鎂離子對(duì)大鼠雪旺細(xì)胞增殖及NGF分泌的影響

李　明，宋永周，王　斌，童九輝，袁　鶴，馬　維

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

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·論著·

鎂離子對(duì)大鼠雪旺細(xì)胞增殖及NGF分泌的影響

李明，宋永周，王斌，童九輝，袁鶴，馬維*

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的觀察鎂離子對(duì)體外培養(yǎng)大鼠雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)增殖及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)分泌的影響。方法選取出生3～5 d SD大鼠，分離雙側(cè)坐骨神經(jīng)行SCs體外培養(yǎng)，用S-100免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞純度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SCs分別加入含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別于第2、4、6、8天，MTT法檢測(cè)SCs增殖情況，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌NGF水平。結(jié)果經(jīng)雙30 min差速貼壁法，可以去除大部分成纖維細(xì)胞。原代培養(yǎng)的SCs，接種24 h后即可貼壁生長(zhǎng)。在培養(yǎng)的第72 h細(xì)胞胞體出現(xiàn)并肩平行排列的趨勢(shì)，第7天可見(jiàn)細(xì)胞聚合。經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)計(jì)數(shù)，培養(yǎng)6 d后的SCs，其純度達(dá)到91%。各組SCs增殖活力均呈上升趨勢(shì)(A組上升幅度最大，C組上升幅度最小)，各組分泌的NGF水平至第6天達(dá)峰值后均下降(A組上升幅度最大，C組上升幅度最小)，4組組間、不同時(shí)點(diǎn)間、組間·不同時(shí)點(diǎn)間交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論適宜濃度的MgCl2對(duì)體外培養(yǎng)大鼠SCs的增殖和分泌功能有促進(jìn)作用。

[關(guān)鍵詞]鎂；雪旺細(xì)胞；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.001

雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)是構(gòu)成周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中特有的膠質(zhì)細(xì)胞。不僅參與髓鞘的形成，還在周?chē)窠?jīng)損傷后，通過(guò)自身快速增殖、分裂以及分泌各種蛋白分子維護(hù)軸突的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)的自我修復(fù)及再生。鎂離子是細(xì)胞正常代謝所必需的離子之一，在細(xì)胞中含量豐富，在體內(nèi)參與幾百種酶反應(yīng)。在局部微環(huán)境中，鎂離子作為細(xì)胞第二信使具有調(diào)節(jié)線粒體鈣緩沖能力，同時(shí)具有抗凋亡、抗氧化及抗炎作用，對(duì)于神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，也具有重要意義[1]。目前，對(duì)鎂的研究多集中于對(duì)呼吸系統(tǒng)黏膜[2-3]和對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)，鎂離子對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的研究大多集中于顱腦損傷及脊髓損傷[4-8]，而在外周神經(jīng)損傷的研究較少。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠SCs，觀察鎂離子對(duì)SCs的增殖及分泌功能的影響，旨在為構(gòu)建適宜SCs培養(yǎng)的微環(huán)境提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用出生3～5 d無(wú)特定病原體級(jí)SD大鼠20只，雌雄不限，體質(zhì)量25～30 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，經(jīng)我院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2試劑DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS，Sigma公司)，膠原酶(Gibco公司)，S-100多克隆抗體(Boster公司)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(Boster公司)，免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(Boster公司)，噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl- tetrazolium bromide,MTT,Sigma公司)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，美國(guó)R&D公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，氯化鎂(Sigma-Aldrich公司)。

1.3SCs培養(yǎng)、純化取出生3～5 d乳鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，剝離神經(jīng)外膜后剪成小碎塊，加入0．25%胰蛋白酶及1%膠原酶各1 mL，充分晃動(dòng)，待消化液變渾濁后置于37 ℃空氣搖床中振蕩消化，在顯微鏡下觀察到大部分組織塊被消化成單細(xì)胞后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，過(guò)濾消化液，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入適量DMEM培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，將其放入預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，將消化液移至另1個(gè)培養(yǎng)瓶中，以雙30 min 差速貼壁法貼走部分纖維母細(xì)胞。24 h后，加入終濃度為10-5mmol/L的阿糖胞苷，對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行抑制，24 h后吸除含有阿糖胞苷的培養(yǎng)液，以后每隔2～3 d更換1次培養(yǎng)液，每日在倒置相差顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞融合約80%時(shí)進(jìn)行傳代。取第2代細(xì)胞爬片，行S-100免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。

