NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木的纖維素酶分段酶水解研究

王燕云， 吳 凱， 雷福厚， 楊 靜*

(1. 西南林業(yè)大學(xué) 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224; 2. 西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院，云南 昆明 650224; 3. 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006)

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NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木的纖維素酶分段酶水解研究

王燕云1,2， 吳 凱1,2， 雷福厚3， 楊 靜1,2*

(1. 西南林業(yè)大學(xué) 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224; 2. 西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院，云南 昆明 650224; 3. 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006)

摘要：采用分段酶水解木質(zhì)纖維原料的方法，以NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木為原料，通過(guò)在反應(yīng)過(guò)程中及時(shí)移除葡萄糖和纖維二糖，減輕產(chǎn)物的抑制作用，最終達(dá)到提高酶水解得率和縮短酶解反應(yīng)時(shí)間的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：纖維素酶用量為15 FPIU/g(以纖維素計(jì)，下同)時(shí)，在三段(8+8+8 h)水解過(guò)程中，經(jīng)第一段水解，纖維素酶反應(yīng)速率從1.25 g/(L·h)提高到2.21 g/(L·h)，第二段水解后，酶反應(yīng)速率為1.54 g/(L·h)，比未分段水解的酶反應(yīng)速率提高了73 %；當(dāng)纖維素酶用量為40 FPIU/g時(shí)，三段(8+8+8 h)水解得率增至88.08 %；三段(8+8+8 h)水解充分利用了酶解殘?jiān)系慕Y(jié)合酶進(jìn)行后續(xù)水解。對(duì)纖維素酶在預(yù)處理桑木上的吸附情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)桑木經(jīng)NaOH-Fenton試劑預(yù)處理后，對(duì)纖維素酶的最大吸附量為8.08 mg/g，預(yù)處理增加了纖維素酶與桑木間的吸附位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；酶水解；酶反應(yīng)速率；纖維素吸附

云南是我國(guó)第二大桑蠶產(chǎn)業(yè)基地，桑樹(shù)栽培歷史悠久，品種十分豐富[1]。為了提高桑木的葉產(chǎn)量，通常每年對(duì)桑木進(jìn)行修剪，大量修剪的桑枝常作為薪柴燒掉，未被充分利用，而快速增長(zhǎng)的、含豐富纖維素的桑木是一種有前景的制備燃料乙醇的木質(zhì)纖維原料。木質(zhì)纖維原料制備燃料乙醇主要經(jīng)過(guò)原料預(yù)處理、纖維素酶制備和水解、糖液(戊糖、己糖)乙醇發(fā)酵和酒精蒸餾、脫水等技術(shù)。木質(zhì)纖維原料在酶水解前需要經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理方法主要有物理法、化學(xué)法、生物法和聯(lián)合法。褐腐菌降解木質(zhì)纖維素是常用的生物預(yù)處理方法，但存在天然微生物菌株的活力限制，且處理周期長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)效率較低，不適宜大規(guī)模工業(yè)化。本研究所采用的NaOH-Fenton試劑預(yù)處理方法是借鑒褐腐菌降解木材的研究思路，利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的外源羥基自由基(OH·)，模擬褐腐菌體外解聚纖維素的過(guò)程[2]，有望解決現(xiàn)有預(yù)處理方法存在的高能耗、高污染等問(wèn)題。纖維素酶水解是利用纖維素酶或半纖維素酶降解纖維素或半纖維素為六碳糖或五碳糖的過(guò)程。在木質(zhì)纖維原料酶水解過(guò)程中，產(chǎn)物抑制是限制酶解速率的一個(gè)重要因素[3]。酶水解液中纖維二糖和葡萄糖的存在，抑制纖維素酶的活性，并且使得酶反應(yīng)速率降低和纖維素完全水解的時(shí)間延長(zhǎng)，增加纖維素酶用量可以提高酶水解反應(yīng)的速率且縮短纖維素完全水解的時(shí)間，但增加了水解反應(yīng)的成本。國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維素酶水解的重點(diǎn)均放在對(duì)酶水解性能的提高上[4]，而忽視了長(zhǎng)的水解時(shí)間將降低纖維素酶各組分的協(xié)同水解活性及制備燃料乙醇的勞動(dòng)生產(chǎn)率。因此，本研究針對(duì)水解液中葡萄糖、纖維二糖對(duì)酶水解反應(yīng)的抑制作用，研究了終產(chǎn)物對(duì)纖維素酶分段水解NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木的平均酶反應(yīng)速率和水解得率的影響，以期為建立氫氧化鈉-芬頓試劑預(yù)處理及分段酶水解集成技術(shù)提供參考。

