參竹精片協(xié)同戊巴比妥鈉對小鼠睡眠及5-HT的影響*

趙宏杰，樊官偉，羅毅楊，高笑雨，齊　記，柳占彪，郭利平

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津　300193）

參竹精片協(xié)同戊巴比妥鈉對小鼠睡眠及5-HT的影響*

趙宏杰，樊官偉，羅毅楊，高笑雨，齊記，柳占彪，郭利平

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津300193）

［目的］觀察參竹精片對睡眠的影響。［方法］選昆明小鼠隨機分為正常對照組、參竹精片0.5、0.25、0.125 g/kg組，分別單次灌胃給藥和連續(xù)7 d給藥，末次給藥后2 h，各組小鼠分別以30 mg/kg（閾下劑量）和50 mg/kg（閾劑量）腹腔注射戊巴比妥鈉，觀察小鼠入睡時間、入睡率及睡眠時間，測定腦干組織5-羥色胺（5-HT）、5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）含量。［結(jié)果］與正常組比較，單次灌胃給藥和連續(xù)7 d給藥，參竹精片可明顯增加戊巴比妥鈉（閾下劑量）致小鼠的入睡率（0.5 g/kg，P＜0.05），減少戊巴比妥鈉（閾劑量）致小鼠的入睡時間（P＜0.01），延長睡眠時間（P＜0.01），增加腦干組織5-HT含量（P＜0.05）。［結(jié)論］參竹精片可促進腦組織分泌5-HT，減少入睡時間、提高入睡率、延長睡眠時間，具有一定改善睡眠的作用。

失眠；參竹精片；5-HT

失眠是嚴(yán)重危害身心健康的常見疾病，老年人因體衰，氣血不足，多為虛證失眠。參竹精片由手掌參、黃精、玉竹、何首烏（制）、廣棗組成，具有補腎強身，治療筋骨酸痛、年邁體弱的作用，臨床上對老年失眠患者具有較好療效。本研究擬觀察參竹精片對睡眠的影響。

1　實驗材料

1.1動物昆明小鼠，體質(zhì)量（30±2）g，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2012-0001，出廠合格證號為11400700104548。

1.2藥物參竹精片，將手掌參、黃精、玉竹、何首烏（制）、廣棗混合，經(jīng)水提、過濾、干燥制成片劑。元和藥業(yè)股份有限公司提供（批號：20140901）。

1.3試劑戊巴比妥鈉 （國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：WS20051129），5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA，Alfa Aesar公司，批號：140737），5-羥色胺（5-HT，Sigma Aldrich公司，批號：111656），OSA（Adamas Reagent Co.，Ltd.批號：P03898），乙二胺四乙酸二鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20130406），磷酸二氫鉀（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：20131120），甲醇（天津康科德有限公司，批號：20130318），乙腈（天津康科德有限公司批號：20140523）。

1.4儀器JA1003型電子天平（上海天平儀器廠），35900E型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），ALU98G17型高速離心機（BECKMAN INSTRUMENTS.INC），VCX130型 超 聲 破 碎 儀（SONICS&MATERIALS.INC），多參數(shù)測試儀（梅特勒托利多儀器上海有限公司），GM-0.33型隔膜真空泵（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司），KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2　實驗方法

2.1參竹精片單次給藥對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠的影響選昆明小鼠96只，雌性，將小鼠稱質(zhì)量、編號，并按體質(zhì)量順序從低到高排列，將正常組，參竹精片0.5、0.25、0.125 g/kg組做成4個標(biāo)簽，每個編號小鼠依次抽簽分組，每組24只，給藥組按照設(shè)定劑量，單次灌胃給藥后2 h，每組選12只小鼠以30 mg/kg（閾下劑量）腹腔注射戊巴比妥鈉，以小鼠翻正反射消失1 min以上為入睡指標(biāo)，觀察小鼠入睡數(shù)量，計算入睡率。另12只小鼠以50 mg/kg（閾劑量）腹腔注射戊巴比妥鈉，觀察小鼠入睡時間和睡眠時間。各組小鼠清醒后，脫頸處死，剖解，取腦干組織，勻漿，離心，取上清液，備用。

