腸復(fù)康方對(duì)急性放射性腸炎大鼠小腸黏膜細(xì)胞凋亡基因的影響

李思聰，李玉明

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙　410007；2.湖南省腫瘤醫(yī)院　中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙　410013)

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腸復(fù)康方對(duì)急性放射性腸炎大鼠小腸黏膜細(xì)胞凋亡基因的影響

李思聰1，李玉明2

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410007；2.湖南省腫瘤醫(yī)院中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410013)

[摘要]目的探討腸復(fù)康方對(duì)急性放射性腸炎大鼠一般情況及小腸黏膜相關(guān)細(xì)胞凋亡基因的影響。方法以X線直線加速器給予實(shí)驗(yàn)大鼠全腹照射，建立急性放射性腸炎大鼠模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，腸復(fù)康方低、中、高劑量組。模型復(fù)制成功后，腸復(fù)康各劑量組給予10 mL/kg灌胃，低、中、高劑量組劑量換算后分別含生藥15.75、31.50、63.00 g/kg，模型對(duì)照組、正常對(duì)照組同時(shí)予等量生理鹽水，連續(xù)30 d灌胃。期間觀察大鼠精神狀態(tài)、攝食進(jìn)水、排便情況及體質(zhì)量變化，處死后取相應(yīng)部位的小腸用免疫組化及Western blot方法檢測(cè)黏膜上皮細(xì)胞中凋亡基因Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果腸復(fù)康方干預(yù)大鼠的精神狀態(tài)、飲食進(jìn)水、排便情況較模型對(duì)照組改善；與模型對(duì)照組比較，腸復(fù)康方干預(yù)大鼠體質(zhì)量顯著增加，以中劑量組效優(yōu)(P<0.05)。腸復(fù)康方低、中、高劑量組小腸黏膜的凋亡基因Caspase-3、Bax和Bax/Bcl-2表達(dá)較模型對(duì)照組顯著下調(diào)、Bcl-2顯著上調(diào)(P<0.05)，中劑量效優(yōu)。結(jié)論腸復(fù)康方具有改善急性放射性腸炎大鼠一般情況及抑制其細(xì)胞凋亡作用，以中劑量效優(yōu)，其機(jī)制可能與下調(diào)小腸黏膜上皮凋亡基因Caspase-3、Bax表達(dá)及上調(diào)Bcl-2的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腸復(fù)康方；放射性腸炎；動(dòng)物模型；細(xì)胞凋亡

放射性腸炎是盆腔、腹腔或腹膜后惡性腫瘤放療后的主要并發(fā)癥，可累及小腸、結(jié)腸、直腸，其中小腸損害為高發(fā)區(qū)，且預(yù)后較大腸預(yù)后差。目前臨床上西醫(yī)主要采用手術(shù)、營(yíng)養(yǎng)支持療法及對(duì)癥處理，遠(yuǎn)期療效并不理想。湖南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科經(jīng)驗(yàn)方腸復(fù)康方在改善放射性腸炎臨床癥狀上療效滿意[1-2]。既往實(shí)驗(yàn)研究[3-4]證實(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是放射性腸炎形成的重要機(jī)制，其中與放射性腸炎密切相關(guān)的凋亡基因有Caspase-3、Bax、Bcl-2等。筆者通過(guò)觀察低、中、高劑量組腸復(fù)康方藥液對(duì)直線加速器誘導(dǎo)的急性放射性腸炎大鼠一般情況及小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡基因的影響，探討腸復(fù)康方改善急性放射性腸炎癥狀的機(jī)制。

1　材料

1.1動(dòng)物健康成年SPF級(jí)SD大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量為(220±20)g，由湖南省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證為SYXK(湘)2014-0016。在湖南省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF條件下飼養(yǎng)，室溫為20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，持續(xù)12 h明暗交替日光燈照明，以無(wú)菌處理的標(biāo)準(zhǔn)鼠食飼養(yǎng)，自由活動(dòng)，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，模型復(fù)制后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)性喂養(yǎng)30 d。

