清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠生化指標(biāo)和肝組織病理學(xué)的影響*

王一強(qiáng)，張玉香，姜德民，史曉偉

(1.甘肅省中醫(yī)學(xué)校，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

?

清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠生化指標(biāo)和肝組織病理學(xué)的影響*

王一強(qiáng)1，張玉香1，姜德民1，史曉偉2

(1.甘肅省中醫(yī)學(xué)校，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

目的：觀察清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠總膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等生化指標(biāo)和肝臟組織病理學(xué)結(jié)果的影響。方法: 通過高脂飲食誘導(dǎo)非酒精性大鼠脂肪肝模型, 隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、多烯磷脂酰膽堿組、清肝祛濕活血方低、中、高劑量組，60 d后開始取材，檢測大鼠CHOL、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C等生化指標(biāo)和肝臟組織病理學(xué)結(jié)果。結(jié)果:與模型對照組對比,清肝祛濕活血方高、中、低劑量組血清CHOL、TG、LDL-C水平和ALT、AST活性均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，HDL-C升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；所有給藥組大鼠肝臟脂肪變性程度均獲改善,其中清肝祛濕活血方高劑量組效果明顯。結(jié)論:清肝祛濕活血方可有效減少非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂肪堆積、調(diào)節(jié)血脂、改善肝功能。

清肝祛濕活血方/藥效學(xué)；非酒精性脂肪肝；動物模型；生化指標(biāo)；肝組織

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種無過量飲酒史的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和儲存為特征的臨床病理綜合征[1],目前已成為主要慢性肝病之一，是肝硬化、肝癌等疾病的誘因，同時與代謝疾病及心腦血管事件關(guān)系密切。目前尚無被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療NAFLD的藥物，所用藥物只是針對其發(fā)病原因和病理機(jī)制進(jìn)行治療。清肝祛濕活血方由夏枯草、密蒙花、青葙子、茵陳、垂盆草、丹參、郁金7味中藥組成。本研究采用高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，觀察清肝祛濕活血方對其總膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等生化指標(biāo)的影響，以及模型大鼠肝臟組織學(xué)改變情況，以探討清肝祛濕活血方治療NAFLD的機(jī)制，為該方臨床治療NAFLD提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物

選取同批雄性SD大鼠90只，清潔級，體質(zhì)量(150±20)g，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號: SYXK(甘)2011-0001。實(shí)驗(yàn)前將動物置于實(shí)驗(yàn)室1周以適應(yīng)環(huán)境，室溫控制在 18～20 ℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，進(jìn)食自由，飲用水為自來水。

1.2藥品、試劑與儀器

清肝祛濕活血方藥物組成：夏枯草10 g，密蒙花10 g，青葙子10 g，茵陳10 g，垂盆草10 g，丹參15 g，郁金10 g。中藥煎劑由甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備。多烯磷脂酰膽堿膠囊，商品名為易善復(fù)，北京安萬特制藥有限公司產(chǎn)品，批號5JD007。 大鼠CHOL(批號402012A)、TG(批號401181A)、HDL-C)(批號402063A)、LDL-C(批號404011C)、ALT(批號402221A)、AST(批號403113B)檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物研究所。TOSHIBATBA-120FR全自動生化分析儀，日本東芝公司產(chǎn)品；OHAUS1/1000型電子天平，美國BECKANCOULTER公司產(chǎn)品；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴箱，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；5417R低溫高速離心機(jī)，德國EPPENDORF公司產(chǎn)品；TC-120智能程控生物組織自動脫水機(jī)，湖北省孝感市泰維電子設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3動物分組與模型的建立

將90只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組，模型對照組，多烯磷脂酰膽堿組，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組6組，每組15只。常規(guī)飼養(yǎng)7 d 后，正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)60 d；其余各組按照聶文山等[2]的造模方法，予高脂飼料(84%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+1%膽固醇)，并于制模后1周腹腔注射四環(huán)素150 μg/g，以后每6天腹腔注射1次四環(huán)素100 μg/g，共計6次，并于實(shí)驗(yàn)前(0 d)和制模后6，12，18，24，30 d測量體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，第30天造模成功(已經(jīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，病理切片顯示此造模方法成功)。

1.4給藥方法

造模結(jié)束后，即實(shí)驗(yàn)第31天開始，治療組給予清肝祛濕活血方進(jìn)行灌胃治療。人與大鼠劑量的換算參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3]，采用中劑量給藥，大鼠用藥量是成人劑量的9倍。換算出大鼠的對應(yīng)給藥量為11.25 g生藥/kg。清肝祛濕活血方低、中、高劑量組依次給予5.63，11.25，22.50 g生藥/kg，多烯磷脂酰膽堿組參照文獻(xiàn)[4]給予550 μg/(g·d)。使用時，按照大鼠灌藥容積20 μL/g計算，用蒸餾水將清肝祛濕活血方煎劑配成小劑量組0.28 g/mL、中劑量組0.56 g/mL、大劑量組1.13g/mL，造模成功后大鼠平均體質(zhì)量按200 g/只計算，干預(yù)組每只大鼠每次灌胃4 mL， 1 d 1次。正常對照組與模型對照組分別給予蒸餾水代替，灌胃量每天4 mL，1 d 1次。各組連續(xù)給藥30 d。實(shí)驗(yàn)過程中觀察比較各組大鼠的一般情況。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1血清生化指標(biāo)