2.2參竹精片7 d給藥對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠的影響選昆明小鼠96只，雌性，將小鼠稱質(zhì)量、編號，并按體質(zhì)量順序從低到高排列，將正常組，參竹精片0.5、0.25、0.125 g/kg組做成4個標(biāo)簽，每個編號小鼠依次抽簽分組，每組24只，給藥組按照設(shè)定劑量，灌胃，連續(xù)7 d，末次給藥后2 h，每組選12只小鼠以30 mg/kg（閾下劑量）腹腔注射戊巴比妥鈉，以小鼠翻正反射消失1 min以上為入睡指標(biāo)，觀察小鼠入睡數(shù)量，計算入睡率。另12只小鼠以50 mg/kg（閾劑量）腹腔注射戊巴比妥鈉，觀察小鼠睡眠潛伏時間和睡眠時間。各組小鼠清醒后，脫頸處死，剖解，取腦干組織，勻漿，離心，取上清液，備用。

2.3腦干組織樣本5-HT和5-HIAA含量測定采用高效液相電化學(xué)法檢測。先繪制5-HT和5-HIAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后取腦干組織，解凍，溶解，加入0.1 mmol/L高氯酸溶液稀釋，分別抽取10 μL注入HPLC系統(tǒng)，觀察記錄各樣本5-HT、5-HIAA的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本5-HT和5-HIAA的含量。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件統(tǒng)計，入睡時間、睡眠時間及5-HT和5-HIAA用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±ss）表示，正態(tài)分布計量資料組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布計量資料組間比較采用秩和檢驗，計數(shù)資料用率表示，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1對戊巴比妥鈉閾下劑量致小鼠睡眠的影響見表1。

表1　對戊巴比妥鈉閾下劑量致小鼠睡眠的影響Tab.1　The effects of sodium pentobarbitalat at the dose of 30 mg/kg-induced hypnosis

由表1、表2可知，用參竹精片連續(xù)7天灌胃給藥，可明顯增加戊巴比妥鈉閾下劑量時睡眠小鼠的數(shù)量（0.5 g/kg，P＜0.05），用參竹精片單次灌胃給藥和連續(xù)7天灌胃給藥可增加腦干組織5-HT含量（0.5g/kg，P＜0.05），結(jié)果提示參竹精片通過促進5-HT含量增加，可提高戊巴比妥鈉所致小鼠的入睡時間和睡眠時間，具有一定協(xié)同和促進睡眠的作用。

3.2對戊巴比妥鈉閾劑量致小鼠睡眠的影響由表3、表4可知，用參竹精片單次灌胃給藥，可明顯增加戊巴比妥鈉閾劑量時小鼠的入睡時間（0.25g/kg，0.125 g/kg，P＜0.05）和睡眠時間（0.5、0.25、0.125 g/kg，P＜0.05），增加腦干組織5-HT含量（0.5 g/kg，P＜0.05），用參竹精片連續(xù)7 d灌胃給藥，入睡時間雖無明顯改變（P＞0.05），但睡眠時間明顯延長（0.5 g/kg，P＜0.01，0.25 g/kg，P＜0.05），腦干組織5-HT含量增加，（0.25 g/kg，P＜0.05），結(jié)果提示參竹精片通過促進5-HT含量增加，促進戊巴比妥鈉所致小鼠的入睡時間和睡眠時間，具有一定改善睡眠的作用。

表2　對戊巴比妥鈉閾下劑量致小鼠腦干組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響（±ss）Tab.2　The effects of sodium pentobarbital at the dose of 30 mg/kg-induced neurotransmitter in the brain stem of mice（±ss）ng/g

表2　對戊巴比妥鈉閾下劑量致小鼠腦干組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響（±ss）Tab.2　The effects of sodium pentobarbital at the dose of 30 mg/kg-induced neurotransmitter in the brain stem of mice（±ss）ng/g

注：ANOVA檢驗，與正常組比較*P＜0.05。

組別　單次給藥5-HIAA　5-HT正常組　624.36±34.34　303.01±106.19參竹精片0.5 g/kg　635.63±283.85　451.17±185.85*參竹精片0.25 g/kg　1 152.74±999.36　270.77±78.53參竹精片0.125 g/kg　1 067.19±747.94　385.82±155.7組別　7 d給藥5-HIAA　5-HT正常組　1 661.32±383.32　331.69±114.91參竹精片0.5 g/kg　1 421.64±308.47　473.55±180.83*參竹精片0.25 g/kg　1 387.50±229.19　451.78±55.41參竹精片0.125 g/kg　1 749.64±569.21　379.57±83.15