1.2藥液腸復(fù)康方由金銀花、連翹、白頭翁、薏苡仁、谷芽各15 g，敗醬草、苦參、黃柏、蒼術(shù)、金錢(qián)草、車(chē)前草、仙鶴草、烏藥、白術(shù)、川牛膝各10 g組成，由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥房提供中藥飲片。參考《標(biāo)準(zhǔn)湯劑論》[5]制備腸復(fù)康方低、中、高劑量藥液，分別含生藥1.575、3.15、6.3 g/mL，每次制備7 d的藥量，置于4 ℃冰箱中備用[6]。

1.3儀器X線直線加速器：美國(guó)Elekta Synergy；DM4000 B LED顯微鏡系統(tǒng)：德國(guó)徠卡；RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)：德國(guó)徠卡；TK-212型自動(dòng)恒溫漂片儀：泰維科技；Varistain Gemini ES自動(dòng)染色機(jī)：賽默飛世爾；TGL-18R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：深圳黑馬；164-5050電泳儀：Bio-rad；DYCZ-24EN電泳槽：北京六一；DYCZ-40A轉(zhuǎn)膜儀：北京六一。

1.4試劑3%戊巴比妥鈉：德國(guó)merck；目測(cè)八聯(lián)試紙：廣州花都高爾寶；兔來(lái)源一抗Caspase-3：美國(guó)proteintech，批號(hào)為19677-1-AP；兔來(lái)源一抗Bax：美國(guó)proteintech，批號(hào)為50599-2-Ig；兔來(lái)源一抗Bcl-2：美國(guó)proteintech，批號(hào)為12789-1-AP；鼠來(lái)源一抗Actin：美國(guó)proteintech，批號(hào)為600008-1-Ig；HRP山羊抗鼠IgG：美國(guó)Proteintech。

2　方法

2.1模型復(fù)制SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均禁食12～14 h，稱質(zhì)量，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉后，固定在手術(shù)板上，于長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院放療科以X線直線加速器給予大鼠全腹部照射(從劍突至恥骨聯(lián)合)，照射面積8.5 cm×7.5 cm，源皮距100 cm，腹部給予1 cm組織補(bǔ)償，照射劑量9 Gy，放射劑量率為300 cGy/min，照射時(shí)間約3 min。參照楊永濱等[6]急性放射性腸炎模型復(fù)制成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：受照射大鼠1 d內(nèi)出現(xiàn)吐黃水或大便性狀改變，如黏液便、便血等放射性損傷癥狀，或用目測(cè)八聯(lián)試紙檢測(cè)大便呈潛血強(qiáng)陽(yáng)性()。該實(shí)驗(yàn)已通過(guò)湖南省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)評(píng)審。

2.2動(dòng)物分組將大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組8只，未經(jīng)腹部照射；將模型復(fù)制成功的大鼠分成模型對(duì)照組，腸復(fù)康方低、中、高劑量組，每組10只。

2.3給藥方法于判定模型復(fù)制成功后，參考李晟等[7]方法開(kāi)始灌胃：灌胃容積均為10 mL/kg，腸復(fù)康方低、中、高劑量組劑量分別為15.75、31.50、63.00 g/kg，其中腸復(fù)康方低劑量為臨床等效劑量；模型組、正常對(duì)照組，同時(shí)予等量生理鹽水灌胃；每日1次，連續(xù)30 d。

2.4觀察指標(biāo)及方法

2.4.1大鼠一般情況及體質(zhì)量變化每天觀察模型復(fù)制成功后灌胃期間大鼠精神狀態(tài)、攝食進(jìn)水、排便情況變化；以電子秤稱取各組大鼠體質(zhì)量，7 d一次。

2.4.2免疫組化法檢測(cè)大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平取大鼠回盲部近端中段回腸3 cm，沿縱軸剪開(kāi)，冷生理鹽水洗凈，放置于盛有甲醛溶液的離心管中固定，然后移至4～6 ℃冰箱冷藏保存。取上述少量標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋，常規(guī)切片3 μm，Caspase-3、Bax、Bcl-2分別做稀釋比例為1∶200、1∶50、1∶100的免疫組化染色，再采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)法、3，3-二氨基苯聯(lián)胺(diaminobenzidine，DAB)顯色。具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)比試劑盒陽(yáng)性對(duì)照片染色，在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察。依據(jù)E Specht等[8]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估腸黏膜上皮Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的免疫反應(yīng)情況(染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量)。染色強(qiáng)度分為：陰性(未著色)為0分，弱陽(yáng)性(淺黃色)為1分，陽(yáng)性(黃色)為2分，強(qiáng)陽(yáng)性(黃褐色)為3分；然后計(jì)算每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(≥1分的細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×100)。結(jié)合染色強(qiáng)度(0、1、2、3分)和該陽(yáng)性強(qiáng)度的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，計(jì)算每張切片的組織學(xué)評(píng)分(H-SCORE)。H-SCORE=[1×(%cell 1+)+2×(%cell 2+)+3×(%cell 3+)]。

