大孔樹(shù)脂純化欒樹(shù)葉多酚工藝研究

李衍方, 高彩霞， 韓相恩

(1. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116； 2. 徐州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 徐州 221000； 3. 北京海德潤(rùn)制藥有限公司，北京 101113)

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大孔樹(shù)脂純化欒樹(shù)葉多酚工藝研究

李衍方1,2, 高彩霞3， 韓相恩1*

(1. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116； 2. 徐州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 徐州 221000； 3. 北京海德潤(rùn)制藥有限公司，北京 101113)

摘要：以欒樹(shù)葉多酚提取物為原料，比較了7種大孔樹(shù)脂對(duì)欒樹(shù)葉多酚的靜態(tài)吸附與解吸效果，結(jié)果表明AB-8樹(shù)脂性能最佳，其24 h靜態(tài)吸附量為13.74 mg/g,解吸率為98.35 %， 3 h內(nèi)達(dá)到吸附平衡與解吸平衡。AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附較佳條件為上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L，上樣液pH值為6，在此條件下吸附率為88.21 %，動(dòng)態(tài)洗脫較佳條件為洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %，洗脫速度為1 mL/min，解吸率達(dá)到89.91 %，在該條件下欒樹(shù)葉總多酚經(jīng)AB-8樹(shù)脂純化后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)由50.36 %增加到72.37 %，回收率為86.83 %。

關(guān)鍵詞：欒樹(shù)葉多酚；純化；大孔樹(shù)脂

欒樹(shù)(KoelreuteriapaniculataLaxm.)，無(wú)患子科(Sapindaceae)欒樹(shù)屬(Koelreuteria)植物，落葉灌木或喬木。欒樹(shù)屬共有4種、 1變種，中國(guó)產(chǎn)3種、 1變種，另1種產(chǎn)于大洋洲斐濟(jì)群島。該屬植物在我國(guó)資源豐富，藥用價(jià)值高，漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》記載欒華(花)“主目痛，淚出傷眥，消目腫”；唐代《唐本草》記載“合黃連共煎，療目赤”，我國(guó)民間以搖錢(qián)樹(shù)的花和根做“疏風(fēng)清熱、止咳殺蟲(chóng)”藥，欒樹(shù)所含成分的生物活性主要有抑菌[1]、細(xì)胞毒性和抗癌[2]、抗氧化[3-4]、殺蟲(chóng)[5]等。欒樹(shù)葉含有大量多酚物質(zhì)，主要組分為山奈酚及其衍生物、沒(méi)食子酸及其衍生物、β-谷甾醇及其衍生物、金絲桃苷及槲皮苷等[6-7]。大孔樹(shù)脂具有吸附快、吸附量大、穩(wěn)定性好、選擇性高、易解吸、易再生等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于多酚類(lèi)物質(zhì)的分離與富集[8-9]。本研究選取了7種對(duì)多酚分離純化效果較好的樹(shù)脂，從中篩選出一種性能較佳樹(shù)脂，考察該樹(shù)脂對(duì)欒樹(shù)葉多酚的靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附與解吸性能及主要影響因素，從而確定欒樹(shù)葉多酚的較佳純化方法。

1實(shí) 驗(yàn)

1.1材料與試劑

欒樹(shù)(KoelreuteriapaniculataLaxm.)葉多酚提取物按文獻(xiàn)[10]自制。具體制備過(guò)程如下：稱取一定質(zhì)量粉碎后的欒樹(shù)葉粉末，以液料比25∶1 (mL∶g)加入72 %乙醇水溶液，超聲波功率200 W，提取溫度60 ℃，超聲波提取時(shí)間為每次15 min，提取3次，過(guò)濾，合并濾液，濾液于45 ℃減壓濃縮至30 mL，加水至200 mL，先以石油醚萃取3次，每次60 mL，再以乙酸乙酯萃取3次，每次60 mL，合并乙酸乙酯萃取液，45 ℃下減壓濃縮至干，得欒樹(shù)葉多酚提取物。

大孔樹(shù)脂AB-8、D101、HPD100、HPD400、HPD500、HPD600、HPD750，滄州寶恩化工有限公司。沒(méi)食子酸對(duì)照品(110831-201204)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水，自制。

1.2儀器

KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Lambda 25紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，珀金埃爾默儀器(上海)有限公司；玻璃層析柱(Φ2 cm×30 cm)，泰興市三愛(ài)思實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3總多酚測(cè)定

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行繪制，線性回歸方程Y=0.132 99+0.063 39，R=0.999 26，線性范圍為1～10 mg/L。

