基于16S rRNA基因文庫(kù)技術(shù)分析水性涂料菌群的多樣性

黃小茉,　陶宏兵,　邱曉穎,　李良秋,　施慶珊

1.廣東省微生物研究所, 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070;2.廣東迪美生物技術(shù)有限公司, 廣州 510663

?

基于16S rRNA基因文庫(kù)技術(shù)分析水性涂料菌群的多樣性

黃小茉1,2,陶宏兵1,邱曉穎2,李良秋1,施慶珊1

1.廣東省微生物研究所, 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070;2.廣東迪美生物技術(shù)有限公司, 廣州 510663

采用未培養(yǎng)技術(shù)直接提取變質(zhì)涂料微生物總DNA，使用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、連接、克隆和測(cè)序，建立16S rRNA基因文庫(kù)，分析變質(zhì)水性涂料細(xì)菌的數(shù)量與種類。從96個(gè)克隆子中共檢測(cè)到8種不同種屬的細(xì)菌，假單胞菌屬(Pseudomonas)為優(yōu)勢(shì)菌群，占總數(shù)的75%，軟骨酸芽孢桿菌(Paenibacilluschondroitinus)占總數(shù)的15%，此外豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)和糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)分別占總數(shù)2%。結(jié)果表明16S rRNA基因文庫(kù)是一種較好的研究水性涂料細(xì)菌群落多樣性的方法。

水性涂料；16S rRNA；細(xì)菌；多樣性

水性涂料是以水為分散介質(zhì)制得的涂料，由于其來(lái)源方便、成本低、無(wú)毒無(wú)刺激等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于內(nèi)墻外墻、船舶、汽車(chē)等各個(gè)行業(yè)[1～3]。但由于采用的是水這一容易滋生細(xì)菌的溶劑，同時(shí)包含了大量纖維素和高分子材料，水性涂料相比其他涂料更容易引起微生物污染。變質(zhì)的產(chǎn)品會(huì)出現(xiàn)變色、發(fā)臭、黏度下降等現(xiàn)象，不僅損害產(chǎn)品品牌形象，還會(huì)給生產(chǎn)廠商造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。為保護(hù)產(chǎn)品的貯存和使用，目前大部分廠家采取的辦法是在產(chǎn)品中添加防腐劑。但由于不同廠家的原材料來(lái)源和生產(chǎn)環(huán)境不同，污染的微生物種類有很大差別，為有針對(duì)性的建立微生物防控體系，需對(duì)導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)的微生物有清晰全面的認(rèn)識(shí)。

傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)方法研究對(duì)象主要為單個(gè)種質(zhì)資源，雖然可以獲得菌株，但可能遺漏潛在的重要有害微生物；采用16S rRNA基因文庫(kù)方法既可以分析樣品中細(xì)菌的種類，又可以反映各種細(xì)菌的相對(duì)比例，最重要的是通過(guò)這種方式可以檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)室條件下不能培養(yǎng)的細(xì)菌[4]。為探明變質(zhì)水性涂料中細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成情況，本實(shí)驗(yàn)采用16S rRNA基因文庫(kù)技術(shù)分析變質(zhì)水性涂料的群落結(jié)構(gòu)組成情況，以期為針對(duì)性地建立水性涂料有效防腐體系提供充足的微生物數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品來(lái)源

某涂料公司提供的一桶發(fā)紅、有異常氣味的丙烯酸乳膠漆，且桶底有結(jié)塊現(xiàn)象。

1.2主要試劑和儀器

試劑：苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)購(gòu)自廣州齊云生物工程有限公司；TE緩沖液(pH 8.0)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA Marker購(gòu)自天根生化試劑公司；凝膠回收試劑盒、純化和T載體連接試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司。

