犬IFN-γ的原核表達(dá)及其對(duì)A型流感病毒H3N2亞型的抑制作用

秦海斌，朱海娟，朱　騫，宋珍華，溫　海，賀星亮，高一龍

(公安部南京警犬研究所警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210012)

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研究論文

犬IFN-γ的原核表達(dá)及其對(duì)A型流感病毒H3N2亞型的抑制作用

秦海斌，朱海娟，朱騫*，宋珍華，溫海，賀星亮，高一龍

(公安部南京警犬研究所警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210012)

摘要：為研究犬的γ干擾素(IFN-γ)對(duì)犬流感病毒H3N2亞型的抑制作用，由經(jīng)ConA誘導(dǎo)過(guò)的健康犬淋巴細(xì)胞中特異性地?cái)U(kuò)增犬IFN-γ(cIFN-γ)基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-cIFN-γ，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以MDCK-VSV法對(duì)純化后產(chǎn)物進(jìn)行抗病毒活性鑒定，并在MDCK細(xì)胞上測(cè)定對(duì)H3N2亞型犬流感病毒的抑制作用。結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性、純化后，所制備犬IFN-γ的抗病毒活性為1.1×105 U/mg，重組犬IFN-γ稀釋26倍后對(duì)犬流感病毒的增殖仍具有明顯抑制作用。本研究成功表達(dá)了具備抗H3N2亞型流感病毒活性的犬IFN-γ，為犬流感病毒新型藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：犬；γ干擾素；原核表達(dá)；流感病毒

犬流感(Canine influenza，CI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬犬流感病毒(CIV)引起的一種犬屬動(dòng)物接觸性呼吸道傳染病，患犬臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高、流鼻液、咳嗽、食欲減退、呼吸困難等[1]。研究證實(shí)，多種來(lái)源的流感病毒均可以自然感染犬類(lèi)，包括禽源H3N2亞型、H5N1亞型、H5N2亞型、H9N2亞型、禽源 H3N2重組的H3N1亞型毒株、馬源H3N8亞型病毒及H3N2亞型人流感病毒等[2]。雖然只有禽源 H3N2亞型和馬源 H3N8 亞型流感病毒能夠在犬中水平傳播并形成較穩(wěn)定遺傳譜系，但是由于A(yíng)型流感病毒具備較強(qiáng)的重組變異和跨物種傳播能力[3]，犬流感病毒潛在的公共衛(wèi)生問(wèn)題備受關(guān)注。目前犬流感防控中仍無(wú)商業(yè)化的疫苗可用[4]，也無(wú)有效的治療藥物，新型藥物的開(kāi)發(fā)對(duì)犬流感的防控具有重要意義[5]。

干擾素(interferon,IFN)是機(jī)體受病毒或其他誘生劑刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等而產(chǎn)生的一種具有高度生物學(xué)功能的糖蛋白，具有高效的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物學(xué)活性。犬的干擾素已經(jīng)在乳酸菌、酵母、家蠶等系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)[6-10]，其中犬IFN-α/β因?yàn)榫邆涓行У目共《净钚栽谛滦涂共《舅幬镏斜粡V泛研究，但是對(duì)IFN-γ的表達(dá)和抗病毒研究相對(duì)較少，IFN-γ對(duì)犬流感病毒的抗病毒作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。另外，研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ除了自身的抗病毒作用之外，其免疫調(diào)節(jié)作用也有助于協(xié)同增加IFN-α/β的抗病毒效果，IFN-α/IFN-γ的聯(lián)合用藥也成為治療犬流感的新思路。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)犬IFN-γ進(jìn)行了重組表達(dá)，并在犬腎細(xì)胞系(MDCK細(xì)胞)中測(cè)定了其對(duì)水皰性口炎病毒(VSV)及犬流感病毒H3N2亞型的抑制作用，旨在探索犬IFN-γ體外抗流感病毒活性，為進(jìn)一步研發(fā)IFN-α/IFN-γ聯(lián)合治療犬流感新型藥物奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞、病毒與試驗(yàn)用動(dòng)物MDCK購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；DH5α、DE3，TaKaRa公司產(chǎn)品； CIV病毒Canine/Nanjing/01/11(H3N2)株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉永杰教授惠贈(zèng)；水皰性口炎病毒(VSV)由本實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)用史賓格犬由公安部南京警犬研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采其外周血并分離淋巴細(xì)胞。

