N-糖鏈切除對(duì)重組抗狂犬病毒單克隆抗體中和活性的影響

呂若蕓,　王　輝,　陳　忱,　張世雄,　張曉楠,　曹晨華,　魏敬雙

華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石家莊 050015

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N-糖鏈切除對(duì)重組抗狂犬病毒單克隆抗體中和活性的影響

呂若蕓§,王輝§,陳忱,張世雄,張曉楠,曹晨華,魏敬雙*

華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石家莊 050015

重組抗狂犬病毒單克隆抗體是一種全人源的抗病毒感染單抗，主要用于狂犬病毒暴露后預(yù)防。采用糖苷酶處理2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體Mab1、Mab2水解切除N-糖鏈，通過(guò)糖染色和毛細(xì)管電泳檢測(cè)確定N-糖鏈酶解程度，利用快速熒光灶抑制試驗(yàn)檢測(cè)其中和活性，分析N-糖鏈切除對(duì)該單抗中和活性的影響。結(jié)果顯示，N-糖鏈切除后抗體中和活性無(wú)明顯變化。說(shuō)明N-糖鏈對(duì)這兩株抗狂犬病毒單抗的體外中和活性不是必須的結(jié)構(gòu)成分。

重組抗狂犬病毒單克隆抗體；N-糖鏈切除；毛細(xì)管電泳；中和活性

重組單克隆抗體是通過(guò)蛋白質(zhì)突變和修飾而形成的復(fù)雜混合異構(gòu)物，其結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜。在對(duì)抗體糖基化的研究中人們發(fā)現(xiàn)， N糖基化是其最常見(jiàn)、復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。通常IgG的每個(gè)重鏈Fc區(qū)靠近鉸鏈處的CH2結(jié)構(gòu)域均有一個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)(Asn297)，該位點(diǎn)十分保守[1,2]，其可通過(guò)單價(jià)鏈接形成雙角N-糖鏈。在CH2區(qū)N-糖鏈協(xié)助維持一種開(kāi)放的馬蹄形構(gòu)象，有利于促進(jìn)與Fcγ受體的互作[3]。研究表明糖鏈在維持重組單克隆抗體的正常結(jié)構(gòu)、功能以及其生物學(xué)特性(識(shí)別抗原觸發(fā)免疫系統(tǒng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)信號(hào)活性等)和物理化學(xué)性質(zhì)(溶解度、蛋白質(zhì)折疊等)中發(fā)揮著重要作用，不同糖型對(duì)其功能和活性的影響不完全相同[4～6]；抗體的N-糖基化與Fc區(qū)功能相關(guān)，可影響抗體Fc部分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、免疫原性(尤其是1,3-α-Gal糖類(lèi))、藥代動(dòng)力學(xué)、分布、溶解度以及抗體穩(wěn)定性，從而可潛在調(diào)節(jié)抗體的效應(yīng)功能和藥物動(dòng)力學(xué)，刪除糖鏈可導(dǎo)致抗體構(gòu)象改變，降低或消除與Fcγ受體的結(jié)合[1,2]。此外還有研究表明改造抗體 Fc 段的糖鏈，其某些生物學(xué)功能可發(fā)生顯著改變[7,8]，目前已有通過(guò)糖基化改造的治療性抗體藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[9]。因此，控制重組單克隆抗體的N-糖基化從而優(yōu)化其效應(yīng)功能代表一種重要的研究領(lǐng)域。在自體免疫疾病、病毒感染、慢性炎癥和癌癥中應(yīng)注重對(duì)IgG N-糖基化作用機(jī)制的研究，并闡明其分子病理學(xué)機(jī)制。

本研究中的2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體均為全人源的IgG1亞型抗感染病毒的單抗，由CHO細(xì)胞表達(dá)，主要用于狂犬病毒暴露后預(yù)防。重組抗狂犬病毒單克隆抗體具有典型的IgG1亞型N-糖鏈結(jié)構(gòu)，即在CH2 結(jié)構(gòu)域有雙觸角復(fù)雜型的巖藻糖化的N-糖鏈[10,11]，N-糖鏈包埋在其中，形成特殊的作用形式[12]。本研究使用糖苷酶水解切除重組單克隆抗體的N-糖鏈，通過(guò)糖蛋白染色和毛細(xì)管電泳(CE-SDS)檢測(cè)兩種方法確定N-糖鏈酶解程度，利用快速熒光灶抑制試驗(yàn)法(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)檢測(cè)其中和活性，研究N-糖鏈對(duì)2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體中和活性的影響，以期為其N(xiāo)-糖鏈的質(zhì)量控制和抗狂犬病毒抗體的研發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1供試品