主要儀器：臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Biofuge primo R)；PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf Mastercycler 5333)；電泳儀(GE Healthcare Ettan DALT six)；凝膠成像系統(tǒng)(Alpha)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品總DNA提取及純化采用直接法提取涂料中微生物的DNA，首先將樣品進(jìn)行預(yù)處理[5]，將預(yù)處理的樣品液氮凍融處理3次后，用TE緩沖液沖洗至50 mL的離心管中，然后用溶菌酶-SDS-酚/氯仿法提取總DNA[6]，最后用DNA純化試劑盒將粗提DNA進(jìn)行純化。

1.3.2PCR擴(kuò)增和克隆文庫(kù)構(gòu)建以提取的DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物F27： 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；R1492：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。采用凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化。用載體pMD19-T進(jìn)行16S rRNA基因的連接后，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，每份標(biāo)本平行做2次。以氨芐西林(60 μg/mL)抗性和藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆子，采用T載體通用引物對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆送到英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3序列比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果用DECIPHER軟件去除嵌合體，用Ribosomal Database Project (RDP) Release 1中的分類程序?qū)λ行蛄羞M(jìn)行分類分析。用Mothur軟件劃分分類操作單元(OTU)，將相似性>97%的序列視為同一個(gè)OTU，計(jì)算文庫(kù)的覆蓋率(C)，克隆文庫(kù)的覆蓋率公式為:

C=1-n1/N

其中n1代表文庫(kù)中只有一個(gè)克隆的OTU個(gè)數(shù)，N代表文庫(kù)總的OUT個(gè)數(shù)。

選取每個(gè)OTU代表序列，分別與Eztaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的菌株16S rRNA基因進(jìn)行相似度比對(duì)，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果按序列的相似程度百分比進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)分析，利用MEGA 3.1中Kimura 2參數(shù)矩陣臨接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析。

2　結(jié)果與分析

2.1涂料樣品總DNA的PCR擴(kuò)增及陽(yáng)性克隆的驗(yàn)證

利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行涂料樣品細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增，結(jié)果得到1 500 bp大小的條帶?？梢钥吹剿袠悠房侱NA的PCR產(chǎn)物均在1 500 bp左右，沒(méi)有非特異性條帶，說(shuō)明本提取方法得到的總DNA純度高，不含PCR反應(yīng)抑制物?？蓾M足后續(xù)的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用的要求。用PCR法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行驗(yàn)證，有1 500 bp特異性條帶的樣品為陽(yáng)性克隆，反之則為假陽(yáng)性。挑取陽(yáng)性克隆構(gòu)成細(xì)菌的16S rRNA基因文庫(kù)。

圖1　PCR法驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子Fig.1　Validation positive clones using PCR method.M：DNA Marker；1～15：陽(yáng)性克隆；16：陰性對(duì)照

2.2涂料樣品中細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育分析

從涂料樣品細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑選96個(gè)克隆子進(jìn)行鑒定，用DECIPHER軟件去掉6個(gè)嵌合體。剩余的90個(gè)序列經(jīng)Mothur軟件分析，共劃分了8個(gè)OTU。文庫(kù)覆蓋率C值達(dá)到100%，說(shuō)明所獲得的序列可以較全面的反應(yīng)樣品的生物多樣性。將文庫(kù)中的序列上傳到GenBank，得到登錄號(hào)為KX242390-KX242397。變質(zhì)涂料中的主要微生物為假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌株，占克隆子總數(shù)的75%，除假單胞菌外，還有14個(gè)克隆子為軟骨酸芽孢桿菌屬(Paenibacilluschondroitinus)，占克隆子總數(shù)的15%。 此外還各有2個(gè)克隆子比對(duì)獲得的最大相似度菌株為豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)和糞產(chǎn)堿桿菌酚降解菌(Alcaligenesfaecalis),分別占總數(shù)的2%。

圖2　基于16S rRNA基因克隆文庫(kù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences.

