不同濃度葛根素溶液對人皮膚成纖維細胞生物學效應的影響*

岳冬梅，閻　冰，馬軼文，王益民，孟慶楠

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津，300193；2.天津市濱海新區(qū)塘沽婦產醫(yī)院，天津300451）

不同濃度葛根素溶液對人皮膚成纖維細胞生物學效應的影響*

岳冬梅1，閻冰1，馬軼文2，王益民1，孟慶楠1

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津，300193；2.天津市濱海新區(qū)塘沽婦產醫(yī)院，天津300451）

［目的］觀察不同濃度的葛根素溶液對人皮膚成纖維細胞（HDF）生物學效應的影響。［方法］體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，選用葛根素溶液100、200、300、400、500 μg/mL五個不同的藥物濃度，觀測葛根素溶液在5個藥物濃度下對HDF的生物學效應的影響。［結果］與對照組相比較，藥物濃度為100、200、300、400 μg/mL的葛根素溶液，對體外培養(yǎng)的HDF的生物學效應無影響（P＞0.05）；藥物濃度為500 μg/mL的葛根素溶液，對體外培養(yǎng)的HDF的增殖有抑制作用（P＜0.05），且對HDF的細胞膜有一定的損傷作用（P＜0.05）。［結論］藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液對體外培養(yǎng)的HDF有抑制增殖和細胞膜損傷的作用，此藥物濃度可作為干預HDF的作用劑量，對瘢痕組織的治療將起到一定作用。

葛根素；人皮膚成纖維細胞；藥物濃度；生物學效應

葛根素為黃酮類化合物，是豆科植物野葛或甘葛藤的有效成分之一，主要用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病等［1-2］。研究報道［3］葛根素溶液在藥物濃度80～400 μg/mL下，作用于人胚肺成纖維細胞24～72 h，此時間范圍內，葛根素在依賴時間和劑量的前提下可抑制其增生（P＜0.05），本研究借鑒前人經驗，選用體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞（HDF）的方法，選用葛根素從低到高五個不同的藥物濃度作研究，觀測葛根素注射液在濃度遞增的情況下對人皮膚成纖維細胞的增殖活性、細胞膜、氧化損傷產生的影響，對比分析前后實驗結果，選擇出最佳藥物劑量，為后序的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗細胞人皮膚成纖維細胞株（HDF，美國

ATCC公司）。

1.2實驗試劑葛根素注射液（濃度：5 g/L，山東萊陽生物化學制藥廠）；；優(yōu)級胎牛血清（FBS）、胰酶（美國Gibco公司）、DMEM低糖培養(yǎng)粉（美國Gibco

公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（中生北控生物有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程有限公司）。

1.3檢測儀器酶標儀（奧地利SUNRISE）；全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.4實驗分組空白組（只含培養(yǎng)基）、對照組（培養(yǎng)基+細胞）、葛根素組。葛根素組藥物濃度依次為：100 μg/mL（1組）、200 μg/mL（2組）、300 μg/mL （3組）、400 μg/mL（4組）、500 μg/mL（5組），共設5個濃度組。

1.5檢測指標主要檢測HDF的形態(tài)學變化、MTT、LDH、SOD、MDA值。

1.6細胞培養(yǎng)及指標檢測

1.6.1HDF的培養(yǎng)對HDF進行復蘇，將其轉移到細胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置于37℃、含5%二氧化碳（CO2）的培養(yǎng)箱中，待細胞鋪滿瓶壁時，用0.25%胰蛋白酶，對HDF進行消化并傳代，采用處在對數生長期（LP）的細胞進行本次實驗。

1.6.2檢測細胞MTT值用混合消化液消化80%融合生長的HDF，收集處理后的細胞，用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基接種于96孔板，密度為2× 104/每孔，每孔100 μL，正常培養(yǎng)12 h后，使細胞貼壁。實驗設空白組、對照組、葛根素藥物組。藥物組每組各加入葛根素注射液（原濃度5 g/L）2、4、6、8、10 μL，令葛根素溶液的藥物濃度，依次為：100 μg/mL （1組）、200μg/mL（2組）、300μg/mL（3組）、400μg/mL （4組）、500 μg/mL（5組），共設5個濃度組，每組包含12個復孔。培養(yǎng)48 h后，移出培養(yǎng)液，換入磷酸鹽緩沖溶液（PBS液，pH7.2-7.4），100 μL/孔，清洗2遍，移出PBS液，并于每孔中加入MTT（5 g/L）20 μL，孵育4 h后，將MTT溶液移出，在每個孔中，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，為使結晶物徹底溶解，將96孔板放于搖床上，低速振搖10 min，待結晶物完全溶解后，用酶標儀于570 nm波長檢測各組的光密度值（Optical Density，OD值）。

