珂字棉312組織培養(yǎng)體系的建立

鄒甜 鄭順利 匡琛 周仲華

摘要：以珂字棉312為試驗材料，以無菌苗的下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷，并將愈傷組織置于不同培養(yǎng)基下誘導(dǎo)分化，初步建立棉花組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：一是對珂字棉312組織培養(yǎng)體系建立較好的各階段培養(yǎng)基分別是愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+30 g/L 葡萄糖+8 g/L瓊脂，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS +30 g/L葡萄糖+2.5 g/L phytagell，分化培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IAA +30 g/L葡萄糖+2.5 g/L phytagell，生根培養(yǎng)基為MSB5 （雙倍KNO3，無NH4NO3）+0.1 mg/L GA3 +30 g/L葡萄糖+2.5 g/L phytagell；二是各培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為28℃時能夠獲得植株再生體系。

關(guān)鍵詞：棉花；珂字棉312；組織培養(yǎng)

中圖分類號： S562. 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號：2095-3143（2016）04-0003-05

Abstract： Using the Coker 312 cotton cultivar as experimental material， We took its aseptic seedlings hypocotyl as explant for callus induction， then took the callus into different culture medium for inducing differentiation and preliminarily built cotton tissue culture system. The results showed： first， the better culture mediums for the estabishment of the tissue culture system of Coker 312 in each stage were respectively that the callus-inducing medium was MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+30 g/L glucose+8 g/L agar， Induction medium of embryogenic callus was MS+30 g/L glucose +2.5 g/L phytagel， differential medium was MS+0.1 mg/L IAA +30 g/L glucose +2.5 g/L phytagel， rooting medium was MSB5 （double KNO3， without NH4NO3）+0.1 mg/L GA3 +30 g/L glucose +2.5 g/L phytagel； second， the suitable pH value and culture temperature of culture medium for obtaining plant regeneration system were respectively 5.8 and 28 ℃.

Key words： Cotton； Coker 312； Tissue culture

0 引言

棉花組織培養(yǎng)技術(shù)自Price和Smith在1979年第一次報道以來發(fā)展較快，目前已經(jīng)建立了多個不同棉花品種的再生培養(yǎng)體系，例如謝德意，等[1]在2007年建立了鄂抗棉3號、鄂抗棉5號、鄂棉20、鄂棉23、豫棉9號、豫早73、豫棉12、豫棉1221等8個品種植株再生體系；孫京燕，等[2]在2009年建立了一套簡便高效的低酚陸地棉直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生組織培養(yǎng)體系；羅曉麗，等[3]建立了晉棉5號、中棉所27和遼棉10號等3個早熟棉品種的再生組織培養(yǎng)體系；周晶，等[4]建立了新陸早19號和新陸早23號的再生組織培養(yǎng)體系；劉麗，等[5]通過對新陸早32號和新陸早33號的誘導(dǎo)研究，建立了它們的再生組織培養(yǎng)體系。棉花是被公認(rèn)的較難分化的一種材料[6]，到目前為止還有較多的棉花品種沒有建立一套有效的組織培養(yǎng)再生體系，而棉花組織培養(yǎng)技術(shù)是棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個平臺，因此，研究棉花組織培養(yǎng)可以促進棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為珂字棉312，由國家棉花種質(zhì)資源中期庫提供。

1.2 培養(yǎng)基的配制 基本培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基和MSB5培養(yǎng)基，先將其配制成母液，保存于4℃冰箱中備用。

1.2.1基本培養(yǎng)基的配制 ①大量元素母液的配制：稱取19 g KNO3、16.5 g NH4NO3、3.7 g MgSO4·7H2O、1.7 g KH2PO4依次溶解，將4.4 g CaC12·2H2O單獨溶解后再跟上述溶液混勻，最后定容至0.5 L，冷藏保存?zhèn)溆?。如配? L MS，只需吸取該母液50 mL。②微量元素母液的配制：稱取3.38 g MnSO4·H2O、1.72 g ZnSO4·7H2O、1.24 g H3BO3、0.16 g KI、0.05 g Na2MnO4·2H2O、0.005 g CuSO4·5H2O、0.005 g CoC12·6H2O，逐一溶解，因為CuSO4·5H2O和CoC12·6H2O的用量較少，所以可以將這兩種藥品先配成0.01 g/mL的母液，再分別取500 ul混入微量元素母液中，這樣可以減少誤差。最后將微量元素母液定容至1 L，冷藏保存?zhèn)溆?。如配? L MS，只需吸取該母液5 mL。③鐵鹽母液的配制：稱取2.785 g FeSO4·7H2O和3.737 g Na2EDTA，逐一溶解，混合后加熱，避光放置至室溫，定容至1 L，冷藏保存?zhèn)溆?，如配? L MS，只需吸取該母液10 mL。④BS維生素母液的配制：稱取0.50 g VB1、0.05 g VB6、0.05 g煙酸、5.0 g肌醇，逐一溶解，煙酸先用少量l mol/L HCl溶解，然后再與其他藥品混合，定容至0.5 L，冷藏保存?zhèn)溆?，如配? L MS，只需吸取該母液10 mL。

