋病傳播，侵襲性白念珠菌感染已成為臨床免疫力低下患者最主要的死亡原因之一。臨床現(xiàn)有抗真菌藥物品種有限，同時(shí)臨床白念珠菌耐藥性也給治療帶來了極大挑戰(zhàn)，研發(fā)新型抗真菌藥物迫在眉睫。

傳統(tǒng)的抗真菌藥物體外篩選和小鼠體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)都存在不盡人意之處。傳統(tǒng)體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn) (微量液基稀釋法)無法模擬體內(nèi)環(huán)境，大量化合物的抗真菌作用源于其毒性，細(xì)胞或者分子水平高通量篩選出的抗真菌化合物一旦進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段常被宣判無效或因毒性過大而被淘汰出局，造成人力物力的巨大浪費(fèi)。傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)模型 (如小鼠菌血癥模型)周期長(zhǎng)、效率低、成本高，無法滿足藥物研發(fā)前期高通量篩選的需要。

秀麗隱桿線蟲 (簡(jiǎn)稱線蟲)模型有望成為同時(shí)觀察抗真菌藥物療效和毒性的高通量動(dòng)物模型。秀麗隱桿線蟲雌雄同體，以細(xì)菌為食物，25℃下僅3 d即可由幼蟲成長(zhǎng)為成蟲，成蟲長(zhǎng)約1 mm，一塊普通的9 cm培養(yǎng)皿即可培養(yǎng)300～600只線蟲[1]。線蟲已成為現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的重要模式生物，Mylonakis實(shí)驗(yàn)室成功將該線蟲作為宿主研究病原真菌的致病性[2-4]。該線蟲模型與我國(guó)現(xiàn)有的小鼠模型相比，具有周期短、成本低、通量高的優(yōu)勢(shì)。在本研究中，我們綜合國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果，選擇了4種臨床常用的抗真菌藥物，并增加同樣具有抑制菌絲作用的白念珠菌群體感應(yīng)分子法尼醇作為研究對(duì)象，利用線蟲-白念珠菌感染模型觀察5種化合物的體內(nèi)抗真菌活性，并同時(shí)考察量效關(guān)系、化合物毒性，以及該模型用于抗真菌藥物體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)的可靠性。

1　材料和方法

1.1材料

菌株與線蟲白念珠菌 (Candidaalbicans)SC5314由美國(guó)華盛頓喬治敦大學(xué)的William A.Fonzi教授惠贈(zèng)，大腸桿菌 (Escherichiacoli)OP50、秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditiselegansglp-4;sek-1)由美國(guó)哈佛大學(xué)的Eleftherios Mylonakis教授惠贈(zèng)。

藥物大扶康 (Fluconazole，F(xiàn)LC)購(gòu)自輝瑞制藥有限責(zé)任公司，兩性霉素B (Amphotericin B，AmB)、5-氟胞嘧啶 (5-Fluorocytosine，5-FC)、法尼醇 (Farnesol，F(xiàn)ar)均購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)試劑公司，注射用醋酸卡泊芬凈 (Caspofungin，Casp)購(gòu)自美國(guó)默沙東公司。藥物母液配置：氟康唑?yàn)樽⑸鋭瑵舛? mg/mL，直接取用?？ú捶覂羰褂脽o菌水溶解，其余藥物使用二甲亞砜 (Dimethyl Sulphoxide，DMSO)溶解，配置成64 mg/mL儲(chǔ)備液，分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：LB 25 g，加三蒸水1 000 mL，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌OP50培養(yǎng)液：將大腸桿菌OP50接種至100 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h濃縮備用。K2HPO4-KH2PO4緩沖液：KH2PO4108.3 g，K2HPO435.6 g，pH 6.0，定容至1 000 mL，濾過除菌，于4℃保存?zhèn)溆?。NGM培養(yǎng)基：2.5 g蛋白胨，3 g氯化鈉，18 g瓊脂，972 mL三蒸水，高壓滅菌，待溫度降至60℃以下分別加入濾過除菌的K2HPO4-KH2PO4緩沖液25 mL，5 mg/mL膽固醇溶液1 mL，1 mol/L MgSO41 mL，1 mol/L CaCl21 mL，100 mg/mL鏈霉素1 mL。制備NGM培養(yǎng)板，待平板冷卻凝固后，將100 μL濃縮的大腸桿菌OP50培養(yǎng)液涂布于培養(yǎng)基上，室溫放置兩天后備用。BHI培養(yǎng)基：BHI 37 g，瓊脂20 g，加三蒸水至1 000 mL，高壓滅菌，待溫度降至60℃以下后，加入卡那霉素使其終濃度為45 μg/mL，于4℃保存?zhèn)溆?。BHI培養(yǎng)液：BHI 37 g，加三蒸水至1 000 mL，高壓滅菌后于4℃保存?zhèn)溆?。M9緩沖液：KH2PO43 g，Na2HPO46 g，NaCl 2 g，MgSO4120 mg，加三蒸水至1 000 mL，高壓滅菌后于4℃保存?zhèn)溆谩Ｉ潮て咸烟黔傊腆w培養(yǎng)基 (SDA)：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂17 g，加三蒸水900 mL，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，并以三蒸水定容至1 000 mL，高壓滅菌后于4℃保存?zhèn)溆谩PD培養(yǎng)液：蛋白胨20 g，酵母浸膏10 g，葡萄糖200 g，加三蒸水定容至1 000 mL，高壓滅菌后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器HPX-300BS-Ⅲ型恒溫培養(yǎng)箱 (上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，C-W/0×B/22型體視顯微鏡 (Nikon SMZ745)，25℃低溫培養(yǎng)箱 (Thermo Scientific)，CT15RE型離心機(jī) (HITACHI)，HZ-2111K-B型恒溫振蕩器 (太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Allegra?X-15R Centrifuge (Beckman Coulter)。