1.1.2主要試劑反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑、rTaq、EcoRⅠ、XhoⅠ、DNA Marker DL 5 000、T4 DNA連接酶、pMD18-T、質(zhì)粒抽提試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；ConA，Sigma公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)基、酵母浸出物、水解酪蛋白，Oxoid公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄的犬IFN-γ基因序列(Sequence ID:EF095772.1)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增IFN-γ的特異性引物，引物兩端分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(斜體部分)，并加上保護(hù)性堿基，用于擴(kuò)增IFN-γ全序列。引物由Invitrogen公司合成。

上游引物：(5′-GGCGGAATTCATGAATTA- TACAAGCTATATC-3′)

下游引物：(5′-AATCTCGAGTTATTTCGA- TGCTCTGCG-3′)

1.2.2犬IFN-γ目的基因克隆自犬外周血淋巴細(xì)胞中提取總RNA。用下游引物(P2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈：RNA模板10 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，DNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL，P1(20 pmol/μL) 1 μL，AMV 1 μL，RNasin 0.5 μL，加至ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：75℃ 5 min，立即冰浴5 min，然后42℃孵育1 h，95℃ 5 min。以合成的第1鏈為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)：cDNA 4 μL，10×PCR buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.8 μL，P1(20 pmol/μL) 0.8 μL，P2(20 pmol/μL) 0.8 μL，TaqDNA 聚合酶0.4 μL，加ddH2O至20 μL，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。經(jīng)優(yōu)化后的PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，59.5℃ 1 min，72℃ 2 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3重組表達(dá)載體pET-c IFN-γ的構(gòu)建經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，與pMD 18-T載體相連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板(含氨芐青霉素100 μg/mL)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，接種含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振搖過(guò)夜，提取質(zhì)粒，酶切及PCR鑒定后，送至公司測(cè)序。取測(cè)序正確的質(zhì)粒，用含酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增目的片段，酶切后與pET-32a載體連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板，37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落提取質(zhì)粒DNA，將PCR擴(kuò)增、酶切鑒定均為陽(yáng)性的克隆命名為pET-c IFN-γ/BL21。

1.2.4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化將pET-cIFN-γ/BL21陽(yáng)性的重組菌接入2管5 mL含有1 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，每管加入50 μL，37℃、180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)2.5 h～3 h，測(cè)OD 600 nm約為0.4～0.6時(shí)取出。取其中一管菌液中加入5 μL 1 mg/L的IPTG；另一管不加IPTG作為對(duì)照組，37℃、180 r/min培養(yǎng)5 h～6 h。對(duì)加入IPTG的菌液進(jìn)行以下操作：分別于3、4、5 h取1 mL樣品液于1.5 mL EP管中，做好標(biāo)記。培養(yǎng)6 h后，將2管菌液各取出1 mL，與之前樣液一同13 000 r/min離心1 min，棄去上清。分別用表達(dá)的全菌、破碎后的上清及沉淀制備樣品，用150 g/L的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)果用凝膠分析軟件Band-scan分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.2.5重組蛋白的包涵體純化、復(fù)性、濃縮及濃度測(cè)定2 L菌液培養(yǎng)2 h～3 h，OD 600 nm為0.4～0.6時(shí)加入1 mg/L IPTG繼續(xù)培養(yǎng)6 h。離心后取菌體沉淀進(jìn)行超聲波破碎(功率為400 W，工作5 s，間隔7 s，工作300次～400次)。包涵體沉淀用含2 mol/L脲的溶解buffer重懸，4℃、12 000 r/min離心15 min，用1.5 mL包涵體溶解buffer(含8 mol/L脲)重懸。30℃恒溫水浴60 min，期間經(jīng)常振蕩。4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，棄去沉淀。上清液用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，過(guò)鎳柱純化包涵體，回收5 mL包涵體洗脫液分裝在多個(gè)1.5 mL EP管中，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)純化蛋白進(jìn)行蛋白定量。純化后蛋白裝入透析袋，依次放入含4 、2、1、0.75 mol/L 0脲的PBS中進(jìn)行脲梯度透析，每個(gè)梯度透析4 h，將透析蛋白經(jīng)PEG-6000濃縮后取出，用0.22 μm濾器過(guò)濾，收集濾液，分裝，置-20℃保存。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳對(duì)純化和濃縮效果進(jìn)行分析。

