彌漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因檢測(cè)

翟玉娟王建波肖華靜趙 麗邱 瑩

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·論著·

彌漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因檢測(cè)

翟玉娟1王建波2肖華靜1趙 麗1邱 瑩1

目的： 檢測(cè)彌漫性掌跖角化病一家系中的KRT9基因突變情況。方法： 提取該家系中3例患者和3名家系正常成員及100名健康對(duì)照的外周血DNA，采取PCR擴(kuò)增KRT9基因序列，ABI PRISM-3700測(cè)序儀檢測(cè)KRT9基因突變情況。結(jié)果： 該家系中3例患者存在KRT9基因上第487位C＞T突變，而該家系的正常成員及健康對(duì)照未檢測(cè)到突變。結(jié)論： KRT9基因突變C487T可能與本家系彌漫性掌跖角化病發(fā)病有關(guān)。

彌漫性掌跖角化??； 白癜風(fēng)； 甲亢； 角蛋白9基因

彌漫性掌跖角化病是一種以手掌和足跖表皮角化過(guò)度為特征的難治性皮膚病，是掌跖角化?。╬almoplantar keratoderm，PPK）中最常見的類型，為常染色體顯性遺傳。其又分為彌漫性表皮松解型掌跖角化?。╠iffuse epidermolytic PPK，DEPPK）和彌漫性非表皮松解型掌跖角化?。╠iffuse non-epidemaolytic PPK，DNEPPK），前者較為常見。DEPPK主要表現(xiàn)為手掌和足跖彌漫性角層增厚，病變部位周邊有明顯的紅斑邊緣，部分病例可伴有指關(guān)節(jié)墊［1，2］。

隨著遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，針對(duì)DEPPK致病基因的研究已取得很大進(jìn)展。1992年，Reis等采用遺傳連鎖分析方法首次將德國(guó)一DEPPK家系的突變基因定位于17q12-q21，而后通過(guò)基因測(cè)序的方法證實(shí)DEPPK的致病基因即為位于該區(qū)域的KRT9基因［3，4］。隨后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展一系列不同DEPPK家系的KRT9基因檢測(cè)工作。迄今，已在不同DEPPK家系的KRT9基因中檢測(cè)到20余種不同的突變（www.Interfile.org），其中R163W最為常見［5］。目前報(bào)道的中國(guó)人DEPPK家系KRT9基因突變有以下幾種：N160S、R162Q、L167S、L159F、497delAinsGGCT、N160H和R163W［6］。

1　先證者資料

患者，男，29歲。掌跖角化過(guò)度29年，面部、四肢白斑4年，發(fā)現(xiàn)甲亢2年?；颊叱錾?個(gè)月掌跖部開始出現(xiàn)彌漫性角化，隨著年齡增加掌跖彌漫性角化過(guò)度明顯加重，局部色澤淡黃，表面光滑，多處皮損脫屑、皸裂。4年前手掌開始出現(xiàn)散在色素脫失斑，隨后半年內(nèi)色素脫失斑先后累及足背、雙下肢和面部。2年前患者因雙下肢乏力查血 FT3：17.79 pmol/L （3.80～6.00 pmol/L），F(xiàn)T4：47.27 pmol/L（7.90～14.40 pmol/L），TSH：0.020 uIU/mL（0.340～5.600 uIU/ mL），被診斷為甲狀腺功能亢進(jìn)癥（hyperthyroidism，簡(jiǎn)稱甲亢）。體格檢查：一般情況好，各系統(tǒng)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常。皮膚科檢查：掌跖可見彌漫性淡黃色角化增厚組織，界清，表面干燥、質(zhì)硬，有少量脫屑和皸裂，角化性皮損邊緣有明顯紅斑（圖1a、b）。面部、雙手、雙下肢徑前和雙足背可見散在色素脫失斑，呈乳白色，大小不一，形狀多樣；雙手掌彌漫性色素脫失，并蔓延至雙手腕部（圖2a、b）。診斷：（1）彌漫性掌跖角化?。唬?）白癜風(fēng)；（3）甲狀腺功能亢進(jìn)癥。

圖1　a：雙手掌彌漫性淡黃色角化增厚組織并色素脫失；b：雙足掌彌漫性淡黃色角化增厚組織 圖2 a：雙手背彌漫性乳白色色素脫失斑；b：雙足背散在乳白色色素脫失斑

2　家系調(diào)查

父母非近親結(jié)婚，家族四代共有彌漫性掌跖角化病13例，男6例，女7例，發(fā)病時(shí)間均為出生后3個(gè)月左右，皮損均表現(xiàn)為掌跖彌漫性角化過(guò)度。目前未發(fā)病者其子代均正常，發(fā)病無(wú)性別差異，無(wú)隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳（圖3）。另外，所有家族成員中除先證者外，無(wú)患白癜風(fēng)或甲亢者。

3　家系角蛋白9基因檢測(cè)

3.1實(shí)驗(yàn)方法 在簽署書面知情同意書后，對(duì)先證者（III 4）和其家系中另外2例患者（III 2、IV 2）和3例未患病成員（II 9、III 5、III 12）進(jìn)行血樣采集，每例抽取外周血3 mL。應(yīng)用QIAamp DNA blood mini kit（德國(guó)Qiagen公司）提取基因組DNA。另外，以同樣的方法提取100例無(wú)親緣關(guān)系的健康對(duì)照個(gè)體基因組DNA作為對(duì)照。通過(guò)美國(guó)國(guó)立圖書館網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查取角蛋白9（keratin 9，KRT9）基因mRNA序列，經(jīng)BLAST比對(duì)得到該基因的基因組序列（http：//www.Genome.UCSC.edu/），應(yīng)用Primer 3.0設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)KRT9基因8個(gè)外顯子進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接在 ABI PRISM-3700測(cè)序儀（Applied Biosystems）上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與人類基因組KRT9序列進(jìn)行比較，同時(shí)使用Phred-Phrap-Consed軟件包Versionl 2.0進(jìn)行分析。