沿大鼠腹中線迅速剪開腹腔，用10 mL注射器無菌采取腹主動脈血8 mL，常規(guī)分離血清，-20 ℃凍存?zhèn)錅y。嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定CHOL、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C活性。

1.5.2肝臟組織學(xué)觀察

各組大鼠15只，留取肝左葉同一部位新鮮肝組織，清洗后置于100 g/L 中性甲醛固定，送病理檢查作組織切片。肝細(xì)胞脂肪變性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]:以肝小葉內(nèi)未見脂滴肝細(xì)胞為陰性，脂滴肝細(xì)胞占肝細(xì)胞總數(shù)<1/3為+1，1/3～2/3為+2，>2/3為+3，幾乎均呈脂滴肝細(xì)胞為+4。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠CHOL、TG、HDL-C、LDL-C、ALT和AST對比

與正常對照組對比，模型對照組CHOL、TG、HDL-C、LDL-C 、ALT、AST含量升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，多烯磷脂酰膽堿組及清肝祛濕活血方各劑量組CHOL、TG、LDL-C、ALT、AST均降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；多烯磷脂酰膽堿組HDL-C無明顯改變，清肝祛濕活血方各劑量組均有所升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與多烯磷脂酰膽堿組對比，清肝祛濕活血方各劑量組CHOL、TG、LDL-C、ALT、AST含量均有降低(P<0.01或P<0.05)，尤以高劑量組中各指標(biāo)含量降低最為顯著(P<0.01)，清肝祛濕活血方各劑量組HDL-C均升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見表1。

分 組CHOL/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)正常對照組1.42±0.14 0.88±0.170.90±0.160.32±0.0530.25±4.8148.2±8.3模型對照組2.65±0.50**1.38±0.42**0.65±0.07**1.05±0.33**87.42±15.3**285.3±16.9**多烯磷脂酰膽堿組1.89±0.39*#0.56±0.22*#0.64±0.06*0.54±0.17*#50.18±3.1*##177.3±18.8*##低劑量組1.54±0.15*#△0.52±0.27*#△0.70±0.08*#△0.40±0.18*#△65.26±5.2*#△225.14±14.1*#△中劑量組1.37±0.13*#△0.42±0.23*#△0.72±0.19*#△0.31±0.06*#△60.15±3.3*#△197.3±11.5*#△高劑量組1.21±0.19*##△△0.34±0.21*##△△0.79±0.16*#△0.24±0.08*##△△53.22±2.8*##△168.2±16.1*##△

注：與正常對照組對比:*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組對比:#P<0.05，##P<0.01；與多烯磷脂酰膽堿組對比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2各組大鼠肝臟組織病理學(xué)對比

2.2.1肉眼觀察

正常對照組大鼠腹腔中無明顯脂肪組織增生,肝臟體積正常，呈紅色。模型對照組大鼠腹腔肥大，肝體積增大明顯，脂肪組織豐富，呈磚紅色，切面油膩感。各治療組與模型對照組對比，大鼠腹腔脂肪組織含量減少，肝臟體積較之偏大，呈暗紅色且部分切面有油膩感。

2.2.2光鏡下HE染色

正常對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝細(xì)胞沿肝竇呈放射狀,排列整齊,肝細(xì)胞大小較一致,核結(jié)構(gòu)清晰無異常；模型對照組大鼠肝組織可見肝細(xì)胞重度彌漫性大泡性脂肪變；各治療組大鼠輕、中度肝細(xì)胞大泡性脂肪變。正常對照組大鼠肝臟無明顯炎癥改變；模型對照組肝臟炎癥明顯,多數(shù)肝細(xì)胞胖脹,小葉內(nèi)可見部分壞死性,炎性細(xì)胞浸潤至匯管區(qū),可見大量炎性細(xì)胞聚集；各治療組大鼠肝細(xì)胞少數(shù)氣球樣變,偶可見小葉內(nèi)有壞死姓,可見輕度炎性細(xì)胞浸潤于匯管區(qū),部分有炎性細(xì)胞聚集，較模型對照組減輕。