由CHO細(xì)胞表達(dá)的重組抗狂犬病毒單抗Mab1、重組抗狂犬病毒單抗Mab2樣品為本實(shí)驗(yàn)室制備，蛋白質(zhì)含量均為5 mg/mL。

1.2試劑及儀器

試劑：超純水(Milli-Q)、碳酸氫銨(分析純)、高碘酸(分析純)、乙酸(分析純)、乙醇(分析純)、希夫試劑(分析純)、偏重亞硫酸鈉(分析純)、鹽酸(分析純)、糖苷酶N-Glycanase (Prozyme,GKE-5006B)、電泳緩沖液(ABsciex公司)、β-巰基乙醇、1640RPMI培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)、狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS(武漢生物制品研究所)、抗狂犬病毒N蛋白熒光抗體(Fujirebio.Dia.Inc)、WHO抗狂犬病毒抗體活性標(biāo)準(zhǔn)品、BSR細(xì)胞(武漢生物制品研究所)。

儀器：毛細(xì)管電泳儀PA800 Plus(ABsciex公司);紫外檢測(cè)器(ABsciex公司);毛細(xì)管:無(wú)涂層毛細(xì)管(Beckman,338451)，內(nèi)徑50 μm,安裝至毛細(xì)管卡盒中使其總長(zhǎng)31 cm，有效長(zhǎng)度為20 cm(進(jìn)口到檢測(cè)窗之間的長(zhǎng)度)，檢測(cè)窗為8(100 μm×800 μm);熒光顯微鏡。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1糖鏈切除糖苷酶的水解樣品制備將2種單抗樣品Mab1、Mab2分別用除菌純水稀釋至1 mg/mL，分別取150 μL樣品向其中加入6 μL糖苷酶，37℃水浴3 h，4℃放置備用。同時(shí)再分別取150 μL濃度為1 mg/mL的單抗樣品，不加糖苷酶37℃水浴3 h，4℃放置備用作為對(duì)照。

1.3.2聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳凝膠采用4.5%濃縮膠，12.5%分離膠。未經(jīng)任何處理的Mab1、Mab2原液樣品和經(jīng)水浴酶解的樣品以及經(jīng)水浴未酶解的樣品與4×還原樣品緩沖液混合均勻，70℃水浴3 min后10 000 r/min離心1 min。上樣量為10 μg，恒流電泳，濃縮膠電流為10 mA，待指示劑進(jìn)入分離膠后調(diào)整電流至20 mA，指示劑距凝膠底部0.5 cm時(shí)停止電泳。

1.3.3糖蛋白染色電泳結(jié)束后將電泳膠放入50%乙醇中固定2 h；再放入1%高碘酸，3%乙酸溶液搖洗15 min氧化；3%乙酸-水溶液搖洗2次，每次10 min；希夫試劑避光搖洗45 min染色；0.1%偏重亞硫酸鈉，10 mmol/L鹽酸搖洗30 min顯色。

1.3.4考馬斯亮藍(lán)染液復(fù)染將經(jīng)糖蛋白染色后的電泳凝膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液室溫振蕩染色1～2 h，染色完成后用蒸餾水漂洗凝膠去除殘留的染色液，再加入脫色液脫色至凝膠背景透明后用掃描儀掃描記錄，凝膠用保存液保存。

1.3.5毛細(xì)管電泳(CE-SDS)將抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品、水浴處理抗體對(duì)照樣品50 μL與50 μL CE-SDS樣品緩沖液混勻，向其中加入5 μL β-巰基乙醇，70℃水浴15 min，室溫水浴5 min，10 000 r/min離心1 min。轉(zhuǎn)移75 μL樣品至毛細(xì)管電泳儀樣品管中，進(jìn)行還原CE-SDS分析。電泳條件:毛細(xì)管溫度為18℃，在-10 kV電壓條件下進(jìn)樣30 s，然后在-15 kV電壓下以分離膠為電泳緩沖液分離40 min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

1.3.6中和活性檢測(cè)采用快速熒光灶抑制試驗(yàn)法(RFFIT)檢測(cè)抗體原液樣品、經(jīng)糖苷酶水解的抗體樣品和水浴處理的抗體對(duì)照樣品的抗狂犬病病毒的中和活性。將待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品3倍系列稀釋后與狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株 CVS 混合，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照孔和中和用病毒對(duì)照孔，混勻后置37℃中和1 h；再加入BSR細(xì)胞懸液，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h；待培養(yǎng)結(jié)束吸干培養(yǎng)液，加入PBS清洗并吸干后，再加入預(yù)冷至4℃的80%丙酮固定細(xì)胞30 min，棄丙酮；最后待揮發(fā)干燥后加入抗狂犬病病毒N蛋白熒光標(biāo)記抗體標(biāo)記熒光灶，37℃孵育30 min，棄去液體，并用PBS洗板、甩干，每孔加入80%甘油50 μL，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的ED50并按以下公式計(jì)算待測(cè)樣品的效價(jià)。