1.2.6所表達(dá)犬IFN-γ活性效價(jià)測(cè)定采用微量細(xì)胞病變抑制法[11]測(cè)定重組犬IFN-γ的活性。將MDCK細(xì)胞加入96孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至每孔約為5×105，待其生長(zhǎng)至單層后，加入用DMEM(含50 mL/L胎牛血清)10倍倍比稀釋的pET-cIFN-γ，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)，CO2溫箱中培養(yǎng)24 h后，加入100 TCID50的VSV 100 μL，同時(shí)設(shè)細(xì)胞陰性對(duì)照和VSV陽(yáng)性對(duì)照，72 h后觀(guān)察pET-cIFN-γ的抗病毒活性。以抑制半數(shù)細(xì)胞病變(CPE)的最高IFN稀釋度為1個(gè)活性單位，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算抗病毒活性。

1.2.7所表達(dá)犬IFN-γ對(duì)CIV H3N2亞型致MDCK細(xì)胞病變的抑制作用參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，以Reed-Muench法在MDCK細(xì)胞上測(cè)定CIV H3N2亞型TCID50滴度，然后對(duì)IFN-γ進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，確定其對(duì)MDCK細(xì)胞無(wú)毒性作用。在24孔細(xì)胞板上常規(guī)培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，同時(shí)每孔加入100 μL 2倍系列稀釋的cIFN-γ純化物(3個(gè)重復(fù))，37℃培養(yǎng)24 h形成單層MDCK細(xì)胞，然后用100 TCID50的CIV H3N2亞型接毒，72 h后觀(guān)察MDCK細(xì)胞病變抑制結(jié)果。對(duì)照組不加入cIFN-γ，待MDCK細(xì)胞24 h長(zhǎng)成單層，然后用100 個(gè) TCID50H3N2亞型病毒接毒，72 h后觀(guān)察MDCK細(xì)胞病變。

2　結(jié)果

2.1犬IFN-γ基因的PCR擴(kuò)增

取PCR產(chǎn)物5 μL于10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在約500 bp處見(jiàn)到1個(gè)明顯條帶，條帶大小與理論值吻合，即為犬IFN-γ基因(圖1)。1.犬IFN-γ基因PCR產(chǎn)物;2.陰性對(duì)照;M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000

1.Canine IFN-γ gene PCR products;2.Negative control;M.DNA Marker DL 5 000

圖1犬IFN-γ基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.1Electrophoresis of PCR products of canine IFN-γ gene

2.2重組表達(dá)載體pET-IFN-γ的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增的基因大小為515 bp，應(yīng)用DNA Star分析軟件分析表明與GenBank報(bào)道的犬IFN-γ基因序列(EF095772)同源性為100%。酶切結(jié)果可見(jiàn)，pET-32a(+)空載體的大小為5 900 bp，插入的編碼犬IFN-γ的基因大小為515 bp，試驗(yàn)結(jié)果與理論值相符(圖2)，表明重組表達(dá)載體pET-IFN-γ構(gòu)建成功。

2.3融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化

菌液經(jīng)過(guò)超聲波破碎后，取樣液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，上清液幾乎不含有目的蛋白，而存在于包涵體沉淀里(圖3)。取出不同時(shí)段菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析顯示，在加入IPTG后，BL21重組菌可高效表達(dá)所需要的目的蛋白，在未添加IPTG的重組菌中，幾乎不表達(dá)目的蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)6 h時(shí)為蛋白表達(dá)最大量時(shí)間(圖4)。經(jīng)凝膠分析軟件Band-scan分析，誘導(dǎo)6 h后表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白量的43.5%。

1.陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定;2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000

1.Positive plasmid digested byEcoRⅠ andXhoⅠ;2.DNA Marker DL 5 000

圖2重組質(zhì)粒pET-IFN-γ酶切鑒定結(jié)果

Fig.2Identification of recombinant plasmid pET-IFN-γ by restriction endonuclease digestion