2.5Western blot法檢大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平取大鼠回盲部近端中段回腸3 cm，沿縱軸剪開(kāi)，冷生理鹽水洗凈，放置于盛有甲醛溶液的離心管中固定，然后移至4～6 ℃冰箱冷藏保存。取少量標(biāo)本提取小腸組織總蛋白質(zhì)，經(jīng)加入四甲基二乙胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)配制的SDS-PAGE凝膠電泳后，分別切取含Bax(約21 kD)、Bcl-2(約26 kD)、Caspase-3/p17(約32 kD)和Actin(約42 kD)的凝膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用三羥甲基氨基甲烷加聚山梨酯緩沖鹽溶液配制5%脫脂奶粉封閉1 h后，一次孵育一抗、二抗，Bax、Bcl-2、Caspase-3和Actin的一抗稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500、1∶200、1∶4 000，二抗稀釋比例為1∶3 000，ECL反應(yīng)曝光、顯色后用quantity one專業(yè)灰度分析軟件將條帶的灰度值數(shù)字化，將以Actin作內(nèi)參照對(duì)比得到的相對(duì)灰度進(jìn)行分析。

3　結(jié)果

3.1大鼠一般情況及體質(zhì)量變化在模型復(fù)制過(guò)程中，模型組因麻醉過(guò)量死亡1只大鼠；模型復(fù)制成功后，腸復(fù)康方中劑量組因灌胃不當(dāng)死亡1只。模型復(fù)制成功后，第4～7天模型組大鼠一般情況最差，大部分有黏液便或稀爛便，精神較差，甚至不進(jìn)食和不飲水。第7～10天各組大鼠的精神狀態(tài)、飲食和進(jìn)水逐漸恢復(fù)，模型組仍有少量黏液便或稀爛便。各組大鼠的體質(zhì)量變化情況見(jiàn)表1。以模型對(duì)照組和正常對(duì)照組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩因素混合設(shè)計(jì)的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，結(jié)果顯示，模型因素和時(shí)間因素對(duì)大鼠體質(zhì)量的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Greenhouse-Geisser校正，F(xiàn)(1.560,23.398)=142.95，P=0.000)；以模型對(duì)照組和腸復(fù)康方低、中、高劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩因素混合設(shè)計(jì)的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果顯示，劑量因素和時(shí)間因素對(duì)大鼠體質(zhì)量的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Greenhouse-Geisser校正，F(xiàn)(5.673，64.290)=17.64，P=0.000)。故以簡(jiǎn)單效應(yīng)分析為主。模型復(fù)制后各組大鼠體質(zhì)量逐漸升高，后一時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量均顯著高于前一時(shí)點(diǎn)(P<0.05)，至模型復(fù)制后第29天升至最大值；自模型復(fù)制后第8天開(kāi)始，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；自模型復(fù)制后第15天，腸復(fù)康方中劑量組大鼠體質(zhì)量顯著大于模型對(duì)照組(P<0.05)；至模型復(fù)制后第29天，腸復(fù)康方中劑量組大鼠體質(zhì)量顯著大于模型對(duì)照組和腸復(fù)康方低劑量組和高劑量組。

表1　各組大鼠體質(zhì)量變化比較±s)

注：與模型復(fù)制后第1天比較，aP<0.05；與模型復(fù)制后第8天比較，bP<0.05；與模型復(fù)制后第15天比較，cP<0.05；與模型復(fù)制后第22天比較，dP<0.05；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與腸復(fù)康方低劑量組比較，△P<0.05；與腸復(fù)康方中劑量組比較，◇P<0.05。

