雞組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶殘留的HPLC-MS/MS測定

徐　維，曾振靈，權(quán)　丹，周雨卉，王　佩，王嘉鵬，韓可可，陳　紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院國家獸藥殘留基準實驗室，廣東廣州 510642)

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雞組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶殘留的HPLC-MS/MS測定

徐維，曾振靈，權(quán)丹，周雨卉，王佩，王嘉鵬，韓可可，陳紅*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院國家獸藥殘留基準實驗室，廣東廣州 510642)

摘要：建立了同時測定雞組織中殘留的磺胺對甲氧嘧啶(SMD)和二甲氧芐啶(DVD)了的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。樣品經(jīng)乙腈提取，取部分提取液用正己烷脫脂后于氮氣吹干，殘渣用流動相溶解并定容后上機檢測，外標法定量。采用C18色譜柱，流動相為乙腈和1 mL/L甲酸水溶液。選擇1個母離子和2個子離子進行反應(yīng)監(jiān)測，對磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶殘留進行定性，選擇信號最強的子離子進行定量。結(jié)果顯示，SMD和DVD分別在1 ng/mL～200 ng/mL和0.5 ng/mL～100 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.992。通過空白樣品添加回收試驗，所有基質(zhì)中SMD和DVD的定量限分別為10 μg/kg和5 μg/kg，SMD和DVD分別在50、100、200 μg/kg和25、50、100 μg/kg 3個添加水平下的回收率為71.7%～115.0%，相對標準偏差為1.8%～13.2%，該方法定量限低，靈敏度高，重現(xiàn)性好，符合相關(guān)研究的要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；磺胺對甲氧嘧啶；二甲氧芐啶；殘留；雞

磺胺對甲氧嘧啶(sulfametoxydiazine，SMD)是磺胺類藥物的一種，其抗菌范圍廣、副作用小，乙酰化率低，且溶解度高，獸醫(yī)臨床上SMD常用于敏感菌所致的泌尿生殖道感染、呼吸道感染、消化道感染和皮膚軟組織感染及飼料添加劑[1]。二甲氧芐啶(diaveridine,DVD)屬于磺胺增效劑的一種，抗菌譜較廣，對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抗菌作用。二甲氧芐啶與磺胺對甲氧嘧啶混合制成預(yù)混劑可用于治療家禽細菌感染，對球蟲病和畜禽腸道感染也有良好的防治作用[2]。但這2種藥物都有一定的毒性且在實際生產(chǎn)中過量使用會導(dǎo)致在食用動物產(chǎn)品中大量殘留，給人類健康帶來潛在的威脅。國際食品法典委員會(CAC)和很多國家都規(guī)定，食品中磺胺類藥物總量及單個藥物的最大殘留限量(MRL)為100 μg/kg[3]。目前關(guān)于磺胺類藥及其增效劑的報道有很多，但大部分是采用多殘留方法[4-6]，前處理方法繁瑣，而且不適用于雞組織樣品中的檢測。本試驗旨在建立一種適用于雞組織中同時測定磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶殘留量的簡便前處理方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用動物供試雞為白羽肉雞，購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城正大肉雞發(fā)展中心，35日齡，體重在2.0 kg～2.5 kg之間，籠養(yǎng)，自由飲水、采食不含抗菌藥物的全價飼料。

1.1.2儀器設(shè)備液相質(zhì)譜儀(Agilent6430型串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜)，美國Agilent公司產(chǎn)品；Agilent1200液相色譜儀、可調(diào)微量移液器，法國Gilson公司產(chǎn)品；超純水器，美國Milli2Q公司產(chǎn)品；臺式高速離心機(Centrifuge5804)，Eppendorf公司產(chǎn)品；FJ-200漩渦混懸器，上海滬西分析儀器廠生產(chǎn)；電子分析天平(日本/島津AUW120D型)。

1.1.3藥品與主要試劑乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，Merck公司產(chǎn)品；正己烷(分析純)，國產(chǎn)；磺胺對甲氧嘧啶標準品(含量99.0%)，購于Dr．Ehrenstorfer GmbH。

磺胺對甲氧嘧啶貯備液(1 mg/mL)：準確稱取10.10 mg磺胺對甲氧嘧啶對照品于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于-20℃條件下貯存，根據(jù)需要再用乙腈稀釋成適當濃度的標準工作液。

二甲氧芐啶(含量100%)，購于中國藥品生物制品檢定所。

二甲氧芐啶貯備液(1 mg/mL)：準確稱取10.00 mg二甲氧芐啶對照品于10 mL棕色容量瓶中，少量0.1 mol/L鹽酸溶解后用乙腈定容，配成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，置-20℃條件下貯存，根據(jù)需要再用乙腈稀釋成適當濃度的標準工作液。