1.2方法

菌株培養(yǎng)從4℃保存的SDA固體培養(yǎng)基上挑取白念珠菌SC5314單克隆于YPD液體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱，200 r/min振蕩培養(yǎng)，活化16 h。取200 μL活化后菌液涂布于BHI平板中央，30℃培養(yǎng)24 h后用于線蟲感染。

線蟲的飼養(yǎng)及同期化將線蟲蟲卵用5 mL M9緩沖液重懸，在室溫環(huán)境下用垂直混合儀孵化過夜，得到L1期幼蟲，將幼蟲轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)板上，每皿約含500條幼蟲，25℃培養(yǎng)3 d后即得到同期化的成蟲。

線蟲-白念珠菌感染模型的建立將400～500條同期化的線蟲成蟲轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)有白念珠菌的BHI平板的中央，25℃下孵育4 h，使線蟲吞食并感染白念珠菌。之后，用M9緩沖液將感染后的線蟲從BHI平板上洗下。將線蟲分別轉(zhuǎn)移至12孔板的不同孔中，每孔30條，孔內(nèi)含2 mL液體培養(yǎng)基 (含80% M9，20% BHI，45 μg/mL卡那霉素)。25℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察6 d，記錄線蟲生存率與形態(tài)并拍照。

抗真菌化合物對(duì)感染后線蟲的療效觀察在含有上述感染后線蟲的孔內(nèi)加入不同濃度的藥物，空白感染對(duì)照組為加入等體積的溶劑，健康線蟲對(duì)照組直接加入未感染白念珠菌的線蟲。各藥物濃度設(shè)置見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 5軟件對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Log-rank (Mantel-Cox) Test方法比較生存率差異，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1線蟲-白念珠菌感染模型的成功建立

OP50為飼料培養(yǎng)的線蟲作為健康線蟲對(duì)照組，144 h后線蟲全部存活，狀態(tài)活潑 (見圖1a)。白念珠菌感染組在感染后24 h大部分線蟲咽喉部發(fā)生腫大，活動(dòng)能力明顯下降，部分線蟲死亡且有少量菌絲生成穿出體表；48 h后死亡的線蟲有大量菌絲穿出體表 (見圖1b，黑色箭頭所指為菌絲)，且生存率已低于50%，144 h后生存率約為23%，感染組與健康組相比P<0.000 1 (見圖1c)。

2.2抗真菌藥物在線蟲-白念珠菌感染模型上的藥效評(píng)價(jià)

本研究選取了4種臨床具有代表性的抗真菌藥物--唑類中的氟康唑，棘白菌素類中的卡泊芬凈，兩性霉素B和5-氟胞嘧啶，此外，選取已報(bào)道具有抗白念珠菌活性的群體感應(yīng)分子法尼醇[5-7]用于藥效評(píng)價(jià)。利用線蟲-白念珠菌感染模型觀察不同濃度的上述藥物對(duì)感染后線蟲的治療效果，4個(gè)臨床常用抗真菌藥物都能不同程度地保護(hù)感染后線蟲，線蟲體表沒有大量菌絲穿出的現(xiàn)象，存活的線蟲狀態(tài)活潑；法尼醇能夠明顯抑制白念珠菌菌絲形成，但對(duì)感染后線蟲保護(hù)作用較弱，生存率沒有明顯提高。

表1各化合物處理后線蟲的生存率與P值

Tab.1ThePvalue and survival rates ofC.elegansafter antifungal agents treatment (FLC.fluconazole,AmB.amphotericin B,5-FC.5-fluorocytosine,Far.farnesol,Casp.caspofungin)