3.2各組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平比較(免疫組化SP法)腸黏膜上皮背景被染成淡藍(lán)色，免疫陽(yáng)性物質(zhì)集中在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。見(jiàn)圖1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，提示小腸黏膜受放射線刺激后Caspase-3、Bax表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低。模型對(duì)照組和腸復(fù)康方低、中、高劑量組Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Caspase-3：F(3，34)=45.05，P=0.000；Bax：F(3，34)=13.06，P=0.000；Bcl-2：F(3，34)=26.21，P=0.000)，提示腸復(fù)康方對(duì)腸黏膜Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)水平的效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性。均數(shù)的多重比較發(fā)現(xiàn)，腸復(fù)康方中劑量對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)水平的效應(yīng)最顯著。見(jiàn)表2和圖1。

圖1　各組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較(Western blot染色，10×40倍)

3.3各組黏膜上皮細(xì)胞中凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(Westren blot法)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Caspase-3、Bax相對(duì)表達(dá)水平和Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.05)，Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。模型對(duì)照組和腸復(fù)康方低、中、高劑量組Caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Caspase-3：F(3，34)=57.84，P=0.000；Bax：F(3，34)=79.63，P=0.000；Bcl-2：F(3，34)=120.18，P=0.000；Bax/Bcl-2：F(3，34)=79.17，P=0.000)，表明腸復(fù)康方對(duì)這3種凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的效應(yīng)均具有劑量依賴性。均數(shù)的多重比較顯示，腸復(fù)康方中劑量升高Caspase-3、Bax和Bax/Bcl-2的效應(yīng)以及降低Bcl-2的效應(yīng)最明顯，與模型對(duì)照組，腸復(fù)康方低、高劑量組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表3。

表2　各組大鼠小腸黏膜上皮Caspase-3、Bax和Bcl-2表達(dá)水平比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與腸復(fù)康低劑量組比較，△P<0.05；與腸復(fù)康中劑量組比較，◇P<0.05。

注：1.腸復(fù)康方低劑量組；2.腸復(fù)康方中劑量組；3.腸復(fù)康方高劑量組；4.模型對(duì)照組；5.正常對(duì)照組。

圖2　各組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平比較(Western blot法)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05；與腸復(fù)康方低劑量組比較，△P<0.05；與腸復(fù)康方中劑量組比較，◇P<0.05。

4　討論

放射治療已成為盆腔、腹腔或腹膜惡性腫瘤綜合治療的重要組成部分，伴隨患者生存情況改善所帶來(lái)的腸道并發(fā)癥逐年上升，由1990年的0.5%～17%上升至2007年5%～20%[9]， 65%～75%患者放療后引起的腸道組織損傷成為制約其療效的主要因素[10]。據(jù)研究[11]，10%～21%經(jīng)過(guò)盆腹腔放療的患者發(fā)生放射性腸炎可累及小腸、結(jié)腸、直腸。小腸的放射損傷預(yù)后較大腸差，而末端回腸因相對(duì)固定并鄰近盆腔照射野，所以是小腸損害高發(fā)區(qū)[12]，且以腸黏膜基底部的隱窩細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞表現(xiàn)最為明顯[13]。