1材料與方法

1.1原料與試劑

桑木采自云南陸良縣，經(jīng)粉碎過(guò)篩后，得到粒徑為0.30～0.45 mm的桑木粉，備用。里氏木霉纖維素酶，丹麥諾維信(Novozyme)公司生產(chǎn)，Sigma公司提供，其濾紙酶活為125 FPIU/mL，β-葡糖苷酶酶活為27 IU/mL。過(guò)氧化氫(H2O2)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥30 %，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，淡藍(lán)綠色結(jié)晶，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Avicel PH-101微晶纖維素，F(xiàn)luka公司提供。

1.2NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木

將桑木在20 g/L的NaOH 溶液、底物質(zhì)量濃度100 g/L和65 ℃下處理2 h，待反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌固體殘?jiān)林行?，備用。取絕干質(zhì)量1 g的NaOH預(yù)處理后的桑木，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 %H2O24 mL、 16 mmol/L Fe2+溶液，使溶液中桑木的質(zhì)量濃度為100 g/L，并于pH值3.0和150 r/min的條件下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌固體渣，得預(yù)處理料，作為纖維素酶水解反應(yīng)的底物。

1.3預(yù)處理桑木的酶水解

1.3.1纖維素酶一段水解取絕干質(zhì)量為10 g的經(jīng)氫氧化鈉-芬頓預(yù)處理后的桑木(預(yù)處理料)置于250 mL三角瓶中，加入一定量的水、檸檬酸緩沖液和纖維素酶液，使底物質(zhì)量濃度為100 g/L，酶用量為15 FPIU/g(以纖維素計(jì)，下同)。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置?0±1 ℃、150 r/min的搖床中反應(yīng)，分別于2、 4、 8、 12、 24、 48、 60、 72 h取樣，于3 000 r/min下離心10 min，取清液適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定反應(yīng)液中葡萄糖和纖維二糖的濃度變化，并計(jì)算酶解得率[5-6]。

1.3.2纖維素酶分段水解取絕干質(zhì)量為10 g的預(yù)處理料于250 mL三角瓶中，加入一定量的水、檸檬酸緩沖液和纖維素酶液，使底物質(zhì)量濃度100 g/L，酶用量為15 FPIU/g。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置?0 ℃、150 r/min搖床中反應(yīng)一定時(shí)間后，采用固液分離將反應(yīng)產(chǎn)物移走；洗滌酶解殘?jiān)?，并補(bǔ)加一定量的酶液(用超濾的方法回收上清液中的纖維素酶，測(cè)定酶活力，根據(jù)酶活力決定補(bǔ)充的酶量)、緩沖液和水繼續(xù)下一段的反應(yīng)。根據(jù)酶反應(yīng)速率把24 h等分，水解方案分別為(12+12 h)、(8+8+8 h)和(6+6+6+6 h)。

1.3.3纖維素酶的Langmuir等溫吸附曲線和動(dòng)力學(xué)方程為確定纖維素酶在不同底物上的等溫吸附曲線，以0.1 g樣品(微晶纖維素Avicel、NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的Avicel、桑木和NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的桑木)為底物，分別加入不同質(zhì)量濃度的纖維素酶溶液(0.01～1.0 g/L)，一定量的水和檸檬酸緩沖液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置? ℃、150 r/min的搖床中反應(yīng)3 h，達(dá)到平衡后，進(jìn)行固液分離。用Bradford方法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)濃度，并作為游離酶濃度；底物上的結(jié)合酶濃度為初始纖維素酶蛋白濃度與上清液中游離酶蛋白濃度之差[7]。

1.4分析方法

1.4.1水分的測(cè)定水分的測(cè)定采用紅外線水分計(jì)FD-720測(cè)定。

1.4.2纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測(cè)定樣品的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的組成按美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室公布的方法測(cè)定[8]。

1.4.3蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法測(cè)定，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[7]。

1.4.4酶水解液中糖組分的測(cè)定采用高效液相色譜(HPLC,Agilent technology 1100 series,Palo Alto,CA)法測(cè)定酶水解液中的糖組分。酶水解后的上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，以0.005 mol/L 的硫酸作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，在示差折光檢測(cè)器(RI)上進(jìn)行檢測(cè)。纖維素水解得率計(jì)算如式(1)所示：

(1)