1.3.2樣品中總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定精確稱取0.020 0 g待測(cè)樣品，少量無(wú)水乙醇溶解后，加入蒸餾水定容至100 mL，得到0.2 g/L樣品溶液，取1 mL樣品溶液至10 mL容量瓶中，加入1 mL蒸餾水，搖勻，加入1 mL福林酚試劑，搖勻，靜置4 min后，加入2 mL飽和Na2CO3溶液，蒸餾水定容，搖勻，25 ℃下避光放置2 h，于750 nm處重復(fù)測(cè)定3次吸光值，取平均值，代入1.3.1節(jié)的回歸方程，計(jì)算樣品溶液中總多酚質(zhì)量濃度，按照式(1)計(jì)算欒樹(shù)葉多酚提取物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

w=C×V/(n×m)×100 %

(1)

式中：w—多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； C—多酚質(zhì)量濃度，mg/L； V—樣品體積，mL； n—稀釋倍數(shù)，10； m—樣品質(zhì)量，g。

通過(guò)計(jì)算得到提取物中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.36 %。

1.4大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

將大孔樹(shù)脂于95 %乙醇中浸泡24 h，不斷攪拌，除去氣泡，用蒸餾水洗至無(wú)乙醇味，然后用5 %HCl溶液浸泡3 h，再用蒸餾水洗至中性，最后用5 % NaOH溶液浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性。

1.5大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

1.5.1靜態(tài)吸附以80 %乙醇水溶液為溶劑，配制一系列質(zhì)量濃度的欒樹(shù)葉多酚提取物。稱取經(jīng)預(yù)處理的7種型號(hào)的大孔樹(shù)脂各2 g，用濾紙吸干表面水分后，置于150 mL具塞磨口三角瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的欒樹(shù)葉多酚提取物80 %乙醇溶液40 mL，置于搖床上， 25 ℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min振蕩24 h，取上清液測(cè)定溶液中總多酚質(zhì)量濃度，按照式(2)和(3)計(jì)算吸附量和吸附率：

Q=(C0-C1)×V/m

(2)

A=(C0-C1)/C0×100 %

(3)

式中：Q—樹(shù)脂吸附量，mg/g；A—樹(shù)脂吸附率，%； C0—起始溶液中總多酚質(zhì)量濃度，g/L；C1—上清液中總多酚質(zhì)量濃度，g/L；V—溶液體積，mL；m—樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.5.2靜態(tài)解吸將充分吸附后的樹(shù)脂用蒸餾水快速洗至大孔樹(shù)脂表面無(wú)多酚溶液殘留，加入體積分?jǐn)?shù)80 %乙醇水溶液40 mL于各吸附完全的樹(shù)脂中，置于搖床上， 25 ℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min振蕩24 h，取上清液測(cè)定洗脫液中總多酚質(zhì)量濃度，按照式(4)計(jì)算解吸率：

D=(Cd×Vd)/(m×Q)×100 %

(4)

式中：D—樹(shù)脂解吸率，%；Cd—解吸后溶液中總多酚質(zhì)量濃度，g/L；Vd—解吸液體積，mL。

1.5.3AB-8樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)曲線的繪制比較了7種大孔樹(shù)脂對(duì)欒樹(shù)葉多酚的靜態(tài)吸附和解吸性能，最終選取了吸附和解吸性能均較好的AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性的研究。

稱取3份經(jīng)預(yù)處理好的AB-8樹(shù)脂2 g，多酚質(zhì)量濃度2.85 g/L的欒樹(shù)葉多酚提取物80 %乙醇溶液40 mL，按1.5.1節(jié)操作靜態(tài)吸附12 h，每隔0.5 h取0.1 mL溶液測(cè)定總多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

按1.5.2節(jié)的操作將充分吸附的樹(shù)脂解吸12 h，每隔0.5 h取0.1 mL溶液測(cè)定總多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率，繪制靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

1.6AB-8樹(shù)脂對(duì)欒樹(shù)葉多酚純化條件的確定

1.6.1上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響將預(yù)處理好的樹(shù)脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹(shù)脂填充高度為20 cm，將欒樹(shù)葉多酚提取物溶液配置成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的上樣液，分別為2、 3、 4、 5、 6和8 g/L，上樣體積分別為8.0、 5.3、 4.0、 3.2、 2.7和2.0 mL，上樣速度為2 mL/min，上樣液pH值為6，分別上樣，吸附2 h后測(cè)定吸附后溶液中多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量。

1.6.2上樣液pH值對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響將預(yù)處理好的樹(shù)脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹(shù)脂填充高度為20 cm，將質(zhì)量濃度為4 g/L欒樹(shù)葉多酚提取物溶液分成5份，分別調(diào)節(jié)其pH值為2、 4、 6、 8、 10后上樣，上樣液體積4 mL，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，測(cè)定吸附后溶液中多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量。