1.6.3檢測細胞LDH、SOD、MDA值將HDF以細胞密度5×104/mL種植于24孔板，分為空白組、對照組、5個不同濃度藥物組（同上），每組12個復孔，放入細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后，取細胞上清液，使用LDH試劑盒，在全自動生化儀上檢測細胞外的LDH值；使用SOD試劑盒，檢測細胞外的SOD值；使用MDA試劑盒，檢測細胞外的MDA值。

1.7統(tǒng)計學分析采用統(tǒng)計軟件SPSS18.0分析，計量資料以均數±標準差（±ss）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1藥物干預下HDF的生長狀態(tài)和形態(tài)學的改變使用倒置顯微鏡，觀測到對照組HDF的形狀為長梭形，葛根素注射液組（藥物組）HDF的間隙，相比對照組有所增大，HDF生長的略顯緩慢。

2.2不同濃度的葛根素溶液對HDF增殖的影響結果見表1。

表1　不同濃度的葛根素溶液對HDF增殖的影響（±ss）Tab.1　Effects of puerarin solution of different concentrations on HDF proliferation（±ss）

表1　不同濃度的葛根素溶液對HDF增殖的影響（±ss）Tab.1　Effects of puerarin solution of different concentrations on HDF proliferation（±ss）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別　OD值空白組　0.075±0.022對照組　0.125±0.02 1組　0.131±0.028 2組　0.142±0.041 3組　0.127±0.028 4組　0.112±0.018 5組　0.105±0.013* n 藥物濃度（μg/mL）12 12 12 12 12 12 12 0 0 100 200 300 400 500

由表1可見，與對照組細胞的OD值相比較，葛根素溶液的藥物濃度依次為100、200、300、400μg/mL時，差異均無統(tǒng)計學意義；與對照組的OD值相比較，當葛根素溶液的藥物濃度達到500 μg/mL時，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），顯示藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，對體外培養(yǎng)的HDF具有抑制增殖的作用。

2.3不同濃度的葛根素溶液對HDF乳酸脫氫酶的影響結果見表2。

表2　不同濃度的葛根素溶液對HDF乳酸脫氫酶的影響（±ss）Tab.2　Effects of puerarin solution of different concentrations on LDH of HDF（±ss）

表2　不同濃度的葛根素溶液對HDF乳酸脫氫酶的影響（±ss）Tab.2　Effects of puerarin solution of different concentrations on LDH of HDF（±ss）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別空白組對照組1組2組3組4組5組n 12 12 12 12 12 12 12藥物濃度（μg/mL）　LDH值（U/L）0 40.92±2.50 0 52.92±2.81 100　53.58±2.56 200　54.83±3.58 300　55.58±3.23 400　56.38±3.22 500　60.92±2.59*

乳酸脫氫酶（LDH）是穩(wěn)定的胞漿酶，它存在于所有的細胞當中，當細胞膜收到損傷時，它會快速釋放到細胞培養(yǎng)液中。由表2可見，與對照組細胞的LDH值相比較，葛根素溶液的藥物濃度依次為100、200、300、400 μg/mL時，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與對照組的LDH值相比較，當葛根素溶液的藥物濃度達到500μg/mL時，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），顯示藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，對體外培養(yǎng)的HDF的細胞膜具有一定的損傷作用。

2.4不同濃度的葛根素溶液對HDF氧化損傷的影響結果見表3。

表3　不同濃度的葛根素溶液對HDF氧化損傷的影響（±ss）Tab.3　Effects of puerarin solution of different concentrations on oxidative damage of HDF（±ss）

表3　不同濃度的葛根素溶液對HDF氧化損傷的影響（±ss）Tab.3　Effects of puerarin solution of different concentrations on oxidative damage of HDF（±ss）

組別空白組對照組組組組組組n 12 12 12 12 12 12 12藥物濃度（μg/mL） SOD值（U/L）MDA值（μmol/L）0 15.23±2.26　0.65±0.023 0 20.17±1.92　0.89±0.024 100　21.32±2.28　0.92±0.031 200　20.42±1.41　0.91±0.028 300　21.27±1.58　0.89±0.027 400　20.67±2.18　0.91±0.025 500　22.15±2.13　0.92±0.026 1 2 3 4 5

由表3可見，與對照組細胞的SOD值、MDA值相比較，葛根素溶液的藥物濃度依次為100、200、300、400、500μg/mL時，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。細胞的SOD值、MDA值代表了細胞的氧化損傷狀態(tài)，顯示上述藥物濃度的葛根素溶液，對體外培養(yǎng)的HDF的氧化損傷無影響。

3　結論

與對照組相比較，藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，對體外培養(yǎng)的HDF的增殖有抑制作用，對細胞膜有一定的損傷作用。

4　討論

中醫(yī)記載，葛根具有退熱發(fā)汗、解肌、止瀉、止渴等作用效果，其藥理活性較強，安全性高，且自然資源豐富、價格低廉，因此其臨床應用越來越廣泛［4］。葛根素之于葛根，其成分更加單純，藥效精專，藥理活性也相對較強，現(xiàn)已普遍應用于心腦血管等疾病的治療，葛根素還可抑制醛糖還原酶（AR）的活性［5］，又可抑制脂質（Lipide）的過氧化改變，促使超氧離子的自由基得到消除，因此可用其保護血管內皮，具體應用時應藥理作用與臨床相結合［6-8］。

實驗結果表明：與對照組比較，葛根素溶液的藥物濃度為100、200、300、400 μg/mL時，對人皮膚成纖維細胞的增殖、細胞膜、氧化損傷無影響（P＞0.05）；當葛根素溶液的藥物濃度為500 μg/mL時，在一定程度上可以抑制HDF的增殖，對其細胞膜有一定程度的損傷作用（P＜0.05）。顯示葛根素對HDF的生物學效應與藥物濃度相關，藥物濃度不同，其作用效果也不同。本實驗所得數據，與之前的研究報道（80～400 μg/mL藥物濃度葛根素，可抑制人胚肺成纖維細胞的增生，呈時間和劑量依賴性）所得的實驗結論不同，分析可能是細胞種類不同，對葛根素藥理作用的敏感性不同，實驗結果有所差異［9-11］。

人皮膚成纖維細胞（HDF）是皮膚真皮網織層（reticular layer of dermis）中最重要的細胞，是皮膚受損后的主要修復細胞，在瘢痕組織（scar tissue）的形成中起到重要作用［12］?？梢赃x擇藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，作為干預HDF增殖的作用劑量，對瘢痕組織的治療將起到一定作用?？蓪Ω鸶剡M一步進行瘢痕組織治療效果的研究。

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［5］潘洪平，楊嘉珍，李呂力，等.葛根素注射液對急性血瘀模型大鼠血液流變性改善作用的實驗研究［J］.中國中藥雜志，2013，34 （19）:19.

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（本文編輯：高杉，張震之）

Biological effects of different concentrations of Puerarin solution on human skin fibroblast

YUE Dong-mei1，YAN Bing1，MA Yi-wen2，WANG Yi-min1，MENG Qing-nan1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tanggu Maternity Hospital of Tianjin Binhai New Area，Tianjin 300451，China）

［Objective］To observe biological effects of different concentrations of puerarin solution on proliferation of human skin fibroblasts（HDF）.［Methods］Cultivated human skin fibroblasts in vitro，observed biological effects of puerarin solutions of 100，200，300，400，500 μg/mL five different drug concentrations on HDF.［Results］Compared with control group，drug concentration of 100，200，300，400 μg/mL of puerarin solution had no influence on biological effects of HDF.Drug concentration of 500 μg/mL of puerarin solution inhibited proliferation of HDF，had a certain damage on cell membranes of HDF.［Conclusion］Puerarin solution of 500 μg/mL can inhibit proliferation of HDF and have damage on cell membranes of HDF cultured in vitro，this drug concentration can be used as the dose of HDF intervention，will play a role in treatment of scar tissue.

Puerarin；human skin fibroblasts；drug concentration；biological effect

R285.5

A

1672-1519（2016）05-0311-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.14

國家自然科學基金項目（30873467）。

岳冬梅（1988-），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)工程學研究。

孟慶楠，E-mail：mqn1234@163.com；王益民，E-mail: ylzmyh@163.com。

2015-11-28）