表3　對戊巴比妥鈉閾劑量致小鼠睡眠的影響（±ss）Tab.3　The effects of sodium pentobarbital at the dose of 50 mg/kg-induced hypnosis（±ss）min

表3　對戊巴比妥鈉閾劑量致小鼠睡眠的影響（±ss）Tab.3　The effects of sodium pentobarbital at the dose of 50 mg/kg-induced hypnosis（±ss）min

注：ANOVA檢驗，與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別　單次給藥　7 d給藥入睡時間　睡眠時間　入睡時間　睡眠時間正常組　4.44±1.81　59.11±18.93　6.78±6.28 30.44±13.85參竹精片0.5 g/kg　4.30±0.82　93.00±22.02**7.09±5.45 78.64±32.55**參竹精片0.25 g/kg　3.17±0.83**88.25±23.22**5.55±4.76 57.09±24.59*參竹精片0.125 g/kg　3.00±0.77**87.91±17.41**8.27±10.26 51.64±27.67

4　討論

戊巴比妥鈉屬于巴比妥類鎮(zhèn)靜催眠藥，隨著用藥劑量的增加可依次表現(xiàn)出鎮(zhèn)靜、催眠、麻醉、呼吸抑制、心功能抑制等多種藥理效應(yīng)。戊巴比妥鈉的作用機制之一是調(diào)節(jié)腦內(nèi)GABAA受體（γ-氨基丁酸A型受體）功能［1］。判定受試藥是否具有改善睡眠功能，現(xiàn)代藥理實驗方法一般通過觀察受試藥對巴比妥類藥物誘導(dǎo)睡眠的影響，觀察受試藥是否能協(xié)同戊巴比妥鈉的作用，使小鼠入睡數(shù)目增加，縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間，以上3項結(jié)果中兩項呈陽性者，即可判定受試藥具有改善睡眠功能［2-3］。本研究結(jié)果顯示，參竹精片可增加戊巴比妥鈉閾下劑量時睡眠小鼠的數(shù)量，增加閾劑量時小鼠的睡眠潛伏時間和睡眠時間，3項實驗結(jié)果均為陽性，結(jié)果表明參竹精片具有改善睡眠的功能。

表4　對戊巴比妥鈉閾劑量致小鼠腦干組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響（±ss）Tab.4　The effects of sodium pentobarbital at the dose of 50 mg/kg-induced neurotransmitter in the brain stem of mice（±ss）ng/g

表4　對戊巴比妥鈉閾劑量致小鼠腦干組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響（±ss）Tab.4　The effects of sodium pentobarbital at the dose of 50 mg/kg-induced neurotransmitter in the brain stem of mice（±ss）ng/g

注：ANOVA檢驗，與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

7 d給藥5-HIAA　5-HT　5-HIAA　5-HT正常組　1 980.63±689.10　519.81±71.82　2 104.08±　580.35　277.27±84.03參竹精片0.5 g/kg　1 863.94±388.32　681.23±117.81**　3 456.93±1 209.30　284.58±37.49參竹精片0.25 g/kg　1 826.15±420.54　556.29±92.48　2 356.26±1 288.35　367.99±92.75*參竹精片0.125 g/kg　1 837.22±490.60　526.58±46.92　2 662.20±1 343.02　291.50±93.83組別　單次給藥

失眠癥屬蒙醫(yī)“身、心、語”功能紊亂而引起人體“三根”平衡失調(diào)而導(dǎo)致的“赫依”病。治療的關(guān)鍵在于調(diào)節(jié)“三根”平衡，疏通筋脈，促使機體歸于“三根七素”相對平衡狀態(tài)，恢復(fù)正常生理功能［4］。參竹精片由手掌參、黃精、玉竹、何首烏（制）、廣棗組成，方中手掌參具有補益氣血，生津止渴；玉竹、黃精具有補中益氣，潤心肺，強筋骨，潤燥，止渴；制何首烏具有補肝、益腎、養(yǎng)血生精；廣棗具有行氣活血，養(yǎng)心安神［5］；方中諸藥配伍，通過健脾、補腎、養(yǎng)肝生津作用，加強了機體的分解與吸收功能；通過補益氣血、行氣活血，使機體過?！昂找馈奔涌旆纸馀判梗瑥亩鸬金B(yǎng)心安神，改善睡眠的作用。