化合物濃度(μg/mL)生存率(144h)P值FLC023%847%0.0186*1647%0.0065**3263%0.0004***6467%0.0003***AmB023%453%0.0146*860%0.0014**1650%0.0104**3247%0.0428*Casp023%250%0.0268*460%0.0033**860%0.0033**1673%<0.0001***5-FC023%233%0.4301447%0.0388*857%0.0056**1653%0.0121*Far030%450%0.1051852%0.05731633%0.51583240%0.5197

注：*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001

各化合物治療組48 h時(shí)線蟲顯微照片見圖2a～e，144 h的生存曲線見圖3a～e，各化合物在不同濃度下線蟲的生存率與P值見表1。8～64 μg/mL的氟康唑均顯示出顯著的保護(hù)作用，并具有較好的量效關(guān)系 (見圖2a,3a)。8 μg/mL的氟康唑治療組大部分線蟲呈現(xiàn)活潑的健康狀態(tài)，少量死亡的線蟲出現(xiàn)咽喉部腫大或有少量菌絲形成 (圖2a中黑色箭頭所指為咽喉部)。4～32 μg/mL的兩性霉素B在線蟲模型上也表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用，但高濃度時(shí) (16、32 μg/mL)線蟲生存率低于8 μg/mL濃度組，因毒性死亡的線蟲增多 (見圖2b,3b)。因毒性死亡的線蟲呈全身黑色不透明的僵直狀態(tài)，與因感染死亡時(shí)咽喉部腫大狀態(tài) (圖2b黑色箭頭所指)有明顯區(qū)別。2～16 μg/mL卡泊芬凈也顯示出顯著的保護(hù)作用，具有量效關(guān)系，16 μg/mL卡泊芬凈沒有表現(xiàn)出毒性，且死亡的線蟲咽喉部未見腫大 (見圖2c,3c)。5-氟胞嘧啶在≤4 μg/mL時(shí)沒有顯著的保護(hù)作用，在>4 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出保護(hù)作用。16 μg/mL時(shí)能較明顯的抑制線蟲體內(nèi)菌絲，感染死亡的線蟲咽喉部有少量菌絲生成 (見圖2d,3d)，抑制菌絲效果不如氟康唑、兩性霉素B和卡泊芬凈。法尼醇抗真菌活性較好，孔內(nèi)環(huán)境較清澈，并能夠抑制線蟲體內(nèi)白念珠菌菌絲，感染死亡的線蟲咽喉部有少量菌絲生成，但線蟲的生存率并未明顯提高。≤8 μg/mL時(shí)線蟲生存率與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)，≥16 μg/mL時(shí)線蟲生存率反而下降，且出現(xiàn)較多呈僵直態(tài)死亡的線蟲 (見圖2e,3e)。

圖1a.空白對(duì)照組健康線蟲照片，b.白念珠菌感染組線蟲照片，c.空白對(duì)照組和白念珠菌感染組線蟲生存曲線圖2a.8 μg/mL氟康唑治療組的線蟲照片，b.16 μg/mL兩性霉素B治療組的線蟲照片，c.16 μg/mL卡泊芬凈治療組的線蟲照片，d.16 μg/mL 5-氟胞嘧啶治療組的線蟲照片，e.16 μg/mL法尼醇治療組的線蟲照片圖3a.氟康唑治療組的生存曲線，b.兩性霉素B治療組的生存曲線，c.卡泊芬凈治療組的生存曲線，d.5-氟胞嘧啶治療組的生存曲線，e.法尼醇治療組的生存曲線 (所有線蟲照片皆為48 h時(shí)所拍，線蟲照片中左圖標(biāo)尺為1 000 μm，右圖標(biāo)尺為400 μm)

Fig.1a.Images of healthyC.elegansnematodes,b.Images of nematodes infected byC.albicans,c.Survival curves of healthy nematodes control group and andC.albicans-infected model groupFig.2a.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 8 μg/mL FLC,b.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL AmB,c.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL Casp,d.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL 5-FC,e.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL FarFig.3a.Survival curves of FLC treated groups,b.Survival curves of AmB treated groups,c.Survival curves of Casp treated groups,d.Survival curves of 5-FC treated groups,e.Survival curves of Far treated groups (FLC.fluconazole,AmB.amphotericin B,5-FC.5-fluorocytosine,Far.farnesol,Casp.caspofungin) (all the images were taken after 48 h;bars in the nematodes images:1 000 μm-left ones,400 μm-right ones)

