利用微滴數(shù)字PCR方法快速分析轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因的拷貝數(shù)

姜志軍,　江　穎,　徐搖光,　張立全,　張曉東*

1.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心, 北京 100097;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100037

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利用微滴數(shù)字PCR方法快速分析轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因的拷貝數(shù)

姜志軍1,2,江穎1,徐搖光1,張立全1,張曉東1,2*

1.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心, 北京 100097;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100037

以玉米自交系501幼胚為受體材料，首先將來自球形節(jié)桿菌的EPSPS基因(G23V)按玉米密碼子偏愛性進行優(yōu)化與人工合成，并且將其克隆到表達載體pBAC9200中；然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入玉米自交系501的幼胚中。經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)、草甘膦抗性篩選和分化培養(yǎng)最終獲得14株轉(zhuǎn)化再生植株。經(jīng)PCR、RT-PCR檢測表明，其中5株目的基因G23V-EPSPS穩(wěn)定整合且在轉(zhuǎn)錄水平獲得表達。隨后，利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)對外源基因拷貝數(shù)進行了檢測分析，分析結(jié)果表明在5株陽性轉(zhuǎn)基因植株中，外源基因G23V-EPSPS拷貝數(shù)分別為0.12、1.0、0.9、1.89和0.66，介于0～2之間。成功建立了草甘膦抗性基因G23V-EPSPS在玉米中的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為以新型高抗草甘膦G23V-EPSPS基因作為轉(zhuǎn)基因玉米篩選標(biāo)記基因奠定了基礎(chǔ)；而且以微滴數(shù)字PCR技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Southern Blot簡便快速的完成外源基因拷貝數(shù)的分析，為微滴數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因外源基因拷貝數(shù)檢測上的廣泛應(yīng)用做了初步的探索。

轉(zhuǎn)基因玉米；G23V-EPSPS基因；抗草甘膦；ddPCR

玉米(ZeamaysL.)是世界三大糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和工業(yè)中占據(jù)重要地位，全球?qū)τ衩椎男枨罅空诓粩嗯噬?。近年來，玉米作為轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要的研究對象受到世界各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已獲得多個可用的農(nóng)藝性狀，如在玉米螟和食根害蟲的防治、除草劑的抗性以及玉米營養(yǎng)品質(zhì)的改善等方面都取得了一定的成果[1,2]。近些年，盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米中的應(yīng)用已較為成熟，但在轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選過程中仍然存在著篩選效率低、假陽性高的問題，所以探索一種高效篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株的方法意義重大。當(dāng)前所報道的轉(zhuǎn)基因玉米成功案例中大部分都是以抗除草劑基因作為篩選標(biāo)記基因如bar、CP4-EPSPS等，其中CP4-EPSPS已商業(yè)化應(yīng)用多年[3]。雖然以bar和CP4-EPSPS基因作為轉(zhuǎn)基因玉米陽性植株的篩選標(biāo)記基因已比較成熟且篩選效率有所改善，但在實際轉(zhuǎn)基因研究中假陽率性仍然很高，因此探索一個能在玉米中高效表達且高抗草甘膦的基因?qū)τ谶M一步提高轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選效率至關(guān)重要。