失眠是人體最為常見的睡眠-覺醒節(jié)律紊亂［6］，導(dǎo)致失眠的相關(guān)因素繁多。近年來，研究表明睡眠是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種主動的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)某些特定結(jié)構(gòu)及中樞神經(jīng)遞質(zhì)的作用關(guān)系密切［7］。5-HT是腦內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可能參與痛覺睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)［8］。5-HT主要分布在腦干背側(cè)中線附近的中縫核等處，多呈抑制效應(yīng)［9］。改善睡眠作用與5-HT具有相關(guān)性［10］。動物腦內(nèi)5-HT水平的減少可引起失眠，5-HT也能夠引起睡眠的發(fā)生而用于失眠的治療［11］。破壞5-HT能神經(jīng)末梢或抑制色胺酸羥化酶的作用會阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，外在表現(xiàn)失眠狀態(tài)［12］。Jouve等也發(fā)現(xiàn)破壞貓的中縫核5-HT能神經(jīng)元或者利用神經(jīng)毒素選擇性破壞5-HT能神經(jīng)末梢，都能夠使腦內(nèi)5-HT水平下降，動物出現(xiàn)不同程度的失眠。給大鼠中縫背核微量注射對氯苯丙氨酸，減少5-HT的合成，能夠使動物出現(xiàn)失眠癥狀［13］。Fischer等［14］將5-羥色氨酸用于治療1例嚴(yán)重失眠患者，癥狀得到一定程度的改善。楊岑等［15］認(rèn)為5-HT是一種促進睡眠的物質(zhì)，腦內(nèi)高水平的5-HT是睡眠發(fā)生所必需的。本研究結(jié)果顯示，用參竹精片單次和連續(xù)7 d灌胃給藥，在增加睡眠小鼠數(shù)量、入睡時間和睡眠時間的同時，腦干組織5-HT含量增加，結(jié)果表明參竹精片可能通過促進5-HT含量增加，起到改善睡眠的作用。

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（本文編輯：高杉，張震之）

Effects of Shenzhujing tablets for sodium pentobarbital-induced hypnosis in mice

ZHAO Hong-jie，F(xiàn)AN Guan-wei，LUO Yi-yang，GAO Xiao-yu，QI Ji，LIU Zhan-biao，GUO Li-ping
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the effects of Shenzhujing tablets on sodium pentobarbital-induced hypnosis.［Methods］The 96 of Kunming mice were randomly divided into 4 groups:normal group，and Shenzhujing tablet（0.5，0.25，0.125 g/kg）groups.The drugs were administrated orally in single doses to 12 of the mice in each group 2 h before the intraperitoneal injection of sodium pentobarbital at the dose of 30 mg/kg or 50 mg/kg，respectively.Then the mice received daily oral treatments of drugs for 7 days.Similarly，Sodium pentobarbital-induced hypnosis tests were also used 2 h after the last administration of the drugs.The sleep latency and sleep duration during pentobarbital-induced sleep were measured and the ratios of sleep mice to non-sleep mice were counted in mice after oral administration of the drugs.Moreover，the contents of the 5-hydroxytryptamine（5-HT）and 5-hydroxyindoleacetic acid（5-HIAA）in the brain stem were determined.［Results］Compared with normal group，Shenzhujing tablets significantly prolonged the pentobarbitalinduced sleep duration and decrease sleep latency at dose of 0.5 g/kg（P＜0.05），increase the ratios of sleep mice（P＜0.01）to non-sleep mice and the contents of 5-HT in the brain stem under the condition of 30 mg/kg of sodium pentobarbital（P＜0.05）.［Conclusion］Shenzhujing tablets possess sedative-hypnotic activity possibly by promoting the secretion of 5-HT in the brain and might be effective agents for treatment of insomnia.

insomnia；Shenzhujing tablet；5-HT

R285.5

A

1672-1519（2016）05-0307-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.13

天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地。

趙宏杰（1990-），女，碩士，研究方向為全科醫(yī)學(xué)。通訊作者：柳占彪，E-mail：634256747@qq.com；郭利平，E-mail：lpgtjn@163.com。

2016-03-20）