蟲草素抗炎作用及機(jī)制研究*

李　暉，孫佳瑜，廖康漢，王　喆，單愛(ài)云

（1.深圳市南山區(qū)醫(yī)院，深圳　518067；2.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，深圳　518033；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙　410013）

·中藥研究·

蟲草素抗炎作用及機(jī)制研究*

李暉1，孫佳瑜2，廖康漢1，王喆3，單愛(ài)云2

（1.深圳市南山區(qū)醫(yī)院，深圳518067；2.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，深圳518033；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410013）

［目的］研究蟲草素抗炎作用及機(jī)制。［方法］通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)研究蟲草素不同劑量（50、100、200 mg/kg）對(duì)耳腫脹的抑制作用，在細(xì)胞水平研究蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧酶-2（COX-2）表達(dá)和一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）產(chǎn)生的影響。［結(jié)果］蟲草素（200 mg/kg）能夠抑制二甲苯致小鼠耳腫脹（P＜0.05）和耳片中一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的產(chǎn)生（P＜0.05）。在細(xì)胞水平蟲草素（25、50 μmol/L）能夠抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧酶-2（COX-2）表達(dá)（P＜0.05），一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的產(chǎn)生（P＜0.05）。［結(jié)論］蟲草素具有抗炎作用。

蟲草素；抗炎；一氧化氮；前列腺素E2；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；環(huán)氧酶-2

蟲草素即3'-脫氧腺苷（3'-deoxyadenosine）為核苷酸的衍生物，屬于嘌呤堿，天然存在于冬蟲夏草和蛹蟲草（北蟲草）中，是主要活性成分，為白色針片狀結(jié)晶，其分子量為251.24。由蘇格蘭科學(xué)家Cunningham等在1951年首次從蛹蟲草原漿液中分離得到［1］，自從蟲草素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行廣泛研究，發(fā)現(xiàn)蟲草素具有廣泛藥理作用和生物活性，研究中發(fā)現(xiàn)蟲草素具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種藥理作用［2-7］，對(duì)于蟲草素的研究與開發(fā)，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，筆者主要通過(guò)建立體內(nèi)外炎癥模型研究蟲草素抗炎作用和相應(yīng)機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)藥品、材料與動(dòng)物

1.1藥品與試劑主要化學(xué)藥品和試劑蟲草素（C3394，Sigma公司，美國(guó)），脂多糖（055：B5 L4005 sigma公司美國(guó)），前列腺素 E2檢測(cè)試劑盒（minneapolis，MN，美國(guó)），一氧化氮檢測(cè)試劑盒（南京建成），COX-2和iNOS一抗（CST，美國(guó)），二抗和β-actin（Santa cruz，美國(guó)），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（Corning，美國(guó)），胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞BALB/c小鼠，50只，體質(zhì)量18～22 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)。隨機(jī)分籠飼養(yǎng)。巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞購(gòu)買于協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組將50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為五組，分別為對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組、蟲草素高、中、低劑量組，給藥途徑為腹腔注射，對(duì)照組給等體積的生理鹽水、陽(yáng)性藥物為賴氨匹林給藥劑量為100mg/kg，蟲草素高、中、低給藥分別為50、100、200 mg/kg，蟲草素超聲溶解在生理鹽水中，每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2二甲苯致小鼠耳腫脹各組小鼠末次給藥后0.5 h，用二甲苯（200 μL/耳）均勻涂抹于小鼠右耳廓內(nèi)外兩側(cè)致急性炎癥，20 min后用小鼠耳廓打孔器將小鼠左右耳沖下等面積耳片，稱質(zhì)量后以自身的右左耳質(zhì)量之差表示腫脹度。

腫脹度=自身右耳片質(zhì)量-自身左耳片質(zhì)量

2.3耳片組織中NO和PGE2的含量測(cè)定將各組沖下來(lái)的耳片組織液氮冷凍后加入適量PBS仔細(xì)研磨，低溫離心取上清［8］，分別檢測(cè)研磨后組織上清液中NO和PGE2的含量。

2.4蟲草素對(duì)NO和PGE2產(chǎn)生的影響將RAW264.7細(xì)胞按密度5×106/孔平均鋪于6孔板中，24 h后將不同濃度蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）和LPS（2 μg/mL）共孵育12 h，取細(xì)胞上清液，測(cè)其上清液中NO和PGE2的含量［8］，測(cè)定每孔細(xì)胞總蛋白量作為對(duì)比。