1.2.2激素的配制 ①KT母液（lmg/L）：取10 mg KT，先用少量l mol/L HCI滴溶，然后定容至10 mL，用0.22μm的濾膜過濾除菌，冷藏保存。②2，4-D母液（lmg/L）：取10 mg 2，4-D，先溶于少量95%乙醇中，然后加熱水溶解，定容至10 mL，用0.22 um的濾膜過濾除菌，冷藏保存。③IAA母液（lmg/L）：取10 mg IAA，先溶于少量95%乙醇中，然后定容至10 mL，用0.22 μm的濾膜過濾除菌，冷藏保存。④IBA母液（lmg/L）：取l mg IBA，先溶于少量l mol/L NaOH中，然后定容至10 mL，用0.22 μm的濾膜過濾除菌，冷藏保存。⑤ZT母液（0.5mg/L）：取25 mg ZT，先溶于少量95%乙醇中，然后加熱水溶解，定容至50 mL，用0.22 μm的濾膜過濾除菌，冷藏保存。

1.3無菌苗的獲得

將珂字棉312的種子脫絨后用75%乙醇消毒30 s，0.1% HgCl2消毒30 min，用無菌水沖洗5～6次，然后浸泡于無菌水中至露白，再將露白的種子接入1/2 MS培養(yǎng)基中（7粒/瓶），置于28℃下黑暗培養(yǎng)。無菌苗的獲得也可以先將棉花種子去殼，蒸餾水浸泡1 h，再用0.1% HgCl2消毒8～10 min，然后直接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，置于28℃下黑暗培養(yǎng)。

1.4愈傷組織誘導(dǎo)

4天后，將下胚軸切成1cm的片段轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，待愈傷組織形成后，將之轉(zhuǎn)接于愈傷繼代培養(yǎng)基。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

A. MS+0.1mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT+30 g/L蔗糖+8g/L瓊脂

B. MS+0.1mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT+30 g/L 葡萄糖+8g/L瓊脂

C. MSB5+1mg/L IBA+0.5 mg/L KT+ 3%葡萄糖+8g/L瓊脂

愈傷繼代培養(yǎng)基：

D. MSB5+0.05 mg/L 2，4-D +0.1mg/L KT +30g/L葡萄糖+8g/L瓊脂

E. MSB5+0.05 mg/L 2，4-D +0.1mg/L KT +30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel

1.5胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

從繼代培養(yǎng)基上將愈傷組織轉(zhuǎn)入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

a. MS +30 g/L葡萄糖+2.5 g/L phytagel

b. MSB5（雙倍 KNO3，無NH4NO3）+0.1mg/L ZT+0.5g/L 活性炭+30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel

c. MSB5（雙倍 KNO3，無NH4NO3）+0.2mg/L ZT +0.1mg/L IAA +30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel

d. MSB5（雙倍 KNO3，無NH4NO3）+0.15mg/L KT +0.5mg/L IBA +0.75g/L MgCl2+30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel

e. MSB5+0.1 mg/L KT+0.01 mg/L 2，4-D +30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel

f. MSB5（雙倍 KNO3，無NH4NO3）+0.1mg/L KT +0.05mg/L 2，4-D +1.0 g/L Gln+0.5 g/L Asn +30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel

g.MSB5+0.01 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L Zip+30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel

當(dāng)呈粒狀疏松的胚性愈傷組織誘導(dǎo)出來后，再轉(zhuǎn)入胚性愈傷增殖培養(yǎng)基[MSB5（雙倍 KNO3，無NH4NO3）+0.5mg/L IBA+0.15mg/L KT+1.0 g/L Gln+0.5 g/L Asn +30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel]。

1.6分化

將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，胚性愈傷分化成苗后，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基[MSB5（雙倍 KNO3，無NH4NO3）+0.1mg/L GA3 +30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel] [MS+0.1 mg/L IAA +30g/L葡萄糖+2.5g/L phytagel]。

2結(jié)果與分析

2.1愈傷組織誘導(dǎo)

用3種不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)棉花下胚軸，大約4天后，即可看見下胚軸片段的一端有膨大現(xiàn)象。誘導(dǎo)培養(yǎng)半個月后，在A培養(yǎng)基上會出現(xiàn)很多種狀態(tài)的愈傷組織，大多數(shù)是呈泥狀的灰白色愈傷，但是有輕微褐化，少部分白色、綠色（圖1-A）。在B培養(yǎng)基上長有較多的灰白色的愈傷，少數(shù)淡黃色（圖1-B）。在C培養(yǎng)基上有較少的愈傷卻有較多的根（圖1-C）。從圖中可以看出，在A、B、C三種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，B培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織效果較好。因此，對愈傷組織進行繼代培養(yǎng)時，一般選擇B培養(yǎng)基上的愈傷組織。