3　討　　論

本研究評(píng)價(jià)了秀麗隱桿線蟲-白念珠菌感染模型用于抗真菌藥效評(píng)價(jià)的可靠性和穩(wěn)定性，探究了臨床常用抗真菌藥物在線蟲模型上的治療窗，為之后研究時(shí)選取陽性藥物及藥物濃度提供依據(jù)。此外，本研究直接在顯微鏡下觀察線蟲存活與菌絲生長(zhǎng)情況，與利用熒光蛋白令死亡線蟲染色的觀察方法[8]相比，更加直觀地展現(xiàn)了利用線蟲模型考察化合物抗真菌活性與毒性時(shí)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并對(duì)因毒性死亡的線蟲與因感染死亡的線蟲加以區(qū)分，為之后篩選與研究抗真菌化合物提供了合理的評(píng)價(jià)依據(jù)。

線蟲-白念珠菌感染模型的建立簡(jiǎn)便易行，感染組6 d后生存率僅為對(duì)照組的1/4，從形態(tài)上來看感染組線蟲體內(nèi)生成大量菌絲并穿出體表，與對(duì)照組存活線蟲相比現(xiàn)象區(qū)別明顯。在該模型上，氟康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈和5-氟胞嘧啶的體內(nèi)抗真菌活性得到了很好的驗(yàn)證，感染后線蟲在治療后菌絲顯著被抑制，保護(hù)作用明顯。兩性霉素B在臨床上使用時(shí)抗真菌活性雖好，但卻具有較大毒性，這一點(diǎn)在線蟲模型上也得以體現(xiàn)，高濃度兩性霉素B的生存率低于低濃度組，線蟲死亡狀態(tài)呈全身黑色的僵直狀態(tài)，與因感染死亡的線蟲具有明顯區(qū)別。法尼醇是白念珠菌生長(zhǎng)到一定密度時(shí)自身分泌的一種群體感應(yīng)分子，具有抑制白念珠菌生長(zhǎng)[6]、誘導(dǎo)凋亡[5,7]、抗生物被膜[9]等活性，但有研究報(bào)道白念珠菌感染宿主后分泌法尼醇并提高自身致病力[10]，法尼醇在小鼠菌血癥模型中也導(dǎo)致小鼠死亡率升高[10]。在本研究中，法尼醇可抑制線蟲體內(nèi)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)，但對(duì)線蟲未表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用，推測(cè)對(duì)線蟲同樣存在毒性，與前期體外實(shí)驗(yàn)和小鼠模型的研究報(bào)道結(jié)論一致。

綜上所述，線蟲-白念珠菌感染模型能夠可靠、穩(wěn)定地重現(xiàn)抗真菌藥物在哺乳動(dòng)物上的治療效果，呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，在觀察藥物對(duì)白念珠菌菌絲體內(nèi)抑制作用的同時(shí)還能夠體現(xiàn)藥物的毒性。該線蟲模型具有高通量、低成本、周期短等優(yōu)點(diǎn)，目前在抗真菌藥物研發(fā)方面的應(yīng)用尚處于起步階段，值得推廣應(yīng)用。

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[本文編輯]王飛

Evaluation of antifungal drugs using aCaenorhabditiselegans-Candidaalbicansinfection model

BI Shuang,HU Gan-Hai,HU Dan-dan,JIANG Yuan-ying,WANG Yan

(NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo investigate the reliability and stability ofCaenorhabditiselegans-Candidaalbicansinfection model in the application of antifungal drug evaluation,and to evaluate the value of this model in antifungal drug development.MethodC.albicanswas ingested byC.elegansand caused a persistent lethal infection to establish this infection model.Common antifungal drugs includingfuconazole,amphotericin B,caspofungin and 5-fluorocytosine,and farnesol,a quorum sensing molecule secreted byC.albicans,were used to treat the infected nematodes.The survival rate of the nematodes was observed to evaluate the activities of antifugal agents.ResultsC.albicansinfectedC.elegans,formed hyphae piercing the cuticle of the nematodes and resulted in the death of the nematodes.Fluconazole,caspofungin and 5-fluorocytosine inhibited the hyphal formation ofC.albicansin different degrees in thisinvivomodel,improving the survival ofC.elegansin a dose-dependent manner.Amphotericin B also showed antifungal effect in theC.elegans-C.albicansmodel,while at high concentrations as 16 or 32 μg/mL,the toxicity of amphotericin B was exhibited.Farnesol inhibited the hyphal formation ofC.albicans,but showed weak protection effect toC.elegans.ConclusionTheC.elegans-C.albicansinfection model is reliable for antifungal drug evaluation.Moreover,this model has high-throughput,low-cost,time-saving properties,and is worthy to be widely used in antifungal drug development.

Caenorhabditiselegans;Candidaalbicans;infection model;antifungal drug

2015-10-14

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81273558,81072678)；上海市浦江人才計(jì)劃 (14PJD001)

畢爽，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:shuangxun640@126.com;胡淦海，男 (漢族)，碩士.E-mail:349803307@qq.com;畢爽、胡淦海對(duì)本研究有同等貢獻(xiàn)，為本文共同

。

王彥，E-mail:wangyansmmu@126.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0135-05