2.5蟲草素對(duì)iNOS和COX-2表達(dá)的影響將RAW264.7細(xì)胞按密度5×106/mL平均鋪于6 cm平皿中，24 h后將不同濃度蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）和LPS（2 μg/mL）共孵育12 h后，提取每皿細(xì)胞總蛋白用免疫印跡檢測(cè)iNOS和COX-2的表達(dá)情況［9］。

3　數(shù)據(jù)處理

4　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1蟲草素對(duì)小鼠耳腫脹的影響二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性藥物賴氨匹林100 mg/kg給藥后小鼠耳腫脹度為（6.21±1.81）mg（P＜0.01）；蟲草素低、中、高3個(gè)劑量（50、100、200 mg/kg）后小鼠耳腫脹度分別為（12.34±1.58）mg、（11.67±1.73）mg和（6.92± 1.82）mg（P＜0.05）；蟲草素高劑量組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與陽(yáng)性藥物賴氨匹林作用大致相當(dāng)，但中低劑量組對(duì)其腫脹沒(méi)有抑制作用，見圖1。

圖1　蟲草素對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用Fig.1　Inhibitory effects of Cordycepin on xylene-induced ear swelling in mice

4.2蟲草素對(duì)小鼠耳片中NO和PGE2含量的影響取耳片組織勻漿后上清液，檢測(cè)上清液中的NO和PGE2含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腹腔注射賴氨匹林100 mg/kg后小鼠耳片中NO的含量為（8.14± 1.35）μmol/g（P＜0.05），PGE2的含量為（122.45± 8.72）mg/L（P＜0.01）；蟲草素低、中、高3個(gè)劑量（50、100、200 mg/kg）腹腔注射后小鼠耳片中NO分別為（14.25±1.81）μmol/g、（13.13±1.25）μmol/g和（9.15± 1.67）μmol/g（P＜0.05），見圖2，PGE2的含量分別為（238.52±13.54）mg/L、（222.17±10.12）mg/L、（132.15± 12.17）mg/L（P＜0.05）（見圖3），蟲草素低、中劑量組對(duì)NO和PGE2的影響與模型組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量組與陽(yáng)性藥物大致相當(dāng)。

4.3蟲草素對(duì)細(xì)胞NO和PGE2產(chǎn)生的影響LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，NO和PGE2的含量分別為（45.26±2.53）μmol/L和（90.96±2.68）mg/L與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。蟲草素3個(gè)劑量（12.5、25、50 μmol/L）給藥后NO的含量分別為（40.7±2.35）μmol/g、（29.35±2.18）μmol/g（P＜0.05）和（22.13±2.95）μmol/g（P＜0.01），低劑量組的蟲草素與模型組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖4）；PGE2的含量分別為（88.27±2.93）mg/L、（60.97±2.51）mg/L （P＜0.05）和（50.13±2.62）mg/L（P＜0.05），低劑量組的蟲草素與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖5）。

圖2　蟲草素對(duì)小鼠耳片一氧化氮的抑制作用Fig.2　Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in mice ear

圖3　蟲草素對(duì)小鼠耳片前列腺素E2的抑制作用Fig.3　Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2 production in mice ear

4.4蟲草素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)iNOS和COX-2表達(dá)的影響LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，其iNOS和COX-2表達(dá)量與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。不同濃度的蟲草素（12.5、25、50 μmol/L）與LPS共刺激RAW264.7細(xì)胞后，中高劑量組與LPS刺激的模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），結(jié)果提示蟲草素能夠抑制與炎癥相關(guān)的iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)。見圖6，圖7。

圖4　蟲草素對(duì)RAW264.7細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生抑制作用Fig.4　Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in RAW264.7 macrophages

圖5　蟲草素對(duì)RAW264.7細(xì)胞前列腺素E2產(chǎn)生抑制作用Fig.5　Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2production in RAW264.7 macrophages

5　討論

圖6　RAW264.7細(xì)胞蟲草素對(duì)iNOS表達(dá)的影響Fig.6　Effects of Cordycepin on iNOS expression in RAW264.7 macrophages

圖7　RAW264.7細(xì)胞蟲草素對(duì)COX-2表達(dá)的影響Fig.7　Effects of Cordycepin on COX-2 expression in RAW264.7 macrophages