1.2方法

1.2.1樣品的制備樣品的制備包括取絞碎后的供試樣品，作為供試試料；取絞碎后的空白樣品，作為空白試料；取絞碎后的空白樣品，添加適宜濃度的標準溶液作為空白添加試料。

1.2.2提取準確稱取1.00 g±0.02 g樣品(雞肉、皮脂、肝和腎)于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，于水平振蕩器300 mot/min振蕩20 min，8 000 r/min離心10 min，將乙腈層轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。再用4 mL乙腈重復(fù)提取殘渣1次，合并提取液，用乙腈定容至10 mL。準確移取1 mL提取液用1 mL乙腈飽和正己烷除脂兩次，棄去正己烷層，于35℃水浴中氮吹濃縮至干后，用1 mL 1 mL/L甲酸水與乙腈(95∶5)混合溶液溶解殘渣，渦旋混勻，15 000 r/min離心10 min，樣品過0.22 μm濾膜后移入棕色進樣瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.3液相色譜條件色譜柱：C18柱(150 mm×2 mm，5 μm，Phenomenex)；流速：0.25 mL/min。

進樣體積：5 μL；流動相：溶液A：1 mL/L甲酸水；溶液B：色譜乙腈。采用梯度洗脫，流動相梯度洗脫條件見表1。

表1　流動相梯度洗脫條件

1.2.4質(zhì)譜條件電噴霧離子化源，正離子掃描(Positive)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣：N2；干燥氣溫度：350℃；正模式毛細管電壓：3 500 V；磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶的質(zhì)譜碎片信息見表2。

表2　2種藥物的母離子與選擇離子碎片

注：下劃線的離子代表定量離子。

Note：Underlined ions were used to quantify.

1.2.5標準曲線及線性范圍為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，采用空白基質(zhì)匹配標準溶液法制得各個組織相應(yīng)的標準曲線：準確稱取1.00 g±0.02 g空白組織于50 mL離心管中，按照1.2.2所示方法處理樣品，用各組織的空白提取液分別稀釋SMD、DVD的儲備液，分別使SMD的線性范圍為1 ng/mL～200 ng/mL、DVD的線性范圍為0.5 ng/mL～100 ng/mL，并按1.2.3和1.2.4液質(zhì)條件進行測定。每個濃度樣品測定3次，連續(xù)測定3批，將測得的SMD和DVD的色譜峰面積(y)與相對應(yīng)的藥物濃度(x)作直線回歸，求得標準曲線方程和相關(guān)系數(shù)。1.2.6定量限(LOQ)和檢測限(LOD)準確稱取空白組織1.00 g±0.02 g，依次加入100 μL SMD和DVD不同質(zhì)量濃度的混合標準工作液，渦旋混勻，使得樣品中SMD和DVD的濃度分別為2、3、4、5、10 μg/kg，每個濃度做5個平行，按照1.2.2方法處理樣品，按1.2.3和1.2.4液質(zhì)條件進行分析檢測。以信噪比(S/N)≥3確定方法檢測限，以(S/N)≥10確定方法定量限。

1.2.7回收率及變異系數(shù)空白組織制成勻漿后，將一定量的SMD和DVD的混合標準工作液加入到1.00 g±0.02 g組織中，制得1/2MRL、MRL、2MRL 3個添加水平樣品，渦旋混勻，靜置30 min，按組織樣品提取凈化方法處理并進行HPLC-MS/MS測定。每個濃度做5個平行，共做3個批次，以樣品藥物峰面積與相應(yīng)濃度標準工作液的峰面積進行比較，求得高、中、低3種濃度下該方法的提取回收率，并計算批間和批內(nèi)變異系數(shù)。

2　結(jié)果

2.1色譜

本研究結(jié)果表明，在此條件下，磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶均能達到基線分離，峰形尖銳、對稱性好。所得雞空白組織、標準溶液、空白組織添加色譜圖見圖1、圖2和圖3。DVD及SMD的保留時間分別在7.6 min及8.2 min左右。

2.2標準曲線及線性范圍

空白組織中添加不同濃度的磺胺對甲氧嘧啶、二甲氧芐啶標準工作液后所得的標準曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3和表4。

