桃核承氣湯對糖尿病大鼠大血管纖維病變Toll樣受體通路作用研究*

徐　陽，王　軍，武海闊

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津　300193）

桃核承氣湯對糖尿病大鼠大血管纖維病變Toll樣受體通路作用研究*

徐陽，王軍，武海闊

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］通過免疫印記法檢測實(shí)驗(yàn)性Ⅱ型糖尿病大鼠下肢股血管中Toll樣受體-2（TLR-2）、Toll樣受體-4 （TLR-4）表達(dá)，并通過觀察桃核承氣湯對相關(guān)指標(biāo)影響，揭示糖尿病大血管纖維化病變的發(fā)病機(jī)制，及中藥桃核承氣湯在糖尿病血管纖維化中的干預(yù)作用。［方法］雄性SD大鼠170只，隨機(jī)分為5組：A-正常對照組（n=30），余140只造糖尿病模型模，造模成功123只，隨機(jī)分為4組：B-模型對照組（n=31）、C-中藥高劑量治療組（n=30）、D-中藥中劑量治療組（n=31）、E-中藥低劑量治療組（n=31）；A組不予藥物干預(yù)，B組每日給予0.9%生理鹽水10 mL/kg灌胃，C組每日給予桃核承氣湯1.8g/kg，D組每日給予桃核承氣湯0.9g/kg，E組每日給予桃核承氣湯0.45g/kg。藥物干預(yù)第1周、12周、20周，按計(jì)劃處死大鼠，各組分別取材，保存標(biāo)本，免疫印記法檢測TLR-2、TLR-4沉積部位及表達(dá)情況。［結(jié)果］TLR-2、TLR-4在糖尿病大鼠股動脈中均顯著表達(dá)，中藥桃核承氣湯干預(yù)可有效降低TLR-2及TLR-4的表達(dá)。［結(jié)論］糖尿病大血管病變可能與Toll樣受體通路有關(guān)，中藥組方桃核承氣湯對糖尿病大血管病變有明顯改善作用，可減緩纖維化進(jìn)程，其干預(yù)作用于用藥劑量和用藥時(shí)間相關(guān)。

大血管纖維化；桃核承氣湯；Toll樣受體2；Toll樣受體-4

糖尿病的發(fā)病率在全球呈快速增長趨勢，其已經(jīng)成為另一大嚴(yán)重影響人類生命質(zhì)量的慢性疾病。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者截肢標(biāo)本中，血管病變是以內(nèi)膜的纖維性增厚為主脂質(zhì)沉積以纖維成分所占比例大［1］。本研究從Toll樣受體（TLRs）通路探討糖尿病血管纖維病變機(jī)制，并闡明活血化瘀藥物干預(yù)糖尿病血管纖維病變機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級雄性SD大鼠170只，2月齡，體質(zhì)量160～200 g，由天津?qū)嶒?yàn)動物中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物桃核承氣湯（桃仁∶大黃∶桂枝∶甘草∶芒硝=2∶2∶1∶1∶1），由天津中醫(yī)藥大學(xué)顆粒劑藥房制作，每克顆粒劑相當(dāng)于生藥10 g，根據(jù)人與大鼠體表面積換算，人桃仁用藥劑量為30 g時(shí)，大鼠的用藥劑量約為每日0.90 g/kg。生理鹽水：天津大家制藥有限公司生產(chǎn)。精蛋白鋅胰島素注射液：400 IU/瓶，由江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器血糖儀：德國羅氏活力型血糖儀。穩(wěn)壓電泳儀：六一儀器，北京。高速離心機(jī)：Sigma，美國。水浴箱：精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，上海。干燥消毒烤箱（DHG-9246A）：精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司，上海。臺式離心機(jī)：Eppendorf公司，德國。轉(zhuǎn)膜儀：六一儀器，北京。灌胃針、注射器、10 mL玻璃瓶、止血鉗、直剪、試管、吸管等。

1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑Toll樣受體-2（TLR-2）一抗：Abcam，英國。Toll樣受體-4（TLR-4）一抗：Abcam，英國。Lysis buffer：Sigma，美國。Western Lightning? -ECL，Enhanced Chemiluminescence Substrate：Perkin Elmer，美國。牛血清白蛋白：Sigma，美國。GAPDH內(nèi)參抗體：賽爾生物，天津。辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記二抗：賽爾生物，天津。DAB顯色試劑盒：中衫金橋，北京。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組造模前分組：A-正常對照組（n= 30）、其余實(shí)驗(yàn)組（n=140）；按計(jì)劃造模，造模意外死亡大鼠9只，另8只大鼠未成模，剔除實(shí)驗(yàn)。造模后分組：A-正常對照組（n=30）、B-模型對照組（n= 31）、C-中藥高劑量治療組（n=30）、D-中藥中劑量治療組（n=31）、E-中藥低劑量治療組（n=31）；其中A組為正常血糖組；B、C、D、E組共123只大鼠非禁食狀態(tài)下血糖維持在25.0 mmol/L左右。