數(shù)字PCR(digital PCR)是近年來迅速發(fā)展起來的一種突破性的核酸定量分析技術(shù)。 其技術(shù)原理是先將核酸模板進行大量稀釋,使其分配到多個獨立的反應(yīng)單元中，每個反應(yīng)單元中只有單個核酸模板分子，然后以每個獨立的反應(yīng)單元進行PCR擴增反應(yīng)，擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)室的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析，最終實現(xiàn)對核酸的絕對定量。微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)是數(shù)字PCR技術(shù)的一種，它主要是以形成大量油包水微滴的形式對核酸進行成千上萬倍稀釋，然后以每個小微滴為獨立的反應(yīng)單元進行PCR反應(yīng)，最后利用泊松分布原理對核酸分子進行絕對定量分析[4～8]。微滴數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因外源基因拷貝數(shù)分析方面具有諸多優(yōu)點，與Southern Blot相比，它工作量小、周期短、操作要求低、準(zhǔn)確性高；與實時熒光定量PCR相比，它靈敏度高、檢測限度低至1/104、無需標(biāo)準(zhǔn)品不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線、采用終點PCR信號計數(shù)檢測不依賴于Ct值、能有效克服PCR抑制劑的影響，是一種更加理想的進行外源基因拷貝數(shù)分析的新方法[9,10]。本研究探索將一種新的具有高抗草甘膦功能和超強熱穩(wěn)定性的G23V-EPSPS(G23V 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)基因[11,12]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入玉米中以驗證該基因在玉米中能否順利整合并表達；另外借助微滴數(shù)字PCR技術(shù)對外源基因拷貝數(shù)進行快速鑒定，為利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)做了初步的探索。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1實驗儀器Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量儀(Thermo Scientific)；QX200 Droplet Digital PCR系統(tǒng)(Bio-Rad 包括微滴生成儀、蓋膜儀、PCR儀和微滴讀取儀 )。

1.1.2微滴數(shù)字PCR實驗中所需的試劑2×QX200 ddPCR EvaGreen Supermix(Bio-Rad)；微滴生成油 droplet generation oil/(Bio-Rad)。微滴數(shù)字PCR反應(yīng)中內(nèi)參基因為HMGA(GenBank: AJ131373.1)。

1.2實驗材料

1.2.1轉(zhuǎn)基因受體材料轉(zhuǎn)基因受體材料為玉米(ZeamaysL.)自交系501幼胚,玉米幼穗取于自交授粉后11～12 d，幼胚大小為0.8～1.5 mm。

1.2.2菌株和植物表達載體構(gòu)建[13,14]農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為EHA105；目的基因依據(jù)GenBank:GM718572.1序列，按照玉米密碼子進行優(yōu)化與人工合成(由上海捷瑞生物工程公司合成)，優(yōu)化后的G23V-EPSPS基因為1 242 bp，翻譯蛋白氨基酸413個，用花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子與玉米Adh1基因的第1個內(nèi)含子驅(qū)動G23V-EPSPS基因，獲得植物表達載體pBAC 9200(圖1)。

圖1　質(zhì)粒pBAC 9200的T-DNA區(qū)Fig.1　The map of plasmid pBAC 9200 T-DNA.P35S:花椰菜花葉病毒35S RNA的啟動子; adh1 intron：玉米Adh1基因的第一個內(nèi)含子; G23V-EPSPS:G23V型5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因; Tnos:農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子

1.3實驗方法

1.3.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化[15～19]利用攜帶表達載體pBAC 9200的EHA105農(nóng)桿菌菌株介導(dǎo)玉米自交系501幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化。具體實驗步驟如下：①農(nóng)桿菌侵染液的制備：將-80℃保存的包含表達載體的EHA105農(nóng)桿菌在含有抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上28℃劃線培養(yǎng)3 d；挑取單菌落涂于含有抗生素的YEP固體培養(yǎng)基中20℃培養(yǎng)3 d；將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌用接種環(huán)直接刮取到配好的侵染液中，并用侵染液調(diào)節(jié)OD600=0.35，放于搖床中，22℃，180 r/min，振蕩4 h；4 h后侵染液直接用于幼胚的侵染。②遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生過程：將玉米幼穗于75%乙醇中5 min，無菌水洗3次， 然后于25%NaClO中消毒3 min，無菌水洗3次；用無菌刀片將玉米籽粒幼胚逐個剝出放到已配制好的農(nóng)桿菌侵染液(培養(yǎng)基配方見表1)中30 min；用無菌濾紙吸干幼胚表面浮液，將幼胚轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中22℃進行暗培養(yǎng)3 d。