圖1　空白組織色譜圖

圖2　5 ng/mL DVD (7.680 min)和10 ng/mL SMD (8.274 min)標準溶液色譜圖

圖3　空白組織添加DVD ( 100 μg/kg ) 和SMD(200 μg/kg)色譜圖

組織Tissues批次Batches線性范圍/(ng·g-1)Linearranges回歸方程Linearequations相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficients110～2000y=204.87x+166.260.9964肌肉Muscle210～2000y=185.17x+282.600.9970310～2000y=163.62x+275.400.9992110～2000y=150.29x+125.540.9980皮脂Skin+fat210～2000y=144.96x+146.560.9987310～2000y=116.63x+134.180.9996110～2000y=173.78x+107.400.9988肝臟Liver210～2000y=176.23x+126.830.9955310～2000y=159.10x+103.640.9948110～2000y=199.18x+235.600.9920腎臟Kidney210～2000y=181.11x+138.530.9938310～2000y=157.21x+119.710.9992

表4　雞組織中二甲氧芐啶的標準曲線

2.3定量限(LOQ)和檢測限(LOD)

按1.2.2方法處理樣品，得到各組織中磺胺對甲氧嘧啶的檢測限(LOD)為2 μg/kg，定量限(LOQ)為10 μg/kg；二甲氧芐啶的檢測限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg。

2.4回收率及變異系數(shù)

各空白組織中添加不同濃度的磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶的混合標準液后的回收率及變異系數(shù)結(jié)果見表5和表6。

從表5和表6可以看出，在雞組織中磺胺對甲氧嘧啶添加濃度為50、100、200 μg/kg 時，回收率在74.2%～115.0%范圍內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)CV<12%，批間變異系數(shù)CV<14%；二甲氧芐啶在雞組織樣品中添加濃度為25、50、100 μg/kg 時，回收率在71.7%～104.4%范圍內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)CV<11%，批間變異系數(shù)CV<14%；方法的準確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表5　二甲氧芐啶在雞組織中的添加回收率和變異系數(shù)

表6　磺胺對甲氧嘧啶在雞組織中的添加回收率和變異系數(shù)

3　討論

3.1提取劑的選擇

磺胺類藥物難溶于水，較易溶于稀酸、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷等有機溶劑[7]。二甲氧芐啶結(jié)構(gòu)式中含有氨基，具有弱堿性，在提取劑選擇方面，林海丹等用堿性二氯甲烷對組織中的敵菌凈(二甲氧芐啶)進行提取[2]。本試驗選用乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙腈、堿性乙腈、堿性乙酸乙酯為提取劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈對SMD的提取效率最好，堿性乙腈次之，乙酸乙酯及堿性乙酸乙酯提取液脂肪含量較高，不利于凈化處理，提取效率較低；但乙酸乙酯對二甲氧芐啶的提取效率高于乙腈。由于SMD為極性化合物易溶于極性有機試劑，而乙酸乙酯屬于中等極性且沉淀蛋白效果不如乙腈，因此，為了同時測定SMD和DVD，本研究采用乙腈提取的方法進行，提取液經(jīng)乙腈飽和正己烷脫脂凈化，可以脫去脂肪，減少雜質(zhì)的干擾，操作簡單。

3.2檢測方法的選擇

磺胺類藥物和二甲氧芐啶在250 nm～290 nm波長區(qū)間有強的紫外吸收，因此HPLC的在線檢測，一般采用紫外檢測[8]。陳麗等[9]用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀測定動物源食品中二甲氧芐啶的殘留量，目標物能與干擾物質(zhì)完全分離。我們在研究中采用紫外檢測法分析后，發(fā)現(xiàn)二甲氧芐啶色譜峰與干擾峰重疊，無法定量和定性，磺胺對甲氧嘧啶色譜峰附近干擾峰多，定性準確性低。通過改變液相條件、提取溶劑、凈化處理都無法達到分離的目的，而質(zhì)譜檢測法，干擾峰少、藥物峰響應(yīng)值高，定性和定量的準確性都有明顯的優(yōu)勢且能夠達到同時測定磺胺對甲氧嘧啶與二甲氧芐啶的目的。因此，筆者采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測。

3.3色譜分離條件的選擇

磺胺類藥物和二甲氧芐啶結(jié)構(gòu)式中均含有多個胺基團，具有一定的弱堿性。因此，調(diào)節(jié)流動相中的pH，可以抑制弱堿的離解，從而導(dǎo)致保留時間的改變[10]。為了達到SMD和DVD與雜質(zhì)的有效分離和縮短樣品的分析時間，本研究采用乙腈1 mL/L甲酸水混合溶液作為流動相，進行梯度洗脫。本研究結(jié)果表明，在此條件下，磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶均能達到基線分離，峰形尖銳、對稱性好。所得雞空白組織、標準溶液、空白組織添加色譜圖見圖1、圖2和圖3。DVD及SMD的保留時間分別在7.6 min及8.2 min左右。