1.6.3洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響將預(yù)處理好的樹(shù)脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹(shù)脂填充高度為20 cm，加入4 g/L欒樹(shù)葉多酚提取物溶液4 mL，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，用體積分?jǐn)?shù)分別為40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %乙醇溶液作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1 mL/min，每5 mL收集1管，共收集24管，測(cè)定每管洗脫液中多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。

1.6.4洗脫劑流速對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響將預(yù)處理好的樹(shù)脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹(shù)脂填充高度為20 cm，加入質(zhì)量濃度為4 g/L欒樹(shù)葉多酚提取物溶液4 mL，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，用體積分?jǐn)?shù)為60 %乙醇溶液作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速分別為0.5、 1、 2、 3 mL/min，每5 mL收集1管，共收集24管，測(cè)定每管洗脫液多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。

1.7動(dòng)態(tài)洗脫曲線及多酚純度

將預(yù)處理好的樹(shù)脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹(shù)脂填充高度為20 cm，加入質(zhì)量濃度為4 g/L的欒樹(shù)葉多酚提取物溶液，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，用體積分?jǐn)?shù)為60 %乙醇溶液洗脫，洗脫流速為1 mL/min，同時(shí)于柱末端收集流出液，每5 mL收集1管，共收集24管，測(cè)定每管中總多酚的質(zhì)量濃度，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線，收集洗脫液，于50 ℃下減壓濃縮至干，得濃縮物，稱質(zhì)量，按1.3.2節(jié)計(jì)算濃縮物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2結(jié)果與討論

2.1大孔樹(shù)脂的篩選

2.1.1不同樹(shù)脂吸附與解吸附能力的比較大孔樹(shù)脂吸附能力的大小與樹(shù)脂的極性、比表面積、孔徑、能否與吸附物形成氫鍵等因素有關(guān)，對(duì)7種大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附和解吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知：HPD500樹(shù)脂吸附率最高為89.01 %，其次是HPD400樹(shù)脂吸附率為88.95 %，雖然AB-8樹(shù)脂吸附率略低于HPD500及HPD400，但其解吸率最高為98.35 %。綜合考慮吸附和解吸附效果，選擇AB-8樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)的純化工作。

表 1　不同大孔樹(shù)脂對(duì)欒樹(shù)葉多酚的吸附和解吸性能

2.1.2AB-8大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸曲線圖1給出了AB-8樹(shù)脂的吸附與解吸曲線。由圖1可知:AB-8樹(shù)脂在3 h基本達(dá)到飽和，再延長(zhǎng)吸附時(shí)間，吸附率變化不大，屬于快速平衡型。樹(shù)脂在3 h內(nèi)基本完全解吸，解吸率達(dá)到98.29 %。

圖 1　AB-8樹(shù)脂的吸附(a)與解吸(b)曲線Fig. 1　Adsorption (a) and desorption (b) curves of AB-8

2.2AB-8樹(shù)脂對(duì)欒樹(shù)葉多酚的純化條件

2.2.1上樣液質(zhì)量濃度由圖2可知：當(dāng)多酚質(zhì)量濃度在2～4 g/L時(shí)，樹(shù)脂吸附率隨著多酚質(zhì)量濃度的增加而迅速增加，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度在4～8 g/L時(shí)，樹(shù)脂吸附率隨著多酚質(zhì)量濃度的增加而降低。上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，吸附率達(dá)到最大，為87.45 %。這是因?yàn)楫?dāng)樣液質(zhì)量濃度較低時(shí)，AB-8樹(shù)脂的吸附量隨著樣液質(zhì)量濃度的增加而增加，但是，當(dāng)樣液質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，與多酚競(jìng)爭(zhēng)吸附的雜質(zhì)也在增加，導(dǎo)致樹(shù)脂吸附量有所下降。因此選擇上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L。

2.2.2上樣液pH值由圖3可知：上樣液pH值較小，酸性較強(qiáng)時(shí)，樹(shù)脂吸附率較小，上樣液pH值為6時(shí)，樹(shù)脂吸附率最大，為88.21 %，上樣液堿性增大時(shí)，樹(shù)脂吸附率降低明顯。這可能是由于欒樹(shù)葉中多酚大多屬于黃酮類(lèi)物質(zhì)，含酚羥基較多，呈弱酸性，故在弱酸性條件下吸附效果好。因此選擇上樣液較佳pH值為6。

圖 2　上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響　　　　　　　圖 3　上樣液pH值對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響Fig. 2　Effect of sample mass concentration on absorption　　Fig. 3　Effect of sample pH value on absorption

