運(yùn)動(dòng)時(shí)不同吸氧濃度對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的影響①

劉衡，溫寶伶，王曉龍

運(yùn)動(dòng)時(shí)不同吸氧濃度對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的影響①

劉衡1，溫寶伶2，王曉龍2

目的探討運(yùn)動(dòng)時(shí)吸氧濃度差異性對(duì)慢性阻塞性肺疾?。–OPD）活性氧類物質(zhì)（ROS）產(chǎn)生的影響及可能機(jī)制。方法Wistar大鼠80只建立COPD模型，分為低氧（LO，n=20）、常氧（NO，n=20）、吸氧（IO，n=20）運(yùn)動(dòng)組及常氧非運(yùn)動(dòng)對(duì)照（C，n=20）組。前3組每天分別置氧體積濃度13.6%、21%、25%環(huán)境中跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)1 h，C組于氧濃度21%下置靜止跑臺(tái)上1 h。各組運(yùn)動(dòng)后1周（n= 10）、4周（n=10），流式細(xì)胞儀檢測(cè)血中性粒細(xì)胞凋亡率及ROS含量，免疫組化檢測(cè)肺組織還原型谷胱甘肽（GSH）表達(dá)，Western blotting檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅳ（COXⅣ）蛋白表達(dá)。結(jié)果運(yùn)動(dòng)1周時(shí)，LO組、NO組ROS較C組升高（P＜0.05），中性粒細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05），GSH及COXⅣ與C組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。運(yùn)動(dòng)4周時(shí)，LO組ROS含量較C組升高（P＜0.05），NO組和IO組ROS較C組減低（P＜0.05）；NO組和IO組GSH、COXⅣ含量較C組增加（P＜0.05），LO組較C組減少（P＜0.05）。結(jié)論非低氧狀態(tài)COPD患者進(jìn)行長(zhǎng)期康復(fù)運(yùn)動(dòng)，可能通過(guò)促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)抗氧化能力等抑制體內(nèi)ROS產(chǎn)生。

慢性阻塞性肺疾??；運(yùn)動(dòng)；氧濃度；吸氧；活性氧類物質(zhì)；大鼠

［本文著錄格式］劉衡，溫寶伶，王曉龍.運(yùn)動(dòng)時(shí)不同吸氧濃度對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的影響［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:784-788.

CITED AS:Liu H，Wen BL，Wang XL.Effect of oxygen concentration during exercise on reactive oxygen species production in chronic obstructive pulmonary disease rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:784-788.

活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）發(fā)生發(fā)展的重要因素［1-2］，運(yùn)動(dòng)對(duì)COPD患者ROS產(chǎn)生的影響報(bào)道不一。有研究表明，運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)COPD患者血液、肺、骨骼肌等部位ROS產(chǎn)生［3］，而ROS的產(chǎn)生進(jìn)一步加重全身炎癥反應(yīng)及骨骼肌損害［4］；而Garcia-Aymerich等研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運(yùn)動(dòng)可通過(guò)抗氧化應(yīng)激損傷延緩COPD患者肺功能下降［5］。

復(fù)習(xí)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，影響上述結(jié)論的關(guān)鍵因素有兩點(diǎn)：一是運(yùn)動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)短，二是運(yùn)動(dòng)時(shí)患者血氧濃度。運(yùn)動(dòng)對(duì)COPD的康復(fù)意義不言而喻［6］，但如何運(yùn)動(dòng)才合理，值得探討。本研究觀察COPD大鼠模型在運(yùn)動(dòng)時(shí)吸入不同氧濃度，并運(yùn)動(dòng)不同時(shí)間，闡明運(yùn)動(dòng)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)時(shí)吸氧濃度對(duì)COPD患者體內(nèi)ROS生成的影響及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