1.4SCs鑒定取第2代細(xì)胞接種到預(yù)置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)，取出蓋玻片，0.1 mol/L PBS沖洗，冷丙酮固定20 min，0.1%Triton-X100 浸泡8 min，加入5%BAS 封閉液，室溫下孵育25 min，滴加S-100 一抗(1∶100比例稀釋)，在37 ℃濕盒中孵育1 h，再滴加辣根酶標(biāo)記二抗(1∶100比例稀釋)，37 ℃濕盒中孵育30 min，再次0.1 mol/L PBS 液充分沖洗， DAB 顯色，自來(lái)水沖洗10 min，常規(guī)脫水，透明，封片，鏡檢。

1.5MTT比色檢測(cè)SCs活性實(shí)驗(yàn)分為4組，即正常培養(yǎng)組和A、B、C組，培養(yǎng)基分別為含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代SCs懸液，以1×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基用含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)含10%FBS的DMEM維持液置換原培養(yǎng)基。每組各6個(gè)復(fù)孔，于第2、4、6、8天取出待測(cè)樣品，每孔加入MTT(5 g/L) 20 μL，避光孵育4 h，收獲細(xì)胞棄除培養(yǎng)液，并加入150 μL DMSO終止溶液，振蕩10 min以充分溶解結(jié)晶，置于酶標(biāo)儀上，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔光吸收值。

1.6ELISA檢測(cè)SCs分泌NGF水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代SCs，以1×105/mL密度接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，共4組，每組6孔。于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用含不同濃度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)的含10%FBS的DMEM維持液置換原培養(yǎng)基。培養(yǎng)第2、4、6、8天取各組上清液離心，將上清液移入無(wú)菌EP管中，再次離心，將上清液分別移入另1個(gè)EP管中，-20 ℃冷藏待測(cè)。待全部樣品收集后，按照試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定培養(yǎng)液上清標(biāo)本，以及NGF標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，根據(jù)樣品OD值在NGF含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)NGF含量。

2　結(jié)　　果

2.1SCs培養(yǎng)經(jīng)雙30 min差速貼壁法，可以去除大部分成纖維細(xì)胞。原代培養(yǎng)的SCs，一般在接種24 h后即可貼壁生長(zhǎng)，胞核呈長(zhǎng)形或卵圓形，胞體的立體感強(qiáng)，形態(tài)飽滿呈梭狀，周邊有明顯的光暈，兩端有細(xì)長(zhǎng)的突起，通常呈雙級(jí)狀。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，從胞體伸出的突起逐漸增長(zhǎng)。在培養(yǎng)的第72 h，即可觀察到細(xì)胞胞體出現(xiàn)并肩平行排列的趨勢(shì)，第7天在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞聚合，呈“端對(duì)端，肩并肩”等旋渦排列或網(wǎng)狀排列，逐漸形成片狀，形如地毯(圖1)。

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果SCs對(duì)抗S-100蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，胞體呈細(xì)小梭形，邊界清晰，兩端有數(shù)量不等的突起，排列成柵欄狀或網(wǎng)狀。胞核比胞漿著色淺，胞漿著色為棕色。對(duì)胞漿為棕色的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，培養(yǎng)6 d后的SCs，其純度達(dá)到91%(圖2)。

2.3不同濃度MgCl2對(duì)SCs增殖的影響在培養(yǎng)后的第2、4、6、8天不同時(shí)間點(diǎn)，正常培養(yǎng)組和C組OD值呈先升高再降低趨勢(shì)，第6天達(dá)高峰，第8天有所回落；A、B組OD值呈升高趨勢(shì)；A組上升幅度最大，C組上升幅度最小；4組組間、不同時(shí)點(diǎn)間、組間·不同時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1原代培養(yǎng)第7天的細(xì)胞形態(tài)(×200)