式中E為低于50%熒光灶比例的標(biāo)準(zhǔn)品/供試品稀釋度；F為供試品低于50%熒光灶比例孔的熒光灶百分比；G為供試品高于 50%熒光灶比例孔的熒光灶百分比；n2為供試品稀釋倍數(shù)。

供試品效價(jià)(IU/mL)=10(J-K)×L

式中J為標(biāo)準(zhǔn)品lgED50；K為供試品lgED50；L為標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)(IU/mL )。

2　結(jié)果與分析

2.1重組抗狂犬病毒單克隆抗體的糖染、復(fù)染結(jié)果

為檢測(cè)糖苷酶切除糖鏈條件是否可切除2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體的糖鏈，對(duì)抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品和水浴處理抗體對(duì)照樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)行糖染色和考馬斯亮藍(lán)復(fù)染。結(jié)果(圖1,彩圖見(jiàn)圖版二)顯示：①在糖染色中2種抗體的抗體原液樣品和水浴處理抗體對(duì)照樣品在重鏈位置均可見(jiàn)明顯條帶，輕鏈位置均無(wú)明顯條帶，表明這2種抗體的糖鏈可能主要位于重鏈，輕鏈上無(wú)糖鏈。而經(jīng)糖苷酶水解的抗體樣品未見(jiàn)明顯條帶，表明經(jīng)酶解的樣品不再含N-糖鏈；②經(jīng)考馬斯亮藍(lán)復(fù)染后所有的樣品均可見(jiàn)明顯條帶，但2種抗體經(jīng)糖苷酶水解抗體樣品的重鏈位置與其他2個(gè)樣品相比重鏈位置略偏下，這可能是因?yàn)榍谐擎満笾劓湻肿恿肯陆邓隆?/p>

圖1　Mab1和Mab2糖蛋白染色(A)和考馬斯亮藍(lán)染液復(fù)染(B)Fig.1　Gel staining of Mab1 and Mab2 by periodic acid-schiff method (A) and re-staining by coomassie brilliant blue(B).1：Mab1抗體樣品; 2：37℃水浴處理Mab1抗體對(duì)照樣品; 3：經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab1抗體樣品; 4：Mab2抗體樣品; 5：37℃水浴處理Mab2抗體對(duì)照樣品; 6：經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab2抗體樣品(彩圖見(jiàn)圖版二)

2.2重組抗狂犬病毒單克隆抗體還原CE-SDS結(jié)果

還原CE-SDS電泳可以實(shí)現(xiàn)將非糖基化重鏈與糖基化重鏈完全分離。為驗(yàn)證糖苷酶切除重組抗狂犬病毒單克隆抗體糖鏈的效果，對(duì)抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品和水浴處理抗體對(duì)照樣品進(jìn)行CE-SDS還原電泳。圖2、3(彩圖見(jiàn)圖版二)結(jié)果顯示：①M(fèi)ab1抗體和Mab2抗體原液樣品和水浴處理抗體對(duì)照樣品重鏈(含量均為66.0%)出峰時(shí)間重合, 在兩者重鏈前有少量的非糖基化重鏈成分(分別為0.4%和1.3%,n≥3); ②糖苷酶水解抗體樣品可以觀(guān)察到切除糖鏈的重鏈出峰時(shí)間提前至非糖基化重鏈成分處，其含量也顯著提高(Mab1抗體和Mab2抗體分別為65.4%和65.8%,n≥3)，糖基化重鏈含量大大降低(Mab1抗體和Mab2抗體分別為0.7%和1.2%,n≥3)，表明本研究所采用的酶切方法可去除Mab1抗體和Mab2抗體中98%的糖鏈結(jié)構(gòu)，糖鏈的切除比較完全。

2.3重組抗狂犬病毒單克隆抗體RFFIT活性測(cè)定結(jié)果

對(duì)2種抗體RFFIT活性測(cè)定結(jié)果(圖4)，結(jié)果采用SPSS軟件One-way ANOVA數(shù)據(jù)分析方法分析抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品和水浴處理抗體對(duì)照樣品效價(jià)對(duì)數(shù)值均值，分析結(jié)果表明2種抗體均無(wú)顯著差異(Mab1 sig=0.73, Mab2sig=0.13,n≥3)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明將糖鏈切除后2種單抗樣品的RFFIT活性未發(fā)生明顯變化。