Wsitar大鼠80只，雌雄不拘，體質(zhì)量（250±30）g：重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。脂多糖：SIGMA公司。ROS檢測(cè)試劑盒：美國(guó)細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)公司（OxiSelectTMROS）。熒光素標(biāo)記的連接素V-碘化丙錠（annexinV-fluoresceinisothiocyanate/propidiumiodide，F(xiàn)ITC-PI）雙染色凋亡試劑盒：BD公司?？惯€原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）多克隆抗體、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅳ（cytochrome C oxidaseⅣ，COXⅣ）單抗：SANTA CRUZ生物公司。SAP免疫組化試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2模型建立

采用氣管滴注脂多糖加香煙薰霧法［7］。實(shí)驗(yàn)第1天和第14天，大鼠氣管內(nèi)滴入1 μg/μl脂多糖200 μl，次日將大鼠放入5%香煙煙霧的有機(jī)玻璃倉(cāng)內(nèi)，每天0.5 h。共30 d。

1.3分組與干預(yù)

按隨機(jī)數(shù)字表法將造模后大鼠分為低氧（low oxygen，LO）、常氧（normal oxygen，NO）、吸氧（inhaled oxygen，IO）三個(gè)運(yùn)動(dòng)組及常氧非運(yùn)動(dòng)對(duì)照（control，C）組，每組20只。所有大鼠非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí)均可自由攝食、飲水。

運(yùn)動(dòng)組根據(jù)Bedford攝氧量回歸方程確定大鼠運(yùn)動(dòng)模式：5°跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度15 m/min（53%VO2max），每天1 h，每周5 d。C組每天置于靜止跑臺(tái)1 h。運(yùn)動(dòng)時(shí)將運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)置于氧濃度可調(diào)節(jié)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)箱（長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司）內(nèi)，C組和NO組氧濃度均為21%，LO組和IO組分別為13.6%和25%。

1.4中性粒細(xì)胞凋亡率及ROS含量檢測(cè)

大鼠于運(yùn)動(dòng)1周或4周后次日，各取10只大鼠，抽股靜脈血行中性粒細(xì)胞分離純化，分離后1 h內(nèi)參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行中性粒細(xì)胞凋亡率及ROS含量檢測(cè)。以Annexin V-FITC陽(yáng)性、PI陰性表示凋亡細(xì)胞。計(jì)算凋亡細(xì)胞占檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分比為凋亡率。

1.5肺組織GSH表達(dá)

預(yù)定時(shí)間點(diǎn)斷頸處死大鼠，予4%多聚甲醛單肺灌注固定后常規(guī)石蠟切片，厚7μm。免疫組化檢測(cè)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以不加一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色。胞質(zhì)染為棕褐色者為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6骨骼肌COXⅣ表達(dá)

處死大鼠后迅速分離股四頭肌，差速離心法提取骨骼肌線粒體［9］。BCA試劑盒行蛋白定量，取蛋白40 μg加入12%SDS-PAGE垂直電泳，半干轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉封閉，加入COXⅣ單克隆抗體（1∶1000），以β-tubulin作為內(nèi)參，4℃過(guò)夜。1∶5000辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗處理后，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。以測(cè)得結(jié)果與內(nèi)參的比值作為最終結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1中性粒細(xì)胞凋亡率及ROS含量

運(yùn)動(dòng)1周，LO組、NO組中性粒細(xì)胞凋亡率較C組降低（P＜0.05），ROS含量增高（P＜0.05）。運(yùn)動(dòng)4周，NO組、IO組中性粒細(xì)胞凋亡率較C組增加（P＜0.05），ROS含量減低（P＜0.05）。與運(yùn)動(dòng)1周相比，運(yùn)動(dòng)4周NO組、IO組中性粒細(xì)胞凋亡顯著上升（P＜0.001），ROS含量減少（P＜0.05）。見(jiàn)表1、表2。

表1　　各組運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間中性粒細(xì)胞凋亡率比較（%）

表2　　各組運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間中性粒細(xì)胞ROS含量比較（103/mg）

2.2GSH表達(dá)

各組肺泡腔均擴(kuò)大，肺泡間隔變窄，符合COPD病理表現(xiàn)。運(yùn)動(dòng)1周，各運(yùn)動(dòng)組肺組織GSH表達(dá)與C組無(wú)顯著性差異；運(yùn)動(dòng)4周后，NO、IO組GSH表達(dá)較C組增加。見(jiàn)圖1。