3　討　論

中醫(yī)學(xué)中并無非酒精性脂肪肝的病名，根據(jù)其相關(guān)臨床表現(xiàn)，將其歸屬為“積聚”“脅痛”“肝著”“黃疸”“痰證”“脂滿”等范疇。有關(guān)NAFLD的病因病機(jī)，學(xué)者們依據(jù)本病的表現(xiàn)及相關(guān)理論，結(jié)合自己的臨床經(jīng)驗(yàn)提出了諸多觀點(diǎn)。譚遠(yuǎn)忠等[5]認(rèn)為：本病多因飲食引起，過度食用肥甘厚膩及辛辣刺激之品，導(dǎo)致體內(nèi)生痰濕之邪，邪氣阻滯中焦導(dǎo)致脾失健運(yùn)，肝失疏泄，濕濁內(nèi)蘊(yùn)，瘀血阻滯，進(jìn)而導(dǎo)致痰瘀互結(jié)，肝臟脈絡(luò)受到痹阻，形成脂肪肝。遲蕾等[6]認(rèn)為：本病的發(fā)病原因是由于肝郁氣滯、脾腎兩虛，病機(jī)是本虛而標(biāo)實(shí)、痰瘀互結(jié)，肝脈受損。趙文霞等[7]認(rèn)為：本病由于久病體虛、飲食失調(diào)、情志不暢所致，病理因素為氣滯血瘀、痰濕蘊(yùn)結(jié)，病位主要在肝，與腎、脾、胃等臟腑關(guān)系密切。病機(jī)為氣血阻滯、痰濕蘊(yùn)結(jié)，從而影響了肝臟的主要生理功能，日久閉阻肝絡(luò)而發(fā)病。劉平等[8]認(rèn)為：本病是以邪實(shí)為主，濕濁內(nèi)生為始動因素，濕熱蘊(yùn)于血分是其基本病機(jī)。馬曉燕等[9]認(rèn)為：脾腎氣虛是疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，濕濁內(nèi)蘊(yùn)是主要的病理因素，氣虛毒蘊(yùn)為主要病理機(jī)制，本虛標(biāo)實(shí)是其病機(jī)特點(diǎn)。筆者通過多年臨床觀察發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者除具有氣滯血瘀、脾虛濕盛外的表現(xiàn)外，還兼有肝火旺盛的特點(diǎn)。

清肝祛濕活血方由夏枯草、密蒙花、青葙子、茵陳、垂盆草、丹參、郁金組成。方中夏枯草為清肝火、散郁結(jié)的要藥，給予重用；密蒙花配以青葙子治療肝經(jīng)之實(shí)熱且潤肝燥；茵陳具有清熱利濕、退黃的功效，臨床上主要治療黃疸、小便不利、濕瘡瘙癢等疾病，具有利膽、保護(hù)肝功能的作用；垂盆草有清熱解毒、清利濕熱作用，可降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶；配以丹參、郁金活血通絡(luò)，疏肝經(jīng)之瘀，行肝中之結(jié)。全方共奏清肝祛濕、活血化瘀之效[10-11]。

本研究表明:清肝祛濕活血方可減少非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂肪堆積、調(diào)節(jié)血脂、改善肝功能，對非酒精性脂肪肝有一定的治療效果。

[1]TAKAHASHI Y,SUGIMOTO K,INUI H，et al.Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J].World J Gastroenterol,2015,21(13):3777-3785.

[2]聶山文，趙文霞，石艷芬，等.高脂飼料聯(lián)合四環(huán)素腹腔注射復(fù)制非酒精性脂肪肝大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2013,20(6)：374-375.

[3]徐叔云，卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:1349.

[4]江慶瀾，徐邦軍，楊輝,等.多烯磷脂酰膽堿對非酒精性脂肪肝大鼠的干預(yù)效果[J].廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，33(4):4-6.

[5]譚遠(yuǎn)忠.中西醫(yī)結(jié)合治療非酒精性脂肪肝的臨床觀察[J].湖北中醫(yī)雜志，2007，29(8):25-26.

[6]遲蕾.非酒精性脂肪肝的中醫(yī)病因病機(jī)辨析[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9(13):111-112.

[7]梁浩衛(wèi)，趙文霞.趙文霞教授治療非酒精性脂肪性肝病經(jīng)驗(yàn)[J].光明中醫(yī)，2014，29(1):157-158.

[8]慕永平，都金星，劉平.劉平教授治療非酒精性脂肪性肝炎遣方用藥經(jīng)驗(yàn)探析[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2009，19(3):170-171.

[9]呂嬌嬌，馬曉燕.脂肪性肝損傷中醫(yī)病因病機(jī)探討[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，15(1):116-117.

[10]路帥,韓雪,張睦清,等.丹參防治大鼠非酒精性脂肪肝的藥效機(jī)制研究[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，29(2):4-6.

[11]田婷,陳華,馮亞龍,等. 澤瀉藥理與毒理作用的研究進(jìn)展[J].中藥材，2014，37(11):2103-2108.

(編輯陶珠)

2016-02-24；修回日期：2016-05-11

1001-6910(2016)07-0059-03

R575.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.07.29

甘肅省中醫(yī)藥管理局2015年課題資助項(xiàng)目(GZK-2015-7)

·實(shí)驗(yàn)研究·