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，樣品中所有菌種與已發(fā)現(xiàn)的菌種相似性>97%，變質(zhì)樣中的優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌。假單胞菌是工業(yè)腐敗微生物中一類常見(jiàn)的菌群,高分子化合物、芳香族化合物、鹵代衍生物和有機(jī)體殘?jiān)伎沙蔀槠溆杏玫牡孜铮哂袕V譜的底物利用性[7,8]。而且其不僅在4～7℃的低溫條件下可以生長(zhǎng)，還能產(chǎn)生耐熱的蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶，在高溫下依然具有活性[9,10]。因此在日化產(chǎn)品、乳膠漆、膠黏劑等產(chǎn)品中常有檢出[11,12]。

3　討論

對(duì)常規(guī)手段難以分離培養(yǎng)的樣品通過(guò)16S rRNA基因克隆文庫(kù)技術(shù)分析是一種較全面的檢測(cè)手段。在分析樣品的菌群結(jié)構(gòu)時(shí)，對(duì)樣品中的各種細(xì)菌是無(wú)選擇性檢測(cè)，通過(guò)代表不同細(xì)菌種類的克隆子的數(shù)量計(jì)算各種細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量，具有傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以比擬的優(yōu)勢(shì)。但將該技術(shù)應(yīng)用于水性涂料細(xì)菌群落多樣性研究時(shí)也面臨著一個(gè)問(wèn)題，水性涂料組分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尤其是發(fā)生腐敗后，雜質(zhì)成分多，性狀差異大，總DNA提取困難。研究表明，提取的總DNA質(zhì)量是后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵[13,14]。本研究采用預(yù)處理得到的DNA電泳條帶較未處理明顯整齊。原因是對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理可以很好地去除雜質(zhì)，減少胞外游離DNA和有機(jī)物污染。而且預(yù)處理的緩沖液中含有EDTA，可以有效絡(luò)合金屬離子，抑制核酸酶的活性，避免在提取過(guò)程中DNA被降解。因此，經(jīng)預(yù)處理方法得到的DNA比不經(jīng)處理得到的DNA要純凈，再通過(guò)純化后能獲得高質(zhì)量的涂料微生物總DNA。

本研究的1例變質(zhì)涂料中假單胞菌為優(yōu)勢(shì)菌，占到樣本總菌落的75%，除假單胞菌外，還有軟骨酸芽孢桿菌屬、豚鼠氣單胞菌和糞產(chǎn)堿桿菌酚降解菌，這與其他對(duì)引起涂料變質(zhì)的微生物研究結(jié)果比較一致。陳藝彩等[15]對(duì)膠黏劑、白乳膠、涂料分離的76株腐敗微生物分析發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌、假單胞菌和腸桿菌是最主要的菌屬；英國(guó)阿拉丁國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌收集中心(National Collections of Industrial, Food and Marine Bacterial, NCIMB)的數(shù)據(jù)顯示，引起乳液和涂料腐敗的主要菌屬為銅綠假單胞菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。

通過(guò)對(duì)變質(zhì)水性涂料的細(xì)菌克隆文庫(kù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌多樣性相對(duì)較少。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是產(chǎn)品長(zhǎng)期固定使用單一種類防腐劑，限制了某些細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)了其他類型的細(xì)菌生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)菌。但具體是因?yàn)樵撟冑|(zhì)樣防腐體系失效，還是微生物產(chǎn)生了耐藥性導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)還需進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)本研究只對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行克隆構(gòu)建，對(duì)變質(zhì)涂料中的真菌類型還不能全面認(rèn)識(shí)，需要進(jìn)一步研究。

[1]陳 昊，吳夢(mèng)奇，李杰飛，等. 水性防腐涂料研究進(jìn)展[J]. 涂料工業(yè)，2016， 46(2):31-36.

[2]樂(lè)惠明. 水性涂料在汽車(chē)涂裝中的應(yīng)用[J]. 上海涂料，2010，48(3):40-43.

[3]金如君. 水性涂料在海洋重防腐領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)及性能研究[J]. 中國(guó)涂料，2014，29(11):50-53.

[4]Yarza P, Yilmaz P, Pruesse E,etal.. Uniting the classification of cultured and uncultured bacteria and archaea using 16S rRNA gene sequences[J]. Nat. Rev. Microbiol., 2014, 12(9): 635-645.