圖1　肺組織GSH表達(dá)（免疫組化染色，400×）

2.3COXⅣ表達(dá)

運(yùn)動(dòng)1周及4周后，LO組COXⅣ水平均較C組降低；運(yùn)動(dòng)4周后，NO組和IO組較LO組升高，IO組較NO組升高。見(jiàn)圖2。

3討論

COPD患者因肺功能受損，氧儲(chǔ)備能力降低，運(yùn)動(dòng)后因氧化能力不足，導(dǎo)致血液、肺、骨骼肌等ROS含量增加，進(jìn)一步加劇全身炎癥反應(yīng)［10］。既然低氧血癥是導(dǎo)致COPD患者運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生ROS的重要原因，吸氧后運(yùn)動(dòng)可能會(huì)改善。我們建立COPD大鼠模型，通過(guò)控制運(yùn)動(dòng)時(shí)吸入氧濃度來(lái)模擬COPD患者不同的氧合狀態(tài)，以期為COPD運(yùn)動(dòng)康復(fù)提供參考。

中性粒細(xì)胞是COPD重要的炎癥細(xì)胞［11］，其凋亡延遲是COPD炎癥持續(xù)的重要原因［12］。本研究顯示，無(wú)論運(yùn)動(dòng)1周或4周，低氧均會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞凋亡顯著延遲，同時(shí)伴ROS增加。也就是說(shuō)，發(fā)生Ⅰ型呼吸衰竭的COPD患者，無(wú)論運(yùn)動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)短，運(yùn)動(dòng)后均可能通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞凋亡增加ROS生成。氧合正常狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)1周時(shí)，中性粒細(xì)胞凋亡仍然延遲，ROS含量增加；運(yùn)動(dòng)4周后，反而促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡。吸入低濃度氧后，在運(yùn)動(dòng)第1周即表現(xiàn)出促中性粒細(xì)胞凋亡的作用。這與Hanneke等研究結(jié)果［13］一致：鼻導(dǎo)管4 L/min吸氧后可抑制COPD患者運(yùn)動(dòng)后IL-6的產(chǎn)生及中性粒細(xì)胞活化。我們推測(cè)，COPD患者基礎(chǔ)氧合狀態(tài)是運(yùn)動(dòng)后導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的重要因素，運(yùn)動(dòng)時(shí)吸氧可有效降低ROS產(chǎn)生，可能的機(jī)制是促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡。

圖2　骨骼肌COXⅣ表達(dá)

氧化-抗氧化失衡也是COPD進(jìn)行性惡化的重要原因［14-15］，GSH不足與COPD相關(guān)［16］。本研究顯示，NO組運(yùn)動(dòng)1周時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡受到抑制，而運(yùn)動(dòng)4周后中性粒細(xì)胞凋亡率明顯升高，ROS含量減低。其機(jī)制難以單純用運(yùn)動(dòng)時(shí)吸入氧濃度來(lái)解釋。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)4周后，NO組肺組織GSH表達(dá)較1周時(shí)增加。推測(cè)經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，體內(nèi)抗氧化機(jī)制激活，促進(jìn)體內(nèi)GSH等抗氧化物質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，使ROS含量減少。然而，低氧狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)4周后，GSH并未增加；而吸氧運(yùn)動(dòng)4周后，GSH顯著增加。因此，運(yùn)動(dòng)對(duì)COPD患者抗氧化物質(zhì)生成的影響有時(shí)間因素及運(yùn)動(dòng)時(shí)吸入氧濃度雙重因素作用，非低氧血癥患者經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)，可以促進(jìn)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的生成；而低氧狀態(tài)下，即便較長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)也未見(jiàn)GSH增加，氧對(duì)GSH等抗氧化物質(zhì)的合成有“允許”作用。