3.2結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，3例患者KRT9基因的第487位堿基胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），使得KRT9基因的第1號(hào)外顯子163位密碼子由CGG突變成TGG，導(dǎo)致正常的精氨酸（Arginine，Arg）由色氨酸（Tryptophan，Trp）替代（圖4）。家系中3名正常人及100名無(wú)親緣關(guān)系的正常人均未見其改變，通過(guò) Polyphen2.0（http：//genetics.bwh.harvard.edu/ pph2/）對(duì)突變蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得分為1.0，可能是致病的突變。

圖3　患者家系圖

圖4　先證者及家系中正常人KRT9基因第1外顯子部分測(cè)序結(jié)果

4　討論

本家系的突變位點(diǎn)即是 DEPPK中最常見的R163W突變，即487 C＞T突變使得KRT9基因的第1外顯子163位密碼子由CGG突變成TGG，導(dǎo)致正常的精氨酸被色氨酸替代。有研究表明，KRT9棒狀功能域的1Aa螺旋區(qū)的前15個(gè)氨基和2Ba螺旋區(qū)末端的10～11個(gè)氨基酸對(duì)角蛋白中間絲的聚集和穩(wěn)定至關(guān)重要［1］。163位是棒狀功能域1Aa螺旋區(qū)的第12位氨基酸，因此R163W突變將影響角蛋白中間絲的聚集，破壞中間絲網(wǎng)狀系統(tǒng)的形成，從而導(dǎo)致該病的發(fā)生。另外，有研究發(fā)現(xiàn)角蛋白1（Keratin l，KRT1）基因突變也可以引起DEPPK，目前證實(shí)的KRT1基因突變有4種：I497T、L437P、S223L和F231L［7-9］。

先證者從臨床特征看為DEPPK，而且本家系的突變位點(diǎn)也是DEPPK中最常見的R163W突變（新版本的角蛋白9序列發(fā)表于 2005年4月23日［gi：55956898］，突變R162W更換為R163W）。但先證者同時(shí)伴發(fā)白癜風(fēng)和甲亢實(shí)屬罕見。通過(guò)文獻(xiàn)檢索后確定，目前為止本病例三病共發(fā)于一個(gè)體現(xiàn)象應(yīng)為首次報(bào)道。2004年馮蘭珍等［10］曾報(bào)道殘毀性掌跖角化病伴白癜風(fēng)一例，其白癜風(fēng)皮損在患者腹部，不與掌跖角化皮損重合，此與本病例不同。掌跖角化病患者皮損過(guò)度角化，出現(xiàn)嚴(yán)重脫屑或皸裂，皮損中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多時(shí)有可能損傷到黑素細(xì)胞，導(dǎo)致黑素細(xì)胞密度降低或脫失，從而導(dǎo)致繼發(fā)性白癜風(fēng)。但臨床上掌跖角化病合并白癜風(fēng)的患者確為少數(shù)，兩者并發(fā)也很可能是隨機(jī)事件。然而，白癜風(fēng)合并甲亢已多有報(bào)道。目前研究認(rèn)為，白癜風(fēng)和甲亢均為與遺傳相關(guān)的自身免疫性疾病，并有學(xué)者通過(guò)調(diào)查認(rèn)為白癜風(fēng)和甲亢患者中兩者并發(fā)率高達(dá)25%［11］；在國(guó)內(nèi)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)兩者并發(fā)率為8.2%［12］。最新研究證實(shí)，白癜風(fēng)和自身免疫性甲狀腺病存在相關(guān)致病基因，即NLRP1基因［13］。故有學(xué)者提出對(duì)白癜風(fēng)患者應(yīng)該常規(guī)篩查甲狀腺疾?。?4］。

總之，先證者為三病并發(fā)的特殊病例，KRT9基因R163W突變是此DEPPK家系的明確致病因素，先證者DEPPK與白癜風(fēng)發(fā)病可能存在繼發(fā)或加重影響因素，與甲亢則可能為相互獨(dú)立事件，而白癜風(fēng)與甲亢相互伴發(fā)的現(xiàn)象提示臨床工作中應(yīng)重視和建立兩病相互伴發(fā)的篩查意識(shí)。

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（收稿：2016-02-01 修回：2016-02-16）

Mutations of keratin 9 gene in one family with diffuse plamoplantar keratoderma

ZHAI Yujuan1，WANG Jianbo2，XIAO HuaJing1，ZHAO Li1，QIU Ying1.
1.Department of Dermatology，Jining No.1 People's Hospital，Jining 272000，Shandong，China；2.Department of Dermatology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，China
Correspondence author：QIU Ying，E-mail：qiuyingjn@163.com

Objective：To identify mutations of keratin 9 gene（KRT9）in a family with diffuse plamoplantar keratoderma（DPPK）.Methods：DNA was extracted from the peripheral blood of the patients in a family （3 patients and 3 normal members）and 100 healthy controls.All the exons of KRT9 were amplified by PCR and direct DNA sequencing was performed by ABI PRISM-3700 sequenator.Results：A missense mutation （487C＞T）in the KRT9 gene was identified in the three patients and none of mutation was found in 3 normal family members and healthy controls.Conclusion：The mutation of C487T in KRT9 gene is associated with the onset of diffuse palmoplantar keratoderma in the family.

diffuse plamoplantar keratoderma；vitiligo；hyperthyroidism；KRT9 gene

邱瑩，E-mail：qiuyingjn@163.com

1濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧，272000

2河南省人民醫(yī)院皮膚科，河南鄭州，450003