蟲草素又稱蛹蟲草菌素，是冬蟲夏草和蛹蟲草里的活性成分，也是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的核苷類抗生素，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性［10］，自從蟲草素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其廣泛的藥理作用和生物活性成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，開發(fā)前景廣闊。炎癥是機(jī)體對(duì)于致炎因子的防御性反應(yīng)，炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與的一些列的病理生理反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)中毛細(xì)血管通透性增加，炎性細(xì)胞趨化游走，炎性介質(zhì)釋放［11］。在炎癥反應(yīng)中，NO和PGE2是重要的炎性介質(zhì)，參與和介導(dǎo)炎性反應(yīng)，過(guò)量的產(chǎn)生NO和PGE2都會(huì)加重炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷。研究認(rèn)為NO是體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，參與包括有血管舒張、血小板聚集、神經(jīng)傳遞、抗癌抗菌等過(guò)程，尤其是在炎癥反應(yīng)中能夠介導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1等，具有細(xì)胞毒作用加劇炎癥反應(yīng)［12-13］，PGE2是重要的炎癥介質(zhì)之一，在炎癥早期，PGE2能夠促進(jìn)血管舒張和增加神經(jīng)對(duì)疼痛的敏感性，會(huì)增加炎癥組織水腫和疼痛，同時(shí)也會(huì)增加其他炎癥介質(zhì)的作用如緩激肽的作用［14-15］，目前普遍認(rèn)為NO和PGE2均參與炎癥反應(yīng)，加重炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，與急慢性炎癥有密切的關(guān)系［16-17］，因此，抑制NO和PGE2的產(chǎn)生能夠抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥對(duì)機(jī)體的損傷，是抗炎的主要途徑之一。iNOS和COX-2是產(chǎn)生NO和PGE2的限速酶［9］，抑制iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)，能夠抑制了NO和PGE2的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。本研究中通過(guò)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹建立急性炎癥模型，給予濃度梯度蟲草素發(fā)現(xiàn)能夠抑制小鼠的耳腫脹以及炎性組織中NO和PGE2的產(chǎn)生，提示蟲草素具有抑制炎癥的作用，同時(shí)在RAW264.7細(xì)胞上，用LPS刺激建立細(xì)胞炎癥模型，給予蟲草素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示蟲草素能夠抑制炎性相關(guān)蛋白iNOS和COX-2的表達(dá)和NO和PGE2的產(chǎn)生，綜上所述，提示蟲草素具有抗炎作用，蟲草素的抗炎作用可能是通過(guò)抑制iNOS和COX-2的表達(dá)和相應(yīng)的NO和PGE2的介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)研究表明蟲草素具有抗炎的作用，這為蟲草素的進(jìn)一步的研究與開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

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（本文編輯：高杉，張震之）

Anti-inflammatory effect and mechanism study of Cordycepin

LI Hui1，SUN Jia-yu2，LIAO Kang-han1，WANG Zhe3，SHAN Ai-yun2
（1.Shenzhen Nanshan District Hospital，Shengzhen 518067，China；2.Shenzhen Futian District Traditional Chinese Medicine Hospital，Shengzhen 518033，China；3.Central South University Xiangya School of Medicine，Changsha 410013，China）

［Objective］To study the anti-inflammatory effect of Cordycepin.［Methods］By Xylene induce ear swelling test in mice，the inhibition of Cordycepin（50，100，200 mg/kg）was evaluated for ear swelling.At the cellular level，the effect of Cordycepin（12.5，25，50 μmol/L）was evaluated for iNOS and COX-2 expression，NO and PGE2production.［Results］Cordycepin（200 mg/kg）inhibited ear swelling of mice（P＜0.05），NO and PGE2production in mouse ear piece（P＜0.05）.At the cellular model，Cordycepin（25，50 μmol/L）inhibited iNOS and COX-2 expression（P＜0.05），NO and PGE2production（P＜0.05）.［Conclusion］Cordycepin have anti-inflammatory effect.

Cordycepin；anti-inflammation；NO；PGE2；iNOS；COX-2

R285.5

A

1672-1519（2016）05-0303-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81470016），深圳市科技研發(fā)基金項(xiàng)目（NJCYJ20140414145007216）。

李暉（1982-），男，主管藥師，主要從事中藥藥理研究。

單愛(ài)云，E-mail:1348903@qq.com

2016-02-23）