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.破碎后上清；2.破碎后沉淀

M.Protein molecular weight Marker；1.Supernatant after cell disruption；2.Precipitate after the cell disruption

圖3蛋白存在部位

Fig.3Position of IFN-γ existed

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)表達(dá)6 h；2.誘導(dǎo)表達(dá)5 h；3.誘導(dǎo)表達(dá)4 h；4.誘導(dǎo)表達(dá)3 h；5.未加入IPTG的重組菌

M.Protein molecular weight Marker；1.Volume of the protein by induced expression 6 h.2.Volume of the protein by induced expression 5 h;3.Volume of the protein by induced expression 4 h;4.Volume of the protein induced expression 3 h;5.Non induced control

圖4蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

Fig.4Induced expression of proteins

2.4重組蛋白的復(fù)性純化及濃度測(cè)定

SDS-PAGE電泳分析顯示，鎳柱分離后在蛋白濾液和包涵體溶解buffer中只有少量目的蛋白，蛋白得到有效的回收；同時(shí)可見(jiàn)鎳柱純化后包涵體純度較高(圖5)。純化后得到的蛋白濃度約為2.13 mg/mL，2 mL菌液得到總蛋白量約為4.26 mg。另外，使用不同濃度脲梯度透析，在進(jìn)行到0.75 mol/L脲濃度透析時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白有析出沉淀，經(jīng)復(fù)性-透析-濃縮后，可見(jiàn)蛋白純度得到進(jìn)一步提升，透析-濃縮后獲得的重組犬IFN-γ蛋白濃度為0.58 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.復(fù)性后蛋白；2.濃縮后蛋白；3.純化后蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.Protein after renaturation;2.Protein after concentration;3.Protein after purification

圖5蛋白復(fù)性及濃縮

Fig.5Renaturation and concentration of the protein

2.5所表達(dá)犬IFN-γ活性效價(jià)的測(cè)定

由圖6結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)良好，病毒對(duì)照組全部病變(皺縮、脫落、形成網(wǎng)狀空斑)，而純化的犬IFN-γ融合蛋白稀釋1 000倍后仍能夠抵抗100 TCID50的 VSV的感染，經(jīng)換算后比活性為1.1×105U/mg。這表明重組犬IFN-γ純化蛋白具有較好的抗病毒活性。

2.6所表達(dá)犬IFN-γ在MDCK細(xì)胞上對(duì)H3N2亞型犬流感病毒的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，與正常的MDCK細(xì)胞相比，純化后的cIFN-γ在高劑量下對(duì)MDCK細(xì)胞無(wú)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞毒性(圖7A和圖7B)。對(duì)照組接種100 個(gè) TCID50的H3N2亞型CIV后細(xì)胞病變明顯，表現(xiàn)為皺縮、脫落、形成空斑等。高劑量組cIFN-γ對(duì)H3N2犬流感病毒具有抑制作用(圖7B)，與H3N2亞型病毒感染后的MDCK細(xì)胞病變相比(圖7D)，高劑量組細(xì)胞無(wú)明顯的H3N2亞型病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變(圖7B)，而低劑量組無(wú)法完全抑制H3N2增殖，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(圖7C)。cIFN-γ在稀釋26之后仍然能夠抑制100 TCID50的H3N2亞型犬流感病毒產(chǎn)生細(xì)胞病變(表1)。

