魚腥草揮發(fā)油對(duì)Raji細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

張壯麗，趙　寧，王亞飛，鄒　敏，趙志鴻，張小俊，王桂芳

1)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室 鄭州450052　2)鄭州市第六人民醫(yī)院藥務(wù)科 鄭州 450001　3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001　△女，1978年1月生，博士，副研究員，研究方向：中藥新藥研究，E-mail：zzl7814@163.com

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魚腥草揮發(fā)油對(duì)Raji細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

張壯麗1)△，趙寧2)，王亞飛3)，鄒敏1)，趙志鴻1)，張小俊1)，王桂芳1)

1)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室 鄭州4500522)鄭州市第六人民醫(yī)院藥務(wù)科 鄭州 4500013)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001△女，1978年1月生，博士，副研究員，研究方向：中藥新藥研究，E-mail：zzl7814@163.com

摘要目的：研究魚腥草揮發(fā)油對(duì)Raji細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法：采用MTT法觀察不同體積分?jǐn)?shù)的魚腥草揮發(fā)油體外誘導(dǎo)Raji細(xì)胞24、48和72 h對(duì)細(xì)胞增殖的影響；分別采用Annexin V-FITC/PI雙染法及PI單染法檢測(cè)不同體積分?jǐn)?shù)的魚腥草揮發(fā)油處理Raji細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變。結(jié)果：魚腥草揮發(fā)油誘導(dǎo)Raji細(xì)胞24、48和72 h的IC50(V/V)分別為0.125 80×10-3、0.099 58×10-3和0.105 22×10-3，且隨魚腥草揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均呈升高的趨勢(shì)(P<0.05)；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明魚腥草揮發(fā)油將細(xì)胞阻滯于G0/G1期。結(jié)論：魚腥草揮發(fā)油能夠顯著抑制Raji細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；其作用機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞G1/M轉(zhuǎn)化有關(guān)。

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)是一組起源于淋巴結(jié)、骨髓、脾臟等淋巴組織的惡性腫瘤，其侵及范圍廣，早期復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，死亡率高，近些年發(fā)病率逐漸上升[1-3]。盡管目前標(biāo)準(zhǔn)化療對(duì)NHL的有效率較高[4]，但不良反應(yīng)大，復(fù)發(fā)率高，且再治療緩解率低，緩解時(shí)間短，損傷骨髓造血系統(tǒng)與免疫功能。作者所在的課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，魚腥草揮發(fā)油(volatile oil from houttuyniae herba，HHO)對(duì)人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用。目前對(duì)魚腥草抗腫瘤作用的研究多集中在魚腥草提取物上[6-8]，對(duì)HHO抗腫瘤作用的研究較少。該研究以Raji細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察HHO對(duì)Raji細(xì)胞增殖及凋亡的影響，以期為HHO在惡性淋巴瘤治療方面的研究與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料Raji細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，HHO由作者所在的實(shí)驗(yàn)室采用水蒸氣蒸餾法提取自魚腥草干品(原藥材購(gòu)自四川江油，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科董誠(chéng)明教授鑒定)。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和DNA含量檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞周期)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，順鉑注射液購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，注射用硫酸長(zhǎng)春新堿(簡(jiǎn)稱長(zhǎng)春新堿)購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。

1.2HHO溶液的配制取HHO溶于DMSO制成體積分?jǐn)?shù)50%的母液，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基,逐級(jí)稀釋至目標(biāo)濃度。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取96孔板，設(shè)給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞混懸液100 μL，細(xì)胞數(shù)(9～10)×103/孔；給藥組分別加入1.2中配制的HHO溶液100 μL，使HHO最終體積分?jǐn)?shù)(10-3)分別為0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入順鉑和長(zhǎng)春新堿溶液各100 μL，使終質(zhì)量濃度均為10 mg/L；陰性對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24、48 和72 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出96孔板，3 000 r/min離心25 min， 吸棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，置于氣浴恒溫振蕩器中37 ℃振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(1-給藥組或陽(yáng)性對(duì)照組A值/陰性對(duì)照組A值×100%)。再以藥物濃度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，作劑量-效應(yīng)曲線，擬合回歸方程，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，設(shè)置給藥組和陰性對(duì)照組，每瓶接種1×106mL-1的細(xì)胞混懸液3 mL；給藥組分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的HHO溶液3 mL，使藥物最終體積分?jǐn)?shù)(×10-3)分別為0.05、0.10、0.15、0.20；陰性對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基?；靹蚝?，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。將各組細(xì)胞1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗2次，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin V-FITC混勻，最后加入5 μL PI，混勻、室溫避光反應(yīng)5～15 min。在染色后1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期取50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，設(shè)置給藥組和陰性對(duì)照組，每瓶接種1×106mL-1的細(xì)胞混懸液3 mL；給藥組分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的HHO溶液3 mL，使藥物最終體積分?jǐn)?shù)(×10-3)分別為0.05、0.10、0.15；陰性對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基?；靹蚝笥?7 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。將各組細(xì)胞1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗1次，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1；取1 mL單細(xì)胞懸液，離心去上清后，向細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇500 μL，4 ℃固定過(guò)夜并保存。將固定后的細(xì)胞1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗1次，加100 μL的RNase A重懸后，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染液混勻，4 ℃避光30 min。將染色后的細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處的紅色熒光，分析細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較不同組間細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞周期分布的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1HHO對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)表1。HHO作用24、48和72 h對(duì)Raji細(xì)胞的IC50(體積分?jǐn)?shù)/×10-3)分別為0.125 80、0.099 58和0.105 22。作用時(shí)間相同時(shí)，在一定范圍(體積分?jǐn)?shù)≤0.250 00×10-3)內(nèi)，隨HHO體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞增殖抑制率呈升高的趨勢(shì)。