Figure 1The cell morphology on the seventh day of primary culture(×200)

圖2雪旺細(xì)胞S-100免疫細(xì)胞化學(xué)觀察(免疫組織化學(xué) ×200)

Figure 2S-100 immunocytochemical image of schwann cells(Immunohistochemistry ×200)

表1　不同濃度MgCl2對(duì)SCs增殖活力比較Table 1　Comparison of the proliferation activity of SCs in different concentrations of MgCl2　值)

2.4不同濃度MgCl2對(duì)SCs分泌NGF水平的影響4組在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)NGF分泌數(shù)值呈先升高再降低趨勢(shì)，第6天達(dá)到峰值，第8天有所下降；A組上升幅度最大，C組上升幅度最小；4組組間、不同時(shí)點(diǎn)間、組間·不同時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2各組SCs分泌NGF含量比較

組別 培養(yǎng)時(shí)間第2天第4天第6天第8天正常培養(yǎng)組 45.356±3.12172.464±6.90375.260±5.14471.672±2.882A組 43.534±6.05474.094±5.24790.085±2.43584.744±7.515B組 42.778±1.15074.490±2.64676.944±3.58274.060±6.583C組 40.194±1.35250.351±2.77265.533±8.34759.192±4.424組間 F=272.141 P=0.000不同時(shí)點(diǎn)間 F=739.632 P=0.000組間·不同時(shí)點(diǎn)間 F=24.197 P=0.000

3　討　　論

SCs是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中重要的膠質(zhì)細(xì)胞，不僅參與髓鞘的形成，而且對(duì)于神經(jīng)的修復(fù)和軸突再生均具有重要作用。在周?chē)窠?jīng)損傷后的再生修復(fù)過(guò)程中，SCs通過(guò)吞噬軸突碎片，支持引導(dǎo)再生纖維生長(zhǎng)，分泌多種NGF，促進(jìn)軸突向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞黏附分子，防止受損神經(jīng)元胞體的死亡[9]。在本研究中，通過(guò)酶消化法和差速貼壁法進(jìn)行純化，再利用阿糖胞苷清除殘留的成纖維細(xì)胞，因此獲得了較高純度的SCs。在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中，只有成熟的SCs可以強(qiáng)烈表達(dá)S-100 蛋白，所以用S-100 抗體鑒定SCs是非?？煽康腫10]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法，觀察到培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿著色為棕色。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，培養(yǎng)6 d后的SCs，其純度達(dá)到了91%，證明通過(guò)酶消化法和差速貼壁法體外培養(yǎng)SCs是成功的。

鎂在細(xì)胞中含量豐富，是人體內(nèi)必不可少的微量元素之一。鎂在體內(nèi)參與幾百種酶反應(yīng)，對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞呼吸、蛋白質(zhì)合成、糖和能量代謝、Na+-K+正常交換等均具有重要作用。一般認(rèn)為，鎂離子可通過(guò)對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用、N-甲基-D-天冬氨酸受體的拮抗作用、鈣離子拮抗作用等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]。李伯翰等[1]用鎂金屬纖維絲與SCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)鎂離子在微環(huán)境下可以促進(jìn)細(xì)胞組織的黏附以及分泌生長(zhǎng)因子NGF作用。適宜濃度的鎂離子對(duì)SCs增殖有促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)于SCs合成和分泌NGF也有促進(jìn)作用。鄢開(kāi)勝等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞預(yù)先給予1 mmol/L MgCl2能增加暴露于谷氨酸的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率，還能通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流降低谷氨酸對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的毒性，對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。飲食中加入適量鎂能降低大鼠對(duì)噪聲暴露后的敏感性。對(duì)噪聲性聽(tīng)力損失有防護(hù)作用[13]。呂一鳴等[14]觀察不同濃度鎂離子對(duì)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞最適鎂離子生存的濃度為70 mmol/L，成骨細(xì)胞為30 mmol/L。