3　討論

IFN是一種多功能的細(xì)胞因子，廣泛應(yīng)用于抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗細(xì)菌和寄生蟲(chóng)的治療[13]，目前全球有 60 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)應(yīng)用人IFN制劑治療約30多種病毒性疾病，犬病臨床上已將重組IFN應(yīng)用于防治狂犬病、犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱等病毒病[14]，但犬IFN-γ的研究并不多見(jiàn)。楊琪等[15]用pRc CMV2表達(dá)載體在鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP20)中對(duì)犬IFN-γ進(jìn)行表達(dá)，3組細(xì)胞系其培養(yǎng)上清均檢測(cè)到抗VSV活性，活性平均達(dá)2 500 U/mL；陳忠廣等[16]探討了不同折疊促進(jìn)劑、加樣方式、溫度、pH在稀釋法復(fù)性條件下對(duì)重組犬γ干擾素體外折疊的復(fù)性影響，在4℃、pH8.0、精氨酸濃度0.5 mol/L，蛋白濃度0.15 mg/L及脈沖加樣操作方式下，復(fù)性后重組犬IFN-γ的活性為1.35×104U/mL，比活性為3.74×106U/mg；張考等[7]構(gòu)建含犬IFN-γ基因的重組腺病毒，能夠介導(dǎo)cIFN-γ 在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)，用含cIFN-γ基因的重組腺病毒處理MDCK細(xì)胞，可明顯地抑制犬細(xì)小病毒在細(xì)胞中的增殖；韓陽(yáng)等[8]應(yīng)用SUMO表達(dá)系統(tǒng)高效穩(wěn)定、可溶地表達(dá)了SUMO-cIFN-γ蛋白，cIFN-γ 對(duì)MDCK具有明顯的抑制作用；王智權(quán)等[9]利用桿狀病毒表達(dá)載體在家蠶5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)高效表達(dá)IFN-γ，Western blot 檢測(cè)感染幼蟲(chóng)的血淋巴中有分子質(zhì)量約19 ku的目的蛋白質(zhì)條帶，用微量細(xì)胞病變抑制法在MDCK/VSV-GFP 系統(tǒng)測(cè)定重組IFN-γ具有抗病毒活性，效價(jià)高于5×106U/mL；姜艷平等[10]依據(jù)乳酸菌密碼子的偏好性和原核表達(dá)載體pAMJ399的特點(diǎn)，將原有的IFN-γ序列重新優(yōu)化，構(gòu)建了能分泌表達(dá)IFN-γ的重組乳酸乳球菌，培養(yǎng)上清液能抑制VSV 的復(fù)制，具有明顯的抗病毒活性。

A.正常MDCK細(xì)胞；B：10-3倍稀釋的犬IFN-γ處理MDCK后感染VSV；C.10-4倍稀釋的犬IFN-γ處理MDCK后感染VSV；D.未經(jīng)犬IFN-γ處理的MDCK感染VSVA.Normal MDCK cells;B.Cell morphology of MDCK infected with VSV after incubated with 10-3-fold Ca IFN-γ;C.Cell morphology of MDCK infected with VSV after incubated with 10-4-fold Ca IFN-γ;D.Cell morphology of MDCK infected with VSV without incubating with Ca IFN-γ

圖6犬IFN-γ在MDCK細(xì)胞上的抗VSV活性測(cè)定

Fig.6Antivirus activity to VSV in MDCK cells induced by canine IFN-γ

A.正常的MDCK細(xì)胞；B.高劑量犬IFN-γ處理MDCK細(xì)胞后感染H3N2亞型病毒；C.低劑量犬IFN-γ處理MDCK細(xì)胞后感染H3N2亞型病毒；D.MDCK細(xì)胞感染H3N2 3 d后細(xì)胞病變A.Normal MDCK cells;B.Cell morphology of MDCK infected with H3N2 after incubated with high-does Ca IFN-γ;C.Cell morphology of MDCK infected with H3N2 after incubated with low-does Ca IFN-γ;D.Cell morphology of MDCK infected with H3N2 without incubating with Ca IFN-γ

圖7　犬IFN-γ在MDCK細(xì)胞上對(duì)CIV H3N2亞型致病變的抑制作用

注：“-”CPE50陰性，“+”CPE50陽(yáng)性。

Note:"-"CPE50negative，"+"CPE50positive.

以上研究可見(jiàn)，在不同表達(dá)系統(tǒng)中獲得的基因工程IFN-γ均具備一定的生物活性，且真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白活性明顯優(yōu)于原核系統(tǒng)，但原核表達(dá)系統(tǒng)高效穩(wěn)定、成本較低，在犬類(lèi)病毒的治療中更具優(yōu)勢(shì)。因此，本研究中選擇能夠高效表達(dá)蛋白且易于純化的pET-32a原核表達(dá)載體，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的條件使蛋白在包涵體中獲得了高效表達(dá)，表達(dá)的包涵體蛋白占菌體總蛋白的43.5%，通過(guò)鎳柱純化獲得了較高純度的蛋白，并在不同濃度脲梯度中透析，使包涵體蛋白復(fù)性后獲得了良好的生物活性，復(fù)性后蛋白在MDCK細(xì)胞中對(duì)VSV的抗病毒活性為1.1×105U/mg。