COPD患者骨骼肌常常因ROS等作用，功能受到影響，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)耐力下降［17］。已有研究表明，COPD患者可能因?yàn)榈脱跹Y及運(yùn)動(dòng)減少而出現(xiàn)骨骼肌線粒體合成障礙［18］；線粒體合成障礙使骨骼肌成為COPD患者運(yùn)動(dòng)后ROS又一重要來(lái)源［19-20］。我們選擇線粒體呼吸鏈標(biāo)志蛋白COXⅣ作為衡量指標(biāo)［21］。研究顯示，低氧是骨骼肌線粒體合成障礙的重要因素，這與文獻(xiàn)［22-23］報(bào)道一致；非低氧狀態(tài)下，COPD大鼠運(yùn)動(dòng)4周后COXⅣ明顯增加。

對(duì)COPD患者進(jìn)行肺康復(fù)教育及訓(xùn)練無(wú)疑非常重要［24-25］。本研究結(jié)果提示，偶爾、短期運(yùn)動(dòng)可能對(duì)改善COPD氧化應(yīng)激狀態(tài)無(wú)益；長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)康復(fù)對(duì)COPD患者ROS生成的影響也需要區(qū)別對(duì)待。非低氧狀態(tài)COPD患者可通過(guò)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)改善體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，而伴低氧者則可能需要運(yùn)動(dòng)時(shí)吸入氧才能獲益。

當(dāng)然，運(yùn)動(dòng)時(shí)吸入何種濃度氧及不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)ROS影響等問(wèn)題則需要進(jìn)一步深入探討。

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Effect of Oxygen Concentration during Exercise on Reactive Oxygen Species Production in Chronic Obstructive Pulmonary Disease Rats

LIU Heng1，WEN Bao-ling2，WANG Xiao-long2
1.Sports Institute of Chongqing Universty，Chongqing 400030，China；2.Emergency Department，the 2nd Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China
Correspondence to WANG Xiao-long.E-mail:xiaolongwang126@126.com

Objective To investigate the effect of various concentration of inhaled oxygen during exercise on reactive oxygen species （ROS）production in chronic obstructive pulmonary disease（COPD）rats and the possible mechanism.Methods Eighty COPD Wistar rats were divided into low oxygen（LO，n=20），normal oxygen（NO，n=20）and inhaled oxygen（IO，n=20）exercising groups，which ran on treadmill in the conditions of 13.6%，21%，25%oxygen，respectively，and non-exercising normal oxygen group（C，n=20），which stood on still treadmill in the condition of 21%oxygen.Their apoptosis percentage of neutrophils and ROS content were measured with flow cytometry，glutathione（GSH）in lung with immunohistochemistry and cytochrome C oxidase IV（COXIV）in skeletal muscle with Western blotting，as one and four weeks of exercising.Results For one week of exercise，the ROS was more in LO and NO groups than in C group（P＜0.05），while the neutrophils apoptosis percentage was less（P＜0.05）；and there was no difference among C，LO，NO，IO groups in expression of GSH and COXIV（P＞0.05）.For four weeks of exercise，the ROS was more in LO group but less in NO and IO groups than in C group（P＜0.05）；while the expression of GSH and COXIV increased in NO and IO groups compared with those in C group（P＜0.05）.Conclusion A long term exercise in non-hypoxic state may inhibit ROS production for COPD patients，by promoting neutrophils apoptosis and antioxidant expression.

chronic obstructive pulmonary disease；exercise；oxygen concentration；inhaled oxygen；reactive oxygen species；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.009

R562.2

A

1006-9771（2016）07-0784-05

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（No.106112015CDJXY250002）。

1.重慶大學(xué)體育學(xué)院，重慶市400030；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院急救部，重慶市400010。作者簡(jiǎn)介：劉衡（1975-），女，漢族，重慶市人，碩士，講師，主要研究方向：運(yùn)動(dòng)與康復(fù)醫(yī)學(xué)。通訊作者：王曉龍（1974-），男，漢族，重慶市人，博士，副教授，主要研究方向：中毒與慢性病康復(fù)。E-mail:xiaolongwang126@126.com。

2015-12-04

2016-01-22）