表1　各組Raji細(xì)胞的增殖抑制率(n=3)　%

2.2HHO對(duì)Raji細(xì)胞凋亡的影響體積分?jǐn)?shù)(×10-3)分別為0.00(陰性對(duì)照組)、0.05、0.10、0.15和0.20的HHO誘導(dǎo)Raji細(xì)胞48 h的凋亡率分別為(3.27±0.74)%、(13.10±0.82)%、(33.33±3.50)%、(55.53±0.90)%和(75.23±0.87)%，隨著HHO體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞凋亡率呈升高的趨勢(shì)(F=878.629，P<0.001)。

2.3HHO對(duì)Raji細(xì)胞周期的影響見(jiàn)表2。隨HHO體積分?jǐn)?shù)的增加，Raji細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例有升高的趨勢(shì)，S期和G2/M期細(xì)胞比例則呈降低的趨勢(shì)。

表2　HHO誘導(dǎo)48 h對(duì)Raji細(xì)胞周期的影響(n=3)　%

3討論

淋巴瘤是我國(guó)常見(jiàn)的十大惡性腫瘤之一，每年新發(fā)淋巴瘤患者約8.4萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)4.7萬(wàn)，并以每年5%的速度上升，其中約九成患者罹患NHL，其惡性程度更高，預(yù)后更差。目前常用的化療藥物雖治療效果明顯，但常伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)[9-10]。

與普通化療藥相比，中藥多成分多靶點(diǎn)，可以作用于腫瘤發(fā)病的不同環(huán)節(jié)[11-12]，并且具有毒性低、不易產(chǎn)生耐藥、可提高機(jī)體免疫力、使患者生存質(zhì)量更高等特點(diǎn)，近年來(lái)在抗腫瘤新藥開發(fā)領(lǐng)域，具有抗腫瘤作用的中藥及其有效成分得到了越來(lái)越多的關(guān)注。

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，味辛，性微寒，歸肺經(jīng)，有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效[13]。作者所在的實(shí)驗(yàn)組采用水蒸氣蒸餾法提取HHO并優(yōu)化了提取工藝[14]，采用氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)從HHO中分離鑒定出29個(gè)主成分，并利用偏最小二乘回歸分析法對(duì)不同產(chǎn)地HHO GC-MS特征峰與Raji細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行了譜效關(guān)系分析，結(jié)果表明HHO抗淋巴瘤的有效成分組包括對(duì)傘花烴、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯、2-十二烷酮和石竹烯，其對(duì)Raji細(xì)胞的抑制作用應(yīng)為這些物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果[15]。

該研究結(jié)果表明，HHO能夠有效抑制Raji細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，填補(bǔ)了HHO抗腫瘤研究方面的空白，為其在治療NHL方面的研究及應(yīng)用提供了參考。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，Raji細(xì)胞經(jīng)HHO處理后細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，提示HHO誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期G1/M轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞中DNA合成和有絲分裂有關(guān)，然而細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)[16-18]，HHO具體作用于哪些環(huán)節(jié)，還需進(jìn)一步探索研究。

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(2015-10-16收稿責(zé)任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.010

中圖分類號(hào)R965

關(guān)鍵詞魚腥草揮發(fā)油；Raji細(xì)胞；凋亡；細(xì)胞周期

Effect of volatile oil from houttuyniae herba on proliferation and apoptosis of Raji cells

ZHANG Zhuangli1)，ZHAO Ning2)，WANG Yafei3)，ZOU Min1)，ZHAO Zhihong1)，ZHANG Xiaojun1)，WANG Guifang1)

1)MedicinalChemistrySection,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,Zhengzhou4500522)DepartmentofMedicineServices,theSixthPeople′sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou4500013)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsvolatile oil from houttuyniae herba；Raji cell；apoptosis；cell cycle

AbstractAim: To investigate the effect of volatile oil from houttuyniae herba(HHO) on the proliferation and apoptosis of Raji cells.Methods: Different volume fraction of HHO was used to treat Raji cells for 24，48 and 72 h;the prolifera tion of Raji cells was determined by MTT assay.Different volume fraction of HHO was used to treat Raji cells for 48 h; the cell apoptosis rate was measured by Annexin V-FITC/PI double staining method，and the cell cycle was observed by PI staining method.Results: The MTT results showed that IC50(V/V) of HHO for 24，48 and 72 h treatment was 0.125 80×10-3，0.099 58×10-3and 0.105 22×10-3；with the increase of volume fraction，the inhibitory effect and apoptosis rate showed a rising trend(P<0.05).The results of cell cycle detection showed that HHO was able to arrest Raji cells in G0/G1 phase.Conclusion: HHO could significantly inhibit the proliferation of Raji cells and induce cell apoptosis,and the mechanism may be related to HHO′s blocking G1/M conversion of Raji cells.

*河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目142102310433；河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目152300410159；河南省省屬科研單位社會(huì)公益項(xiàng)目預(yù)研專項(xiàng)2013，2014

*：與順鉑組和長(zhǎng)春新堿組比較，P<0.05；#：不同體積分?jǐn)?shù)的HHO組間除0.250 00×10-3和0.500 00×10-3組外，其他組間兩兩比較，P均<0.05。

*：與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；#：與0.05×10-3HHO組相比，P<0.05；△：與0.10×10-3HHO組相比，P<0.05。