另外，針對(duì)我國(guó)犬流感病毒感染日趨增多、臨床治療缺乏有效藥物的狀況，對(duì)原核表達(dá)的犬IFN-γ蛋白的抗流感病毒活性進(jìn)行了鑒定,以CIV H3N2亞型病毒南京分離株為基礎(chǔ)，檢測(cè)了復(fù)性后cIFN-γ在MDCK細(xì)胞中的抗流感病毒增殖作用，結(jié)果顯示原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的cIFN-γ在稀釋28后已不能抑制100 TCID50的H3N2亞型病毒的致病變作用，說(shuō)明原核表達(dá)的cIFN-γ 具備一定抗流感病毒作用，但活性不高，究其原因一方面是IFN-γ在機(jī)體內(nèi)主要承擔(dān)免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能，抗病毒效果低于IFN-α/β，另一方面可能與原核系統(tǒng)缺乏蛋白修飾加工系統(tǒng)，影響了蛋白的生物活性有關(guān)。但對(duì)流感病毒的治療而言，這并不意味著原核表達(dá)的IFN-γ缺乏治療效果，因?yàn)榛蚬こ谈蓴_素自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其大量反復(fù)使用后極易產(chǎn)生抗干擾素抗體，因此單一種類(lèi)的干擾素治療效果并不理想，要提高干擾素治療效果，除了通過(guò)提高干擾素活性來(lái)降低臨床劑量之外，某些研究證實(shí)利用Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的協(xié)同增強(qiáng)作用[17-19]可以極大提高抗病毒效果，同時(shí)降低干擾素治療劑量。在動(dòng)物病毒方面，Yao等報(bào)道豬 IFN-α/β和IFN-γ在體外對(duì)偽狂犬病病毒具有協(xié)同抑制作用，Ⅰ型和Ⅱ型干擾素聯(lián)合使用能夠增強(qiáng)對(duì)口蹄疫病毒的抑制活性，雞的IFN-α和IFN-γ也具有協(xié)同增強(qiáng)抑制病毒活性。但總體來(lái)看，目前IFN-γ體內(nèi)抗病毒活性和IFN-α/IFN-γ聯(lián)合用藥研究并不完善，相關(guān)研究有待深入進(jìn)行。

綜上所述，本研究基于原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了能夠穩(wěn)定制備具有抗病毒活性的犬IFN-γ的方法，蛋白經(jīng)變性、純化/復(fù)性后對(duì)VSV具有較好的抗病毒活性，能夠在MDCK細(xì)胞中對(duì)CIV H3N2亞型表現(xiàn)出抑制作用，為進(jìn)一步研究CIV新型藥物奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]Li Shou-jun,Shi Zhi-hai,Jiao Pei-rong,et al.Avian-origin H3N2 canine influenza A viruses in Southern China [J].Infect Genet Evol,2010,10(8):1286-1288.

[2]陳櫻,莫彥寧,周華波,等.類(lèi)人H3N2犬流感病毒廣西分離株的鑒定及其遺傳演化分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,37(5):401-404.

[3]于志君,朱曉文,劉紅,等.A型流感病毒跨種傳播和致病性相關(guān)蛋白研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(11):90-94.

[4]周潔文,滕巧泱,閆麗萍,等.高增殖性能犬流感CIV-PR8 重組病毒的制備[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,34(7):518-522.

[5]葉存棟,胡靜思,賈坤,等.從噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)中篩選抗H3N2亞型犬流感病毒多肽的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,36(5) :12-17.

[6]王艷,王海震,曹瑞兵,等.犬α干擾素基因的高效表達(dá)及其活性測(cè)定[J].中國(guó)病毒學(xué),2005,20(2):189-192.

[7]張考,靳慧君,仲飛,等.腺病毒介導(dǎo)犬干擾素-γ基因的表達(dá)及其體外抗犬細(xì)小病毒的作用[J].微生物學(xué)報(bào),2012,52(11):1400-1407.