1.2.2實(shí)驗(yàn)干預(yù)所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，A組繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組高脂高糖喂養(yǎng)，誘導(dǎo)胰島素抵抗，4周后，B、C、D、E 4組分別造糖尿病模型。B、C、D、E組共123只大鼠成功制成糖尿病模型后，穩(wěn)定血糖1周，維持非禁食狀態(tài)血糖25.0 mmol/L左右，開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)二階段。

A組不予藥物干預(yù)，B組給予0.9%生理鹽水10mL/（kg·d）灌胃，C組給予桃核承氣湯1.8g/（kg·d），D組給予桃核承氣湯0.9 g/（kg·d），E組給予桃核承氣湯0.45 g/（kg·d）。連續(xù)藥物干預(yù)第1周、12周、20周，按計(jì)劃處死大鼠，各組分別取材，保存標(biāo)本，待動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行下一步檢測分析。

1.3檢測分析

1.3.1取材方法嚴(yán)格按照上述方法飼養(yǎng)，分別于第1、12、20周，每組隨機(jī)選取10只大鼠（數(shù)量不足時(shí)按實(shí)際情況選?。?4 h后，用10%的水合氯醛3 g/kg麻醉，麻醉成功后將大鼠仰臥位固定在大鼠固定板上，先用清水濕潤股內(nèi)側(cè)及腹股溝區(qū)的鼠毛，然后再用剪子剪去鼠毛進(jìn)行備皮，備皮后常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)皮膚。根據(jù)股動脈搏動情況確定股動脈的位置和走行方向，沿股動脈走向縱向切開皮膚，用蚊式鉗鈍性分離組織，以暴露股動脈鞘。分離時(shí)動作要輕柔，不得用刀剪等銳利器械，以防損傷血管和神經(jīng)。股動脈鞘內(nèi)有并行的股動脈、股靜脈、股神經(jīng)，直徑由粗到細(xì)，其中呈粉紅色且觸之有搏動的粗大血管即為股動脈。用眼科鑷順著血管走向鈍性分離股動脈約4～5 cm，兩端剪斷，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，平均分成兩部分，一部分采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，另一部分置于無菌凍存管中，-80℃冰箱保存。

1.3.2標(biāo)本TLR-2、TLR-4免疫印記檢測蛋白印跡（Western blotting）法：1）將組織剪成小塊，并置于勻漿器中。勻漿器中加入適量的含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上作用并不斷的對組織樣本進(jìn)行勻漿處理，收集裂解后的細(xì)胞碎片及釋放出的蛋白。然后利用BSA蛋白定量法對各樣本的蛋白濃度進(jìn)行分析。2）SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白：配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠。取32 μL總蛋白+8 μL的5×Loading Buffer經(jīng)煮沸3min后立即冰置3 min，上樣。100 V電壓電泳。3）電轉(zhuǎn)膜：電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上（Millipore，USA），350 mA，120 min，在4℃進(jìn)行。4）封閉：將硝酸纖維素膜做標(biāo)記以區(qū)分正反面及左右側(cè)，浸入Blotto封閉液中，室溫?fù)u床上輕輕搖動1.5 h。5）與一抗的結(jié)合：在搖床上4℃輕輕搖動過夜。6）在1× TBST中搖動浸洗3次×5 min，洗去非特異結(jié)合的一抗。7）與二抗的結(jié)合：將上膜和下膜分別浸入含相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗的Blotto中，室溫輕輕搖動2 h。8）在1×TBST中搖動浸洗3次×5min，洗去非特異結(jié)合的二抗。9）最后用Western Lightning?-ECL，EnhancedChemiluminescenceSubstrate（PerkinElmer，NEL100001EA）檢測，顯影。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算均用SAS v9.1.3統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±ss）表示，正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較單因素方差分析，偏態(tài)分布計(jì)量資料組間比較Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程順利，各組死亡大鼠共15只：A組1只，B組5只，C組2只，D組3只，E組4只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量為：A組9只，B組6只，C組8只，D組8只，E組7只。