由于磺胺類藥物具有性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便、抗菌譜廣，國內(nèi)能大量生產(chǎn)等優(yōu)點，特別是磺胺藥與甲氧芐啶和二甲氧芐啶等抗菌增效劑的聯(lián)合使用后，抗菌活性大大增強，可以從抑菌作用變?yōu)闅⒕饔肹11]。因此，磺胺類藥物目前仍然是養(yǎng)殖場經(jīng)常使用的抗菌藥物之一。然而藥物的使用不當造成其在動物組織中富集，可直接或間接地通過環(huán)境和食物鏈的作用對人體產(chǎn)生一定的毒副作用，引起細菌耐藥性的增加[12]。當藥物在人體內(nèi)蓄積超過一定濃度時，將對人體機能產(chǎn)生損害，磺胺類藥物的副反應(yīng)有過敏反應(yīng)、尿結(jié)晶和造血紊亂等。因此，磺胺類藥物的殘留及其帶來的食品安全問題已引起人們的廣泛關(guān)注[13]。目前，在國內(nèi)關(guān)于磺胺類多殘留檢測方法的報道有很多，袁中珍等[14]報道了免疫親和柱凈化/高效液相色譜法同時測定動物源性食品中16 種磺胺類藥物殘留，該方法簡便快速、靈敏度高、溶劑用量少且環(huán)保，適用于動物源性食品中磺胺類藥物殘留的測定。劉振偉等[15]研究了固相萃取-高效液相色譜法測定動物組織中甲氧芐氨嘧啶及磺胺類藥物殘留，該方法適用于動物組織中甲氧芐氨嘧啶和5種磺胺藥的同時測定。王靜等[16]報道了ASE-GPC-HPLC法同時測定水產(chǎn)品中13種磺胺類和甲氧芐啶的殘留，該方法運用ASE的提取優(yōu)勢和GPC的凈化效果提高了檢測結(jié)果的回收率和精密度，降低基質(zhì)干擾。在國外有Kishida K等[17]報道雞血漿、組織和雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧噠嗪及其代謝物同時測定的液相色譜法和Berzas Nevado J J等[18]研究液相色譜法同時測定磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶及乙胺嘧啶。但在國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)同時測定雞組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶殘留量的報道，本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)同時測定雞組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶的殘留，通過優(yōu)化質(zhì)譜條件和色譜條件，使這兩種藥能夠很好的分離，有效縮短了分析周期。該方法無需使用SPE小柱，凈化簡單，操作方便，是一種快速、靈敏、實用的方法，適用于雞組織中磺胺類藥物及其抗菌增效劑殘留的同時檢測。該方法的建立為監(jiān)控動物源性食品中磺胺類藥物及其增效劑的殘留提供了技術(shù)支持，并為磺胺類藥物的進一步研究提供幫助。

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收稿日期：2015-04-27

基金項目：農(nóng)業(yè)部獸藥行業(yè)標準制定和修訂項目[農(nóng)財發(fā)(2013)46號-32]

作者簡介：徐維(1990-)，女，江西宜春人，碩士，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號:S859.796

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0057-07

Simultaneous Determination of Sulfametoxydiazine and Diaveridine Residues in Chicken Tissues by High Performance Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectrometry

XU Wei,ZENG Zhen-ling,QUAN Dan,ZHOU Yu-hui,WANG Pei,WANG Jia-peng,HAN Ke-ke,CHEN Hong

(NationalReferenceLaboratoryofVeterinaryResidues,CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

Abstract:A high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was presented for simultaneous determination of sulfametoxydiazine and diaveridine residues in chicken.The samples were extracted with acetonitrile,then part of the extracts were cleaned up by n-hexane，followed by blowing to dryness under nitrogen gas stream,reconstitution with mobile phase before the analysis on HPLC-MS/MS using external standard method.The separation of analytes was performed on C18 analytical chromatographic column with a gradient elution using acetonitrile (A) and 1 mL/L formic acid (B) solution as mobile phase.The analysis of sulfametoxydiazine and diaveridine was performed under selective reaction monitoring(SRM) mode by selecting one parent ion and two daughter ions as qualitative ions,and the most abundant daughter ion as a quantitative ion.The calibration curves of SMD and DVD were linear in the concentration range of 1 ng/mL-200 ng/mL and 0.5 ng/mL-100 ng/mL respectively,with correlation coefficients more than 0.992.The quantitative limits of the method for SMD and DVD were 10 μg/kg and 5 μg/kg respectively for all matrices,and the recoveries were in the range of 71.7%-115.0% with RSDs of 1.8%-13.2% while blank samples were spiked with sulfametoxydiazine and diaveridine at 50，100，200 μg/kg and 25，50，100 μg/kg,respectively.This analytical method meets the requirements for assays.

Key words:HPLC-MS/MS; sulfametoxydiazine; diaveridine; residue；chicken tissue