周?chē)窠?jīng)損傷后，SCs分泌大量的內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factor,NTF)，包括NGF、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子3大類。其中NGF對(duì)于周?chē)窠?jīng)的修復(fù)起到了主要的促進(jìn)作用，它可以誘導(dǎo)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)，防止神經(jīng)元變性凋亡，促進(jìn)損傷神經(jīng)再生及修復(fù)[15]。姚健等[16]在進(jìn)行神經(jīng)元體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，若去除NGF培養(yǎng)液，其軸突出現(xiàn)漂浮，神經(jīng)元最后死亡，然而將神經(jīng)元與SCs共同培養(yǎng)時(shí)，即使去除NGF，神經(jīng)元依然良性生長(zhǎng)，SCs也出現(xiàn)明顯增殖，并包裹軸突。另有研究表明對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)切斷處局部給予NGF，能明顯改善神經(jīng)移植術(shù)后的功能恢復(fù)[17]。

研究表明，鎂離子對(duì)體外培養(yǎng)的大腦神經(jīng)元具有保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用并不是濃度依賴性的。鄢開(kāi)勝等[12]發(fā)現(xiàn)，鎂離子濃度過(guò)高，對(duì)體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用反而降低，原因可能是濃度過(guò)高對(duì)鈣離子通道有抑制作用[18]。本研究觀察了含0.5、1、2 mmol/L MgCl2的培養(yǎng)基與正常培養(yǎng)基對(duì)SCs增殖及NGF分泌水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/L MgCl2有促進(jìn)作用，2 mmol/L MgCl2對(duì)SCs增殖及NGF分泌水平有抑制作用。關(guān)于MgCl2對(duì)細(xì)胞保護(hù)及其增殖促進(jìn)作用的適宜濃度，目前尚無(wú)明確的文獻(xiàn)報(bào)道，先前發(fā)表的研究結(jié)果并不一致，可能是所培養(yǎng)的細(xì)胞及培養(yǎng)條件不同所致[19-22]。鎂離子如何促進(jìn)SCs的增殖及分泌，其具體機(jī)制仍需進(jìn)行深入的研究。

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[22]吳卉,唐微,孫設(shè)宗,等.鎂離子、維生素E對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷TNF-α和caspase-3含量的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,44(5):329-332.

(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2016-05-04；[修回日期]2016-05-23

[基金項(xiàng)目]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(ZL20140291)

[作者簡(jiǎn)介]李明(1980-)，男，河北隆堯人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事骨科疾病診治研究。 *通訊作者。E-mail：15803210539@163.com

[中圖分類號(hào)]R329.26

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)07-0745-05

Effect of magnesium on proliferation and NGF secretion in Schwann cells of rat

LI Ming, SONG Yong-zhou, WANG Bin, TONG Jiu-hui, YUAN He, MA Wei*

(Department of Orthopedics, the Second Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of magnesium on proliferation and nerve growth factor(NGF) secretion in Schwann cells(SCs). Methods3～5 days old SD rats were used. The SCs were isolated from sciatic nerves in vitro. The positive cells were counted by using S-100 immunocytochemical staining. SCs were divided into four groups. The culture medium was DMEM containing 10% FBS and different concentrations of MgCl2(0， 0.5， 1， 2 mmol/L). MTT was used to detect the cell proliferation of the Schwann cells at 2, 4, 6, 8 d .The expression of NGF was detected by ELISA. ResultsMost collagenoblast were removed by differential adhesion about 30 minutes. The primary-cultured SCs were adherent to the plastic surface of the cell culture dish and growed 24 h after inoculation. In the 72th hour of cultivation, the cells showed the trend of parallel arrangement. In the 7th day, we could see cell aggregation under a microscope. Through counting by immunohistochemistry test, the purity of SCs reached 91% 6 days after cultivation. The purity of SCs was 91% by S-100 immunocytochemical staining. Compared with normal training group, 0.5 mmol/L MgCl2 group had a promoting effect on SCs proliferation and NGF secretion. There were significant differences in 4 groups, in different time points, and in the interaction of the groups vs time points(P<0.05). ConclusionAppropriate concentration of MgCl2 can stimulate the proliferation and NGF secretion of SCs of rat.

[Key words]magnesium； Schwann cells； nerve growth factor； rats