將B培養(yǎng)基上形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到D、E兩種繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在D培養(yǎng)基上形成的愈傷組織極易褐化，而在E培養(yǎng)基上形成的愈傷生長良好。經(jīng)分析，出現(xiàn)這種結(jié)果，很可能是跟這兩種繼代培養(yǎng)基使用不同碳源有關(guān)。通過在E培養(yǎng)基上繼代兩次后，愈傷組織大多變成淡黃色和淡白色。

2.2胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將E繼代培養(yǎng)基上形成的淡黃色和白色的愈傷組織轉(zhuǎn)移到7種不同胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，大約培養(yǎng)1周后，觀察發(fā)現(xiàn)，g培養(yǎng)基中的愈傷組織出現(xiàn)褐化，生長基本停止。c、e培養(yǎng)基上的愈傷組織生長迅速，均為淺色、疏松的愈傷組織。b、d、f三種培養(yǎng)基上的愈傷組織均生長緩慢，b、d兩種培養(yǎng)基上的愈傷組織質(zhì)地堅硬，而f培養(yǎng)基上的愈傷組織雖然為疏松狀，但出現(xiàn)褐化。a培養(yǎng)基為實驗對照，不含任何激素，盡管愈傷組織生長速度一般，但質(zhì)地疏松，為灰白色（表1）。

2.3分化

將a胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，大約15天后，在分化培養(yǎng)基上可以看到有部分愈傷變成了體細(xì)胞胚。繼續(xù)培養(yǎng)一周后，體細(xì)胞胚萌發(fā)，長出子葉胚。然后，將子葉胚轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生根。

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基是影響棉花組織培養(yǎng)及植株再生的一個重要原因。本研究經(jīng)過多次嘗試，初步建立了珂字棉312的組織培養(yǎng)體系。在無菌苗獲得階段，選擇的是經(jīng)典的1/2 MS培養(yǎng)基，在愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)階段選擇了MS培養(yǎng)基，而在愈傷組織增殖階段選擇了MSB5培養(yǎng)基，在胚性愈傷組織增殖和根誘導(dǎo)階段選擇的是含有雙倍 KNO3、不含NH4NO3的MSB5培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基的碳源選擇上，除了最初誘導(dǎo)愈傷時使用的是蔗糖外，在后面的培養(yǎng)基中都使用了葡萄糖。在凝固劑的選擇上，除了第一次誘導(dǎo)愈傷時使用的是瓊脂外，后面都使用了Phytagell。Phytagell是一類新的凝固劑，在植物組織培養(yǎng)中具有通氣性好、凝固溫度低、含雜質(zhì)少等優(yōu)點，而且不易發(fā)生水化現(xiàn)象[7]。選用Phytagell作為凝固劑有利于體細(xì)胞胚形成。本研究選擇的外植體是下胚軸，有利于下胚軸誘導(dǎo)獲得愈傷組織。

植物激素是影響棉花組織培養(yǎng)及植株再生的另一個重要因素。0.1mg/L 2，4-D和0.5mg/L KT可以誘導(dǎo)出灰白色的愈傷組織；采用低濃度的2，4-D 和KT即0.05 mg/L 2，4-D和0.1mg/L KT，有利于愈傷組織的增殖；在不含任何激素的MS培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；0.5 mg/L IBA和0.15 mg/L KT，另外再添加1.0 g/L Gln和0.5 g/L Asn，可以使胚性愈傷組織大量增殖；0.1 mg/L IAA有利于胚性愈傷的分化；0.1 mg/L GA3有利于根的分化。

能否誘導(dǎo)出胚性愈傷組織是棉花組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，在本研究中，選擇了7種誘導(dǎo)胚性愈傷組織的培養(yǎng)基，結(jié)果只有在不含任何激素的MS培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，研究結(jié)果跟前人研究結(jié)果差異比較大。經(jīng)分析認(rèn)為，這可能跟愈傷繼代培養(yǎng)基中含有2，4-D 和KT有關(guān)，而這兩種激素中的1種或兩種存在滯后作用，從而使得胚性愈傷組織得以誘導(dǎo)成功。同時，在胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基e、f中。盡管也含有2，4-D 和KT這兩種激素，不同的是f培養(yǎng)基中2，4-D的濃度更高，而e培養(yǎng)基中形成的愈傷組織生長很快，f培養(yǎng)基中形成的愈傷組織反而出現(xiàn)褐化。因此，作者認(rèn)為，2，4-D在胚性愈傷組織誘導(dǎo)中可能起關(guān)鍵作用，但是濃度不需要太高，太高容易引起褐化。至于2，4-D是否跟KT存在協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最適合濃度是多少，這些都有待實驗進一步驗證。

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