湖南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科王云啟教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為放射性腸炎病變部位在大、小腸，與脾胃關(guān)系密切相關(guān)；致病的主因是放射線“熱毒”的損傷侵犯；病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，氣機(jī)失調(diào)為其根本。放射性腸炎臨床以濕熱蘊(yùn)結(jié)證型多見(jiàn)，治療原則以“急則治其標(biāo)”，以清利濕熱調(diào)理氣機(jī)為主，擬定腸復(fù)康方以清利下焦?jié)駸?、理氣行滯。腸復(fù)康方由金銀花、連翹、敗醬草、白頭翁、苦參、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、金錢(qián)草、車(chē)前草、仙鶴草、烏藥、白術(shù)、谷芽、川牛膝等組成。其中以金銀花、連翹、敗醬草、白頭翁為君，共奏清熱解毒之功。以“治癰要藥”金銀花與“瘡家圣藥”連翹相須為用，消散腸癰；敗醬草為治療腸癰腹痛的首選，而白頭翁善清胃腸濕熱，兩者均歸大腸經(jīng)，以排癰涼血、燥濕止痢?？鄥?、黃柏、蒼術(shù)、金錢(qián)草、車(chē)前草為臣，達(dá)清利下焦?jié)駸嶂?。黃柏主入下焦，清熱燥濕；苦參、蒼術(shù)主入脾胃，既內(nèi)燥脾濕以杜生濕之源，又能外散濕邪，相合為用，潔源清流，濕熱同除；金錢(qián)草、車(chē)前草共用，為利小便以實(shí)大便。薏苡仁、白術(shù)、谷芽、烏藥、仙鶴草為佐。薏苡仁、白術(shù)合用以健脾運(yùn)濕，加強(qiáng)清利濕熱之功；谷芽和胃消食，烏藥溫通止痛，一起可防止苦寒之品敗壞胃氣；仙鶴草性平，味澀收斂，加強(qiáng)止血止痢，兼可補(bǔ)虛，尤適于血痢及久病瀉痢。川牛膝為使藥，苦善降泄，能導(dǎo)熱下泄，引血下行。諸藥合用，組方嚴(yán)謹(jǐn)、配伍合理，在經(jīng)方基礎(chǔ)上繼承創(chuàng)新。

現(xiàn)代藥理研究表明，金銀花中多種成分均有抗菌作用，其中黃酮類物質(zhì)對(duì)各類腸道致病菌有著顯著的抵抗或抑制效用[14]；連翹中的連翹酯苷具有廣譜抗菌、解熱抗炎等作用[15]。白頭翁具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、抗炎、抗病原微生物及治療內(nèi)毒素血癥等作用[16-17]。白術(shù)可以調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，還能抗?jié)?、增?qiáng)免疫力[18]430。敗醬草不但具有抑菌抗炎等作用，還可以鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛[18]124。另外苦參、黃柏、蒼術(shù)、仙鶴草也均有抗炎抑菌的作用，仙鶴草還可以通過(guò)改善微循環(huán)，減輕黏膜炎癥，加速黏膜修復(fù)[20]。

各種腸炎從病理學(xué)上區(qū)分，放射性腸炎主要為黏膜下間質(zhì)水腫、局部出血和明顯質(zhì)深染的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，潰瘍性結(jié)腸炎主要為炎癥性改變及黏膜下隱窩膿腫形成，克羅恩病主要為裂隙樣潰瘍和結(jié)節(jié)病樣肉芽腫，缺血性腸炎可見(jiàn)含鐵巨噬細(xì)胞[20]。但都是由于腸黏膜受損而出現(xiàn)腸道癥狀，如腹痛、腹瀉、便血，故臨床辨證為濕熱蘊(yùn)結(jié)于腸道，均可予腸復(fù)康方加減。