1.3.2除草劑抗性愈傷篩選與植株再生將幼胚轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見表1)中25℃暗培養(yǎng)15 d進行愈傷誘導(dǎo)；將愈傷轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中25℃暗培養(yǎng)篩選2次，每次15 d；然后將篩選后生長狀態(tài)良好的愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中,25℃光照培養(yǎng)進行分化成苗；將分化的幼苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中25℃光照培養(yǎng)進行壯苗；最后將獲得的轉(zhuǎn)化苗室溫條件下進行煉苗，7 d后移入大田中。

表1　玉米遺傳轉(zhuǎn)化再生培養(yǎng)基

1.3.3T0代轉(zhuǎn)化玉米植株分子生物學(xué)檢測經(jīng)篩選分化的轉(zhuǎn)化再生植株，分別進行PCR、G23V-EPSPS插入拷貝數(shù)與RT-PCR等分子生物學(xué)檢測分析。

①G23V-EPSPS基因的PCR檢測。采用天根生化科技有限公司的DNA Secure Plant Kit提取玉米葉片基因組DNA，運用Primer 5.0設(shè)計G23V-EPSPS基因的特異引物(表2)。PCR反應(yīng)體系：DNA模板3 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，RNase-Free-water(購自TaKaRa公司)7.5 μL，共25 μL。PCR程序如下：95℃ 5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s， 28個循環(huán)；72℃ 5 min，16℃保存。

②G23V-EPSPS基因的插入拷貝數(shù)分析。微滴數(shù)字PCR完整的實驗流程包括：PCR反應(yīng)體系的配制、生成微滴、PCR擴增和信號讀取4個步驟[20]。微滴數(shù)字PCR體系：DNA模板30 ng/20 μL體系,2×QX200 ddPCR EvaGreen Supermix 10 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL，加RNase-Free-water直至總體系20 μL。生成微滴需要使用儀器專配的微滴生成卡和微滴生成儀，將20 μL PCR反應(yīng)體系與70 μL微滴生成油一同加入微滴生成卡中，蓋上專用膠墊后放入微滴生成儀中生成微滴。微滴數(shù)字PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s， 40個循環(huán)；4℃ 5 min，90℃ 5 min，12℃保存。每個樣品進行3個平行重復(fù)實驗，PCR擴增完畢后，將PCR產(chǎn)物放入微滴讀取儀中依據(jù)熒光信號的有無對陽性微滴和陰性微滴進行判定讀值。最后，在電腦上利用軟件QuantaSoft V1.7.4對數(shù)據(jù)進行分析，最終得到核酸絕對定量結(jié)果。

③G23V-EPSPS基因的RT-PCR檢測。用Trizol Reagent(購自Ambion公司)提取玉米葉片總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，購自TaKaRa公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，采用Primer 5.0設(shè)計G23V-EPSPS基因和內(nèi)參Actin基因的半定量特異引物(表2)。 RT-PCR反應(yīng)體系：稀釋5倍的cDNA 模板1 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，RNase-Free-water 9.5 μL，總共25 μL。Actin基因RT-PCR程序如下：95℃ 5 min；95℃ 20 s，54℃ 20 s，72℃ 20 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min，16℃保存。G23V-EPSPS基因RT-PCR程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min，16℃保存。

表2　PCR檢測中的引物序列

2　結(jié)果與分析

2.1G23V-EPSPS基因的PCR檢測結(jié)果

對經(jīng)草甘膦抗性篩選分化再生獲得的14株轉(zhuǎn)化玉米苗進行初步的PCR檢測，以檢測外源G23V-EPSPS基因是否轉(zhuǎn)入并整合到玉米基因組中(圖2)。14株轉(zhuǎn)化苗中共有5株即2、9、10、11、12號植株表現(xiàn)出PCR陽性，初步確認這5顆植株發(fā)生了G23V-EPSPS基因的整合，陽性率為35.7%。