[5]張 蘇，劉 春，楊景亮，等. 工業(yè)化廢水處理反應(yīng)器污泥總DNA提取方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2008,35(10):1659-1663.

[6]熊開(kāi)容, 張智明, 張 敏. 活性污泥總 DNA 提取方法的研究[J]. 生物技術(shù)，2005，15(4): 43-45.

[7]宋若海，華兆哲，陳 堅(jiān). 不同底物和環(huán)境條件對(duì)兩株銅綠假單胞菌接觸烷烴方式及降解活性的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13(6):843-847.

[8]Dufour D, Nicodème M, Perrin C,etal.. Molecular typing of industrial strains ofPseudomonasspp. isolated from milk and genetical and biochemical characterization of an extracellular protease produced by one of them[J]. Int. J. Food Microbiol., 2008, 125(2): 188-196.

[9]Baur C, Krewinkel M, Kutzli I,etal.. Isolation and characterisation of a heat-resistant peptidase fromPseudomonaspanaciswithstanding general UHT processes[J]. Int. Dairy J., 2015, 49: 46-55.

[10]Poole K. Stress responses as determinants of antimicrobial resistance inPseudomonasaeruginosa: Multidrug efflux and more 1[J]. Can. J. Microbiol., 2014, 60(12): 783-791.

[11]李德品，梁聰慧. 涂料的微生物污染及其控制[J]. 造紙化學(xué)品，2012，24(3):40-41.

[12]陶宏兵，邱曉穎，馮 勁，等. 被污染的工業(yè)產(chǎn)品中常見(jiàn)微生物種類及耐藥性分析[J]. 工業(yè)微生物，2015，45(5)：42-45.

[13]Stach J, Bathe S, Clapp J P,etal.. PCR-SSCP comparison of 16S rDNA sequence diversity in soil DNA obtained using different isolation and purification methods[J]. FEMS Microbiol. Ecol., 2001, 36(23): 139-151.

[14]Picard C, Ponsonnet C, Paget E,etal.. Detection and enumeration of bacteria in soil by direct DNA extraction and polymerase chain reaction[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58(9): 2717-2722.

[15]陳藝彩，謝小保，施慶珊，等. 工業(yè)腐敗微生物種屬特性及抗藥性分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2010,10:1558-1565.

Analysis of Waterborne Coating Bacterial Diversity by the 16S rRNA Gene Library

HUANG Xiao-mo1,2, TAO Hong-bing1, QIU Xiao-ying2, LI Liang-qiu1, SHI Qing-shan1

1.StateKeyLaboratoryofAppliedMicrobiologySouthernChina;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialCultureCollectionandApplication,GuangdongInstituteofMicrobiology,Guangzhou510070,China;2.Guangdong Demay Biological Technology Co., Ltd, Guangzhou 510663, China

TotalmicrobialDNAwasdirectlyextractedfromametamorphicwaterbornecoating,theclonelibraryof16SribosomalRNAgeneswasamplifiedusingPCRwithuniversalbacterialprimersets.ThePCRproductswerethensubclonedintopGEM-Tvector,amplifiedDNAwasusedfordiversityanalysis.Thetotalof96cloneswereselectedand8kindsofmicrobewhichwereusedforsequencing. Pseudomonaswasthemostone(75%oftotalclones),thenwasPaenibacillus chondroitinus (15%oftotalclones), Aeromonas caviaeandAlcaligenes faecalisaccountedfor2%oftotalclonesrespectively. 16SrRNAgenelibraryisagoodresearchmethodforwaterbornebacteriacommunitydiversityanalysis.

waterbornecoating; 16SrRNA;bacterial;diversity

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.13

2016-04-29; 接受日期：2016-06-22

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B090600148; 2013B050800023);揭陽(yáng)市產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(201429)資助。

黃小茉，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)楣I(yè)產(chǎn)品微生物危害防治。Tel：020-87137503;E-mail：molyhuang@21cn.com