圖2　Mab1還原CE-SDS圖譜Fig.2　The graph of reduced CE-SDS of Mab1.1.為Mab1抗體樣品還原CE-SDS圖譜;2.為經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab1抗體樣品還原CE-SDS圖譜;3.為37℃水浴處理Mab1抗體對(duì)照樣品還原CE-SDS圖譜。(彩圖見(jiàn)圖版二)

圖3　Mab2還原CE-SDS圖譜Fig.3　The graph of reduced CE-SDS of Mab2.1.為Mab2抗體樣品還原CE-SDS圖譜;2.為經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab2抗體樣品還原CE-SDS圖譜;3.為37℃水浴處理Mab2抗體對(duì)照樣品還原CE-SDS圖譜。(彩圖見(jiàn)圖版二)

3　討論

在SDS-PAGE糖蛋白染色圖譜中，可見(jiàn)在所選用的糖苷酶切除糖鏈的條件下基本無(wú)肉眼可見(jiàn)的糖蛋白條帶，表明絕大部分糖鏈已被切除。但糖蛋白染色法的靈敏度較低不能保證所有糖鏈均被切除，為避免其影響后續(xù)試驗(yàn)對(duì)結(jié)果的判斷，采用毛細(xì)管電泳法對(duì)糖鏈切除的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明糖鏈已切除完全。目前抗體N-糖鏈分析的常用方法有毛細(xì)管電泳(CELIF)、質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、親水相互作用色譜(HILIC-HPLC/UPLC)以及核磁共振法(NMR) 等，這些方法均具有良好的分離度、準(zhǔn)確性和精密性，并各有優(yōu)勢(shì)。由于不同抗體N-糖鏈分析方法的樣品處理過(guò)程和分離機(jī)理存在一些差異，使其在部分糖型的檢測(cè)中存在差異[13]。毛細(xì)管電泳具有高效、快速、分離度高、靈敏度高、分離模式多樣性以及操作相對(duì)簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，能夠在幾十分鐘內(nèi)完成對(duì)單抗N-糖鏈的檢測(cè)。因此在抗體N-糖鏈分析的檢驗(yàn)中，CELIF基于產(chǎn)品明確的表征信息，可用于單抗N-糖鏈進(jìn)行合理控制[13]。

圖4　RFFIT活性測(cè)定結(jié)果Fig.4　The bioactivity results by RFFIT.注：E為樣品效價(jià)測(cè)定值(IU/mL)；lgE為效價(jià)的對(duì)數(shù)值；Mean lgE為效價(jià)對(duì)數(shù)值的平均值。

本研究中的重組單抗Mab1和Mab2是針對(duì)狂犬病毒開(kāi)發(fā)的全人源抗狂犬病毒單抗。Mab1和Mab2切除N-糖鏈后抗體的中和活性未發(fā)生明顯下降。其原因可能是：在抗體的空間結(jié)構(gòu)上，抗狂犬病毒抗體的中和作用機(jī)制主要是通過(guò)抗體的Fab可變區(qū)與狂犬病毒表面的G蛋白進(jìn)行識(shí)別[14～16]，負(fù)責(zé)與抗原特異性結(jié)合;而其N(xiāo)-糖鏈位于CH2區(qū)，抗體N-糖鏈的修飾似乎可誘導(dǎo)CH2區(qū)發(fā)生結(jié)構(gòu)性改變，同時(shí)兩者在空間上有一定距離，從而導(dǎo)致這種改變并未延伸到抗原結(jié)合的Fab區(qū)，因此抗體N-糖鏈的切除不能明顯影響其與抗原的結(jié)合能力[17]。因此Mab1和Mab2兩種抗體的中和活性在切除糖鏈后無(wú)明顯變化，至于切除N-糖鏈對(duì)上述兩種抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、體內(nèi)活性、半衰期等方面是否有影響，則有待于我們進(jìn)一步的研究。