2.1大鼠股動脈TLR-2 Western blotting檢測分析見表1。

表1　各組大鼠股動脈TLR-2比較（±ss）Tab.1　Comparison of TLR-2 from the femoral artery of rat in each group（±ss）

表1　各組大鼠股動脈TLR-2比較（±ss）Tab.1　Comparison of TLR-2 from the femoral artery of rat in each group（±ss）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，；與高劑量組比較，△P＜0.05，；與中劑量組比較，▲P＜0.05，。

組別動物數(shù)　第1周　動物數(shù)　第12周　動物數(shù)　第20周A組　10　0.137±0.054　10　0.053±0.017　9　0.083±0.045 B組　10　0.462±0.105*　10　0.819±0.160*　6　0.846±0.337* C組　10　0.337±0.116*#　10　0.213±0.039*#　8　0.327±0.081*#D組　10　0.380±0.096*△　10　0.364±0.091*#△　8　0.495±0.200*#E組　10　0.457±0.124*△　10　0.618±0.160*△▲　7　0.557±0.282*

實(shí)驗(yàn)第1周：除模型組、中劑量組、低劑量組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)第12周：除模型組與低劑量組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)第20周：除模型組與低劑量組及各中藥組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

用藥1周后高劑量組即可表現(xiàn)出對TLR-2的干預(yù)作用，而用藥至12周，中劑量組與高劑量組均對TLR-2起到的干預(yù)作用，但高劑量組干預(yù)作用較中劑量組明顯。用藥至20周，高劑量組與中劑量組干預(yù)效果相近。

2.2各組大鼠股動脈TLR-4 Western blotting檢測分析見表2。實(shí)驗(yàn)第1周：正常對照組與各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），模型組與各組及各中藥組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)第12周：除模型組與低劑量組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)第20周：除中藥各組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。用藥1周后各中藥組未表現(xiàn)出對TLR-4的干預(yù)作用，而用藥至12周，中劑量組與高劑量組均對TLR-4起到的干預(yù)作用，但高劑量組干預(yù)作用較中劑量組明顯。用藥至20周，各中藥組對TLR-4干預(yù)效果相近。

表2　各組大鼠股動脈TLR-4比較（±ss）Tab.2　Comparison of TLR-4 from the femoralartery of rats in each group（±ss）

表2　各組大鼠股動脈TLR-4比較（±ss）Tab.2　Comparison of TLR-4 from the femoralartery of rats in each group（±ss）

注：與正常組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05；與高劑量組比較△P＜0.05；與中劑量組比較▲P＜0.05。

組別動物數(shù)　第1周　動物數(shù)　第12周　動物數(shù)　第20周A組　10　0.150±0..035　10　0.087±0.023　9　0.085±0.043 B組　10　0.569±0.145*　10　0.843±0.208*　6　1.208±0.256* C組　10　0.434±0.168*　10　0.294±0.113*#　8　0.307±0.121*#D組　10　0.487±0.185*　10　0.469±0.192*#△　8　0.383±0.125*#E組　10　0.504±0.185*　10　0.829±0.258*△▲　7　0.405±0.126*#

2.3各組大鼠TLR-2、TLR-4 Western blotting灰度值觀察及分析見圖1。TLR-2：模型組大鼠TLR-2表達(dá)高于普通對照組（P＜0.05）；中藥干預(yù)1周后，中藥高劑量組TLR-2表達(dá)有所降低（P＜0.05），中藥中劑量組與中藥低劑量組TLR-2表達(dá)未見明顯降低（P＞0.05）；中藥干預(yù)12周后，中藥高劑量組與中藥中劑量組TLR-2表達(dá)明顯降低（P＜0.05），以中藥高劑量組下降較為明顯（P＜0.05），中藥低劑量組TLR-2表達(dá)有所降低（P＜0.05）；中藥干預(yù)20周后，中藥高劑量組TLR-2表達(dá)降低（P＜0.05），中藥中劑量組和中藥低劑量組TLR-2表達(dá)未見明顯降低（P＞0.05）。TLR-4：模型組大鼠TLR-4表達(dá)明顯高于普通對照組（P＜0.05）。中藥干預(yù)1周后，各中藥干預(yù)組TLR-4表達(dá)無明顯降低（P＞0.05）；中藥干預(yù)12周后，中藥高、中劑量組TLR-4表達(dá)明顯降低（P＜0.05），中藥低劑量組TLR-4表達(dá)未見明顯降低（P＞0.05）；中藥干預(yù)20周后，中藥高、中、低劑量組TLR-4表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