2.2.3洗脫劑體積分?jǐn)?shù)由圖4可知：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚解吸率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %時(shí)，解吸率達(dá)到最大值，為88.89 %。這可能是由于乙醇極性比水弱，故體積分?jǐn)?shù)大的乙醇能溶解出更多的弱極性物質(zhì)，同時(shí)，更多的雜質(zhì)也被溶解出來(lái)。因此選用60 %乙醇為柱層析純化用洗脫劑。

2.2.4洗脫劑流速由圖5可知：洗脫劑流速低于1 mL/min時(shí)，多酚類(lèi)化合物的死吸附過(guò)多，解吸率低；洗脫劑流速高于1 mL/min時(shí)，洗脫劑沒(méi)來(lái)得及與吸附在樹(shù)脂上的多酚充分接觸，使其不能將多酚完全置換出來(lái)，致使多酚類(lèi)化合物解吸率降低明顯。因此較佳洗脫速率為1 mL/min，解吸率為89.91 %。

2.3動(dòng)態(tài)洗脫曲線及多酚含量

由圖6可知：開(kāi)始時(shí)，洗脫液中多酚質(zhì)量濃度隨著洗脫體積的增加而增大，當(dāng)洗脫至第9管時(shí)，多酚質(zhì)量濃度增加顯著，第12管時(shí)洗脫液中多酚質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，之后隨著洗脫體積的增加，多酚質(zhì)量濃度逐漸下降，第16管后多酚質(zhì)量濃度下降明顯，因此收集9～16管的40 mL洗脫液，于50 ℃下減壓濃縮至干，稱質(zhì)量，得濃縮物，測(cè)定濃縮物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72.37 %，回收率為86.83 %。

圖 4洗脫劑濃度對(duì)多酚解吸率的影響

圖 5洗脫劑流速對(duì)多酚解吸率的影響

圖 6欒樹(shù)葉多酚動(dòng)態(tài)洗脫曲線

Fig. 4Effect of ethanol concentration on desorption rate

Fig. 5Effect of elution speed on desorption rate

Fig. 6Dynamic desorption curve of polyphenols ofK.paniculata

3結(jié) 論

3.1以欒樹(shù)葉多酚提取物為原料，研究了7種大孔樹(shù)脂對(duì)欒樹(shù)葉多酚的靜態(tài)吸附與解吸附效果，從7種大孔樹(shù)脂中篩選出最為適宜的AB-8樹(shù)脂，其24 h靜態(tài)吸附量為13.74 mg/g，解吸率為98.35 %。

3.2以欒樹(shù)葉多酚提取物為原料，通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附與解吸研究，確定AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附較佳條件為上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L，上樣液pH值為6，此時(shí)，吸附率為88.21 %。AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫較佳條件為洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %，洗脫速度為1 mL/min，解吸率為89.91 %。

3.3按照以上較佳柱層析條件純化欒樹(shù)葉多酚提取物，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)由50.36 %增加到72.37 %，回收率為86.83 %。

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doi:10.3969/j.issn.1673-5854.2016.04.008

收稿日期：2015-12-29

基金項(xiàng)目:中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金(2015XKZD08)

作者簡(jiǎn)介：李衍方(1982— )，女，江蘇徐州人，工程師，博士生，主要從事天然資源化學(xué)利用工作 *通訊作者：韓相恩，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域：天然資源化學(xué)利用;E-mail:xiangenh@163.com。

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ35；Q946.82

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-5854(2016)04-0042-05

Purification of Polyphenols from Koelreuteria paniculata Laxm. Leaves by Macroporous Resin

LI Yan-fang1,2, GAO Cai-xia3, HAN Xiang-en1

(1. China University of Mining and Technology,School of Chemical Engineering and Technology, Xuzhou 221116, China;2. Xuzhou Products Quality Supervision and Inspection Center, Xuzhou 221000, China; 3. Beijing Haiderun Pharmaceutical Co. Ltd, Beijing 101113, China)

Abstract:The absorption and desorption behaviors of seven macroporous resins for polyphenols from Koelreuteria paniculata Laxm. were investigated. The 24 h static adsorption capacity and desorption rate of AB-8 resin was 13.74 mg/g and 98.35 %,respectively. The static adsorption and desorption equilibrium time of AB-8 resin was both less than 3 h. The optimum conditions of dynamic absorption and desorption by AB-8 were sample mass concentration 4 g/L,sample pH value 6,and volume fraction of ethanol 60 %,elution speed 1 mL/min,respectively.Under these conditions,the adsorption rate was 88.21 % and desorption rate was 89.91 %.The purity of polyphenols from Koelreuteria paniculata Laxm. increased from 50.36 % to 72.37 % after purification using AB-8 resin and the recovery rate was 86.83 %.

Key words:polyphenols of Koelreuteria paniculata Laxm. leaves;purification;macroporous resin

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