式中：Y—纖維素水解得率，%；C1、C2、C3、C4—分別表示第一、二、三、四段水解液及洗液中還原糖質(zhì)量濃度，g/L；V1、V2、V3、V4—分別表示第一、二、三、四段水解液及洗液的體積，L；m—原料質(zhì)量，g；w—原料中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； 1.1 — 纖維素和葡萄糖之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.4.5纖維素酶的Langmuir等溫吸附曲線用Langmuir等溫吸附方程擬合不同底物對(duì)纖維素酶的吸附性能[9-10]，方程如下所示，Γmax和K值可由Langmuir線性方程擬合得出式(2)，并由式(3)計(jì)算得到分配系數(shù)(R)。

Γ=KCΓmax/(1+KC)

(2)

R=Γmax×K

(3)

式中：C—平衡時(shí)，上清液中的自由酶質(zhì)量濃度，g/L；Γ—平衡時(shí)，底物上結(jié)合酶的吸附量，mg/g；Γmax—底物上纖維素酶的最大吸附量，mg/g；K—Langmuir常數(shù)，反映纖維素酶親和力的大小，L/g；R—分配系數(shù)，反映纖維素與底物的相對(duì)親和力，L/g。

2結(jié)果與分析

2.1桑木預(yù)處理

為了解NaOH-Fenton預(yù)處理方法對(duì)桑木化學(xué)組成的影響，分別測(cè)定了桑木預(yù)處理前后的化學(xué)組成，預(yù)處理前的原料中含纖維素37.54 %、半纖維素21.33 %和木質(zhì)素27.79 %， NaOH-Fenton預(yù)處理后樣品中含纖維素53.99 %、半纖維素7.91 %和木質(zhì)素30.12 %。與桑木原料相比，經(jīng)NaOH-Fenton預(yù)處理，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，從21.33 %降低至7.91 %，纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)增加，主要是由于經(jīng)過(guò)NaOH-Fenton預(yù)處理后，破壞了桑木原本的天然高分子結(jié)構(gòu)，使得部分半纖維素糖溶出，導(dǎo)致纖維素和木質(zhì)素在固體殘?jiān)械暮肯鄬?duì)增加。同時(shí)，NaOH-Fenton預(yù)處理對(duì)纖維素起到潤(rùn)脹作用，有利于后續(xù)酶水解過(guò)程中纖維素與纖維素酶的結(jié)合。

圖 1　纖維素酶一段水解預(yù)處理桑木的得率 和平均反應(yīng)速率Fig. 1　One-stage enzymatic hydrolysis yield and average reaction rate of pretreated mulberry wood

2.2預(yù)處理桑木的纖維素酶水解

2.2.1纖維素酶一段水解桑木按1.3.1節(jié)操作，纖維素酶一段水解NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的桑木，反應(yīng)過(guò)程中平均酶反應(yīng)速率和酶水解得率的變化如圖1所示。由圖1可知：經(jīng)NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木纖維素酶一段水解，在水解初期，水解速度很快，6 h時(shí)，纖維素酶水解得率為18.99 %；而在6～24 h內(nèi)，水解速度逐漸減慢，24 h時(shí)，纖維素酶水解得率為39.84 %；24～48 h后速度更為緩慢，水解48 h，纖維素酶水解得率為48.73 %，延長(zhǎng)水解時(shí)間到72 h，纖維素酶水解得率的增加不明顯，水解得率為55.54 %。從圖中可以看出，平均酶反應(yīng)速率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)衰減很大，在反應(yīng)的初始2 h，平均酶反應(yīng)速率最高，為3.73 g/(L·h)；反應(yīng)8 h，平均酶反應(yīng)速率大幅降低，為1.34 g/(L·h)，僅為2 h時(shí)的35.92 %；當(dāng)反應(yīng)到24 h時(shí)，平均反應(yīng)速率為0.55 g/(L·h)，僅為2 h時(shí)的14.75 %；延長(zhǎng)水解時(shí)間到72 h，酶平均反應(yīng)速率降為0.25 g/(L·h)。

造成這種現(xiàn)象的可能原因是纖維素酶是一種受反饋抑制的水解酶類，根據(jù)纖維素酶水解協(xié)同作用機(jī)理，終產(chǎn)物葡萄糖反饋抑制β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶受抑制后導(dǎo)致體系中纖維二糖濃度提高，纖維二糖的累積反饋抑制外切和內(nèi)切葡聚糖酶，從而導(dǎo)致酶水解效率的降低；其次，纖維素酶水解速度與纖維素的超分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，水解初期，主要是纖維素?zé)o定形區(qū)的水解，隨著無(wú)定形區(qū)纖維素被水解，底物的結(jié)晶度逐漸增大，主要是結(