2.2G23V-EPSPS基因插入拷貝數(shù)檢測結(jié)果

利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)對PCR表現(xiàn)陽性的5株轉(zhuǎn)基因植株進一步進行拷貝數(shù)檢測。本研究中計算外源基因拷貝數(shù)的方法為：

外源基因拷貝數(shù)=外源基因濃度/內(nèi)參基因濃度(本研究中所選的內(nèi)參基因HMGA在玉米中的拷貝數(shù)為1)。首先，對微滴數(shù)字PCR實驗中玉米內(nèi)參基因HMGA與G23V-EPSPS基因相應(yīng)引物的特異性進行檢測(圖3)，二者的陽性微滴(藍色帶)與陰性微滴(黑色帶)都能夠顯著的區(qū)分，證明內(nèi)參基因HMGA與G23V-EPSPS基因引物的特異性沒有問題，且說明系統(tǒng)可以準(zhǔn)確判讀出陽性微滴與陰性微滴的數(shù)目；其次，對微滴數(shù)字PCR的重復(fù)性進行分析(表3)，所有樣品內(nèi)參HMGA基因和G23V-EPSPS基因的實驗微滴總數(shù)均大于12 000，滿足微滴數(shù)字PCR微滴的分析要求，同時，實驗中生成微滴的RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)介于2%～14%之間，小于25%，符合歐盟核酸定量檢測的要求，說明實驗中建立的微滴數(shù)字PCR體系微滴生成穩(wěn)定，重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)可靠性高；最后，完成對5株轉(zhuǎn)基因植株中G23V-EPSPS基因拷貝數(shù)的分析(表4)，G23V-EPSPS基因的插入拷貝數(shù)在0～2之間。

圖2　T0代轉(zhuǎn)基因玉米G23V-EPSPS基因的PCR檢測Fig.2　Analysis of G23V-EPSP gene’s integration in T0 transgenic maize genome with PCR.M:DNA marker；+：陽性質(zhì)粒；H2O:空白對照；WT:陰性對照；1～14：獲得的轉(zhuǎn)化再生植株

圖3　 微滴數(shù)字PCR引物特異性檢測Fig.3　Droplet digital PCR specificity detection of primers.A.內(nèi)參基因；B.G23V-EPSPS基因。注：圖中灰色信號點代表發(fā)生PCR擴增的微滴，系統(tǒng)判讀為陽性信號；黑色的信號點代表未發(fā)生PCR擴增的微滴，系統(tǒng)判讀為陰性信號。

樣品基因微滴數(shù)總數(shù)123平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差SD相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDH2OHMGA1403416997-1551520950.14G23V1576516383-160744360.03WTHMGA1454317120168101615714060.09G23V155401708115839161538170.051HMGA156081713817338166949460.06G23V1521617323177761677113360.082HMGA1494717866169501658714920.09G23V1325716708154431513617450.123HMGA1557915590181981645515080.09G23V156071569816134158132810.024HMGA1472317401151161574614460.09G23V152101622715002154796550.045HMGA167631598417292166796570.04G23V164241697615965164555060.03

2.3G23V-EPSPS基因的RT-PCR檢測結(jié)果

對PCR表現(xiàn)陽性的5株轉(zhuǎn)基因植株進行RT-PCR檢測，以檢測目的G23V-EPSPS基因在玉米機體中是否順利轉(zhuǎn)錄(圖4)。首先，對RNA完整性進行驗證(圖4A)，28S、18S和5.8S RNA完整性良好；其次，對逆轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA質(zhì)量進行驗證(圖4B)，所有樣品均得到了特異的目的DNA片段，cDNA沒有問題；最后，完成對G23V-EPSPS基因的RT-PCR檢測(圖4C)，所獲得的5株轉(zhuǎn)化再生植株，G23V-EPSPS基因都在轉(zhuǎn)錄水平獲得了表達。