此外,目前已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用大腸桿菌、酵母等表達(dá)系統(tǒng)也獲得了一些抗狂犬病毒抗體或者片斷，如二硫鍵穩(wěn)定性Fv 抗體片段(disulfide-stabilized Fv fragment, dsFv)、單鏈Fv片段(single-chain Fv fragment, scFv)等，并對(duì)它們抗狂犬病毒的中和活性進(jìn)行了深入的研究。趙小玲等[18]使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得人源抗狂犬病毒二硫鍵穩(wěn)定性Fv抗體片段(dsFv)，其對(duì)狂犬病毒的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， dsFv可特異的中和狂犬病毒，阻止狂犬病毒對(duì)Vero 細(xì)胞的吸附，從而抑制靶細(xì)胞感染，使蝕斑減少甚至消失。Duan等[19]對(duì)人源抗狂犬病毒單抗MAB57構(gòu)建了單鏈Fv片斷FV57，為增強(qiáng)其穩(wěn)定性和中和潛力，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了二硫鍵穩(wěn)定化的scFv，即ds-FV57 。該片段同樣是用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得，經(jīng)RFFIT活性檢測(cè)和小鼠狂犬病毒挑戰(zhàn)模型試驗(yàn)結(jié)果證明，它除了具有體外中和活性外，還能對(duì)小鼠抵抗狂犬病毒感染提供有效的保護(hù)作用。王丁丁等[20]使用分步整合法在巴氏畢赤酵母中表達(dá)人抗狂犬病毒全分子抗體，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示該抗體具有良好的狂犬病毒抗原結(jié)合活性。以上研究中由大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的產(chǎn)物不具有糖基化或糖基化不完全，而這些分子均具有抗狂犬病毒的中和活性。因此有力的證明了在抗狂犬病毒抗體對(duì)狂犬病毒的中和作用中，N-糖鏈可能不是其發(fā)揮中和作用必需的結(jié)構(gòu)，中和作用的核心在于抗體可變區(qū)對(duì)抗原的識(shí)別和結(jié)合。也就是說(shuō)，由于切除的N-糖鏈位于抗體Fc區(qū)，而中和活性應(yīng)該與抗體的Fab區(qū)關(guān)系更為密切。

同時(shí)國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，如果刪除糖鏈，可使靶抗原結(jié)合能力下降。陶磊等[21]對(duì)重組嵌合抗CD20 IgG1型單抗糖鏈切除對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的影響進(jìn)行了研究，研究結(jié)果顯示切除N-糖鏈后IgG1型單抗對(duì)CD20的抗原結(jié)合能力下降，體外CDC活性基本消失，糖鏈?zhǔn)蔷S持該IgG1型單抗正常結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分。而本研究使用RFFIT檢測(cè)待測(cè)品的抗狂犬病毒中和活性的研究結(jié)果則表明，N-糖鏈切除以及水浴對(duì)這兩種抗體中和活性均無(wú)明顯影響。

綜上所述，N-糖鏈對(duì)重組單抗的生物學(xué)功能的影響因抗體分子不同而機(jī)制各異，不能一概而論。尤其對(duì)于全新的單抗分子，其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系更是需要進(jìn)行詳細(xì)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究，才能逐步明晰抗體分子精細(xì)結(jié)構(gòu)與具體功能之間的內(nèi)在聯(lián)系。

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Effect of the N-glycan Removal on the Neutralization Activity of Recombinant Anti-rabies Monoclonal Antibodies

LV Ruo-yun§, WANG Hui§, CHEN Chen, ZHANG Shi-xiong, ZHANG Xiao-nan, CAO Chen-hua, WEI Jing-shuang*

StateKeyLaboratoryofAntibodyResearch&Development,NewDrugResearchandDevelopmentCompanyLtd.,NorthChinaPharmaceuticalCorporation,Shijiazhuang050015,China

The recombinant anti-rabies monoclonal antibody were fully-human-derived antibody and were used for post-explosure prophylaxis of rabies virus. The N-glycan of two anti-rabies monoclonal antibodies (Mab1 and Mab2) were hydrolyzed by the PNGase in this study, the capillary electrophoresis and gel staining by periodic acid-schiff method were used to determine the residual N-glycan after hydrolysis. The rapid fluorescent focus inhibition test was used to compare the neutralization bio-activity of the intact Mab1 and the Mab2 without N-glycan. The result showed that the neutralization bioactivity of Mab1 and Mab2 did not change after the N-glycan was removed from the antibodies. That suggests the N-glycan was not the indispensable composition for in-vitro neutralization bioactivity of Mab1 and Mab2.

recombinant anti-rabies virus monoclonal antibody; N-glycan removal; capillary electrophoresis; neutralization activity

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.10

2016-05-18; 接受日期：2016-06-12

“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX09201041)資助。

§呂若蕓與王輝為本文共同

。呂若蕓，工程師，研究方向?yàn)閱慰顾幬锛兓c質(zhì)量研究。E-mail:lvry2010@163.com。王輝，工程師，研究方向?yàn)閱慰顾幬锛兓c質(zhì)量研究。E-mail：whui@163.com。*通信作者：魏敬雙，正高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)藥物研發(fā)。E-mail:weijsh@hotmail.com