Caspase是參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的指揮中樞之一，學(xué)界普遍認(rèn)同Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的最重要的蛋白酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶[21]，有著“死亡蛋白酶”之稱。Song S等[22]研究認(rèn)為急性放射性腸炎的發(fā)生與Fas通路有關(guān)， FasⅡ型細(xì)胞(如肝細(xì)胞)通過(guò)線粒體膜電勢(shì)的消失，線粒體膜通透性增高，釋放細(xì)胞色素c促進(jìn)形成凋亡體，然后召集并激活Caspase-3，進(jìn)而引發(fā)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23]，通過(guò)線粒體膜通道開(kāi)放、通透性轉(zhuǎn)換導(dǎo)致細(xì)胞凋亡已被證實(shí)[24-25]。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)腸復(fù)康方干預(yù)后，大鼠小腸黏膜中Caspase-3降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了腸復(fù)康方能夠抑制急性放射性腸炎的細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族是目前凋亡分子機(jī)制研究的熱門(mén)靶分子，在凋亡的調(diào)控中，Bcl-2和Bax可相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，正常情況下Bax、Bcl-2的表達(dá)量處于相對(duì)的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)Bcl-2占優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞免遭凋亡，Bax/Bcl-2比值改變決定細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是凋亡調(diào)控的一個(gè)重要因素[26]。袁翠堂[27]研究證實(shí)放射性損傷后患者黏膜細(xì)胞凋亡增強(qiáng)與Bcl-2的參與有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)腸復(fù)康方干預(yù)后大鼠小腸黏膜中Bax降低、Bcl-2升高，使得Bax/Bcl-2降低，說(shuō)明腸復(fù)康方能夠下調(diào)急性放射性腸炎的細(xì)胞凋亡水平。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)韓磊等[28]用不同劑量全腹照射后大鼠的腸黏膜損傷情況，選用9.0 Gy復(fù)制符合臨床急性放射性腸炎腸黏膜屏障損傷的急性放射性腸炎動(dòng)物模型，成功率為97.5%，其中有1只大鼠因模型復(fù)制過(guò)程中麻醉過(guò)量而死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸復(fù)康方干預(yù)急性放射性腸炎可以改善大鼠的黏液便或稀爛便、精神狀態(tài)、飲食進(jìn)水、體質(zhì)量變化等一般情況，其機(jī)制可能與下調(diào)促凋亡基因Caspase-3和Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。其中以腸復(fù)康方中劑量組效果較優(yōu)，這種作用與藥物的劑量有關(guān)，劑量過(guò)低時(shí)療效一般，達(dá)到中劑量時(shí)療效增強(qiáng)，但再增加劑量療效又隨之降低。腸復(fù)康方低劑量為臨床等效劑量，低、中、高劑量比例為1∶2∶4，高劑量組大鼠的一般情況及體質(zhì)量變化不如中劑量組，參考文獻(xiàn)[29]，考慮與劑量過(guò)高、濃度過(guò)高、大鼠腸道吸收達(dá)到飽和、使藥物不能充分發(fā)揮作用有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：湖南省中醫(yī)藥管理局一般課題(201177)

作者簡(jiǎn)介：李思聰(1991-)，女，碩士研究生

通信作者：李玉明，liyuming@hnszlyy.com

[中圖分類號(hào)]R516.1[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.019

(收稿日期：2016-02-19；編輯：曹健)

Effect of Changfukang Prescription on Apoptotic Genes in Small Intestinal Mucosa in Rats with Acute Radiation Enteritis

LISi-cong1,LIYu-ming2

(1.HunanUniversityofChineseMedicine,HunanChangsha410007,China；2.HunanCancerHospital&TheAffiliatedTumorHospital,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,HunanChangsha410013,China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of Changfukang prescription on general condition and apoptotic genes in the small intestinal mucosa in rats with acute radiation enteritis. MethodsAn X-ray linear accelerator was used to perform total abdominal irradiation for experimental rats to establish the rat model of acute radiation enteritis. The experimental rats were randomly divided into normal control group, model control group, and low-, medium-, and high-dose Changfukang groups. After the model was successfully established, all rats in the low-, medium-, and high-dose Changfukang groups were given 10 mL/kg Changfukang decoction by gavage, equivalent to doses of the crude drug of 15.75 g/kg, 31.50 g/kg, and 63.00 g/kg, respectively, as was determined by dose conversion. The rats in the model control group and the normal control group were given normal saline of the same volume by gavage. All the rats were treated by gavage for 30 days continuously. The mental state, food and water intake, defecation, and change in body weight were observed. After the rats were sacrificed, the corresponding small intestinal tissues were harvested, and immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression of apoptotic genes Caspase-3, Bax, and Bcl-2 in small intestinal epithelial cells. ResultsCompared with the model control group, the Changfukang groups showed significant improvements in the mental state, food and water intake, and defecation, as well as significant increases in body weight, and the medium-dose Changfukang group showed the best response (P<0.05). Compared with the model control group, the low-, medium-, and high-dose Changfukang groups showed significantly downregulated expression of Caspase-3 and Bax, a significant decrease in Bax/Bcl-2 ratio, and significantly upregulated expression of Bcl-2 (P<0.05), and the medium-dose Changfukang group showed the best response.ConclusionChangfukang prescription can improve the general condition of rats with acute radiation enteritis and inhibit cell apoptosis, and the medium-dose Changfukang decoction has the best effect. Its mechanism may be related to downregulation of the expression of apoptotic genes Caspase-3 and Bax, upregulation of the expression of Bcl-2, and inhibition of cell apoptosis in small intestinal epithelial cells.

[Key words]Changfukang prescription;Radiation enteritis;Animal model; Cell apoptosis