3　討論

G23V-EPSPS基因是一種來源于原核細菌中的基因，由于原核生物與真核生物在一些氨基酸上具有不同的密碼子偏愛性，所以為了提高G23V-EPSPS基因在玉米中的表達效率，本研究依據(jù)玉米中密碼子的偏愛性對其進行了密碼子優(yōu)化處理[21]。有文獻報道在常用的植物轉(zhuǎn)基因方法中，基因槍轉(zhuǎn)化法與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)所產(chǎn)生的外源基因低拷貝事件高于基因槍轉(zhuǎn)化法[22],并且外源基因的表達水平也要高于基因槍轉(zhuǎn)化法，造成外源基因沉默的幾率較基因槍法低[23]。所以本研究采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將外源G23V-EPSPS基因轉(zhuǎn)入玉米自交系501幼胚中，經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)草甘膦抗性篩選與分化等過程，最終獲得5個在轉(zhuǎn)錄水平表達的株系。運用ddPCR技術(shù)對外源基因拷貝數(shù)進行快速分析，結(jié)果表明5個轉(zhuǎn)基因株系都是外源基因低拷貝事件，插入拷貝數(shù)在0～2之間并成功獲得了轉(zhuǎn)G23V-EPSPS基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株。最后，盡管ddPCR的靈敏度和精確性相對較高，但是如需準(zhǔn)確的確定外源基因的插入拷貝數(shù)，仍需要進一步通過Southern Blot進行驗證。

表4　ddPCR G23V-EPSPS基因拷貝數(shù)分析

圖4　5株轉(zhuǎn)基因陽性植株RT-PCR擴增結(jié)果Fig.4　RT-PCR results of PCR positive maize lines.A.RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖；B.內(nèi)參基因Actin的RT-PCR擴增結(jié)果；C.G23V-EPSPS基因的RT-PCR擴增結(jié)果。M:DNA marker；+：陽性質(zhì)粒對照；H2O:空白對照；WT:非轉(zhuǎn)基因陰性對照；1～5：獲得的5株P(guān)CR陽性植株

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Rapid Analysis of Exogenous Gene’s Copy Number in Transgenic Maize with Droplet Digital PCR

JIANG Zhi-jun1,2, JIANG Ying1, XU Yao-guang1, ZHANG Li-quan1, ZHANG Xiao-dong1,2*

1.BeijingAgriculturalBiotechnologyResearchCenter,BeijingAcademyofAgricultureandForestryScience,Beijing100097,China;2.CollegeofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100037,China

In this study,EPSPSgene deriving fromArthrobacterglobiformiswas optimized with maize biased codons and synthesized. The synthesized gene named asG23Vwas cloned into plant expression vector pBAC9200. The vector was transformed into immature embryos of maize (Zeamays) inbred lines 501 withAgrobacterium-mediated transformation method. Total 14 regenerated plants were obtained following steps of callus induction, glyphosate resistance screening and differentiation culture. PCR, RT-PCR detection showed that five transformed plants possessedG23V-EPSPSgene’s integration and expression on the transcriptional level. Finally,G23V-EPSPSgene’s insertion copy number was detected using droplet digital PCR technology. The results showed that, in the five confirmed genetically modified plants, the copy number ofG23V-EPSPSgene was 0.12, 1.0, 0.9, 1.89, 0.66, respectively, ranging between 0 to 2. The study established genetic transformation system of glyphosate resistance gene in maize, which laid the foundation forEPSPSgene as selection marker in transgenosis. Besides, droplet digital PCR technology is a simple and rapid method to analyze foreign gene’s insertion copy number, and could replace traditional Southern Blot method in the near future.

transgenic maize;G23V-EPSPSgene; glyphosate resistance; ddPCR

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.12

2016-04-21; 接受日期：2016-05-28

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2013ZX08003-001)；北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新團隊(JNKST201617)資助。

姜志軍，碩士研究生，研究方向為植物遺傳學(xué)。E-mail:jiangzhijun12345@126.com。*通信作者：張曉東，研究員，博士，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail:zhangxiaodong@baafs.net.cn