[8]韓陽(yáng),郝志超,王琪,等.犬干擾素-γ的可溶表達(dá)及其產(chǎn)物的活性鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,35(3):237-241.

[9]王智權(quán),李軼女,張志芳,等.用桿狀病毒表達(dá)載體在家蠶中表達(dá)犬γ干擾素及產(chǎn)物的抗病毒活性[J].蠶業(yè)科學(xué),2014,40(3):0488-0492.

[10]姜艷平,吳煜,張希,等.重組犬γ干擾素的分泌表達(dá)及抗病毒活性鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2015,51(6):30-33.

[11]李皓洋,胡小元,易詠竹,等.犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其抗病毒活性的測(cè)定[J].生物技術(shù)通報(bào),2015,31(6):216-220.

[12]王彥彬,黃艷群,崔保安,等.豬α干擾素在桿狀病毒中表達(dá)及其對(duì)PRRSV的抑制作用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,29(12):1522-1526.

[13]山麗杰,田洪濤,賈英民,等.濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑制備中幾個(gè)技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題的探討[J].中國(guó)乳品工業(yè),2002,30(5):66-69.

[14]Budin-Verneuil A,Vianney P,Yanick A,et al.Proteomic characterization of the acid tolerance response inLactococcuslactisMG1363[J].Proteomics,2005,5(18):4794-4807.

[15]楊琪,夏春,趙德明,等.犬干擾素-γ cDNA的克隆及其在鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)中表達(dá)[J].生物工程學(xué)報(bào),2002,18(3):365-367.

[16]陳忠廣,張桂紅,夏春麗,等.犬干擾素-γ的稀釋復(fù)性及活力測(cè)定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,39(9):82-86.

[17]Scagnolari C,Trombetti S,Alberelli A,et al.The synergistic interaction of interferon types Ⅰ and Ⅱ leads to marked reduction in severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus replication and increase in the expression of mRNAs for interferon-induced proteins[J].Intervirology,2007,50(2):156-160.

[18]Mossel E C,Jr Sainz B,Garry R F,et al.Synergistic inhibition of SARS-coronavirus replication by type Ⅰ and type Ⅱ IFN [J].Adv Exp Med Biol,2006,581:503-506.

[19]Yao Qing-xia,Qian Ping,Cao Yi,et al.Synergistic inhibition of pseudorabies virus replication by porcine alpha/beta interferon and gamma interferoninvitro[J].European Cytokine Network,2007,18(2):71-77.

收稿日期：2016-03-14

基金項(xiàng)目：公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2015GABJC32);公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011ZDYJNJGQ011)

作者簡(jiǎn)介：秦海斌(1983-)，男，山東濰坊人，碩士，主要從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類(lèi)號(hào):S852.21;S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0001-06

Prokaryotic Expression of Canine IFN-γ and Analysis of Its Antiviral Activities to Canine Influenza Virus A H3N2

QIN Hai-bin,ZHU Hai-juan,ZHU Qian,SONG Zhen-hua,WEN Hai,HE Xing-liang,GAO Yi-long

(NanjingPolicedogResearchInstituteofMPS,PolicedogTechnologyKeyLaboratoryofMPS,Nanjing,Jiangsu,210012,China)

Abstract:To prepare recombinant canine interferon gamma(IFN-γ) and study its antiviral effect to canine inflenza H3N2 ,the mature IFN-γ gene was amplied from template NDA extracted from healthy canine's serum lymphocytes which were induced by ConA. IFN-γ gene was insert into pET-32a to construct pET-c IFN-γ expression vector. pET-c IFN-γ was tansformed into E.coli BL21,in which fused protein can be expressed by IPTG inducing. The expression product was purefied and the antiviral activity to H3N2 was tested with MDCK-VSV method.Results showed that the fusion protein size was 34 ku and existed in form of inclusion bodies.After refolding and purification ,the recombinant protein still had high antiviral activity about 1.1×105 U/mg to VSV in MDCK. The dilution of 26 of IFN-γ could protect MDCK from the cytopathic effect caused by 100 TCID50of canine H3N2 virus.The results proved we successfully expressed the canine IFN-γ in prokaryotic system and laid a good foundation for the development of new drugs anti-canine influenza virus.

Key words:canine;interferon-γ;prokaryotic expression;Influenza virus