圖1　各組大鼠TLR-2、TLR-4 Western blotting灰度值Fig.1　Gray value of TLR-2，TLR-4 of Western blotting of rats in each group

3　討論

前期研究發(fā)現(xiàn)糖尿病足患者血管病變是以內(nèi)膜的纖維性增厚為主，脂質(zhì)沉積以纖維成分所占比例大［2］。TGF-β1、CTGF、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ均在中、晚期糖尿病大鼠的大血管中顯著增加，提示糖尿病大血管病變可能與纖維化有關(guān)［3-4］。

TLRs是近年發(fā)現(xiàn)的先天性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體和病原模式識別受體之一。在TLRs與天然免疫應(yīng)答關(guān)系研究中，倍受關(guān)注的是TLR-2和TLR-4［5］，其在介導(dǎo)腎［6］、心［7］、肝［8］、肺［9］、皮膚［10］等多種組織器官纖維化進(jìn)程中起十分重要的作用，可能是最主要的致纖維化細(xì)胞因子［11-12］。TLRs在動脈纖維化過程中可能起著“分子開關(guān)”的重要作用［13-16］。

桃核承氣湯出自張仲景《傷寒論》，桃核承氣湯可以通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）的含量和抑制一氧化氮合酶（NOS）的基因表達(dá)，增強(qiáng)抗自由基的作用，起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用［17-18］，也可以加抑制肝纖維化大鼠TGFβ1的表達(dá)，達(dá)到抗肝纖維化作用［19］。桃核承氣湯對膠原的降解作用增強(qiáng)，使基質(zhì)合成和降解向平衡方向發(fā)展［20］，進(jìn)而達(dá)到降低血管纖維化的目的。預(yù)示通過活血化瘀藥物干預(yù)，有逆轉(zhuǎn)糖尿病大血管纖維化病變這一發(fā)展過程的可能性。

TLR-2、TLR-4在糖尿病大鼠股動脈中均顯著表達(dá)，提示糖尿病大鼠大血管的纖維病變可能與Toll樣受體通路開放及TLR-2、TLR-4高表達(dá)有關(guān)。中藥桃核承氣湯干預(yù)可有效降低TLR-2及TLR-4的表達(dá)，可明顯改善大血管病變情況，減緩纖維化進(jìn)程，其干預(yù)作用于用藥劑量和用藥時(shí)間相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，中藥桃核承氣湯干預(yù)12周時(shí)，各不同劑量組間TLR-2及TLR-4降低存在差異，以高劑量組降低最為明顯，但干預(yù)20周時(shí)各不同劑量組間TLR-2及TLR-4降低差異消失，表明中藥干預(yù)可能存在一定藥效蓄積作用，這也為我們的進(jìn)一步研究提供了方向。

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（本文編輯：馬英，張震之）

Study of Taohe Chengqi Tang on Toll-like receptor passage in diabetic vascular fibrosis with rats

XU Yang，WANG Jun，WU Hai-kuo
（The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Using Western blotting to detect the expression of TLR-2，TLR-4 which from the diabetes rats in lower limb femoral vessels，and observing by Taohe Chengqi Tang（THCQT）impact on related indicators，revealing intervention mechanisms of THCQT on diabetic vascular fibrosis.［Methods］The 170 male SD rats were divided into five groups，A-the normal control group（n=30），other 140 making diabetes model and succeed 123，randomly divided into 4 groups：B-model control group（n=31），C-Chinese high-dose treatment group（n=30），D-medicine dose treatment group（n=31），E-low dose treatment group（n=31）.A group was no drug intervention，group B received 0.9%saline 10 mL/（kg·d）orally，group C was given THCQT 1.8 g/kg，D group was given THCQT 0.9 g/kg，E group was given THCQT 0.45 g/kg.Drug intervention first weeks，12 weeks，20 weeks，the rats were sacrificed according to plan，the groups were drawn，preserved specimens，Western blotting detection TLR-2 and TLR-4 expression.［Results］TLR-2 and TLR-4 has significant expression in diabetic rat femoral artery，TCD THCQT can effectively reduce the expression of TLR-2 and TLR-4.［Conclusion］Diabetic vascular disease may be associated with Toll-like receptor pathway and apoptosis，TCD THCQT can obviously improve diabetic vascular lesions，and slow down the fibrosis process，its intervention effect associated with dosage and duration.

macrovascular fibrosis；THCQT；Toll-like receptor-2；Toll-like receptor-4

R587.1

A

1672-1519（2016）05-0299-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173268）。

徐陽（1982-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)糖尿病足與周圍血管病相關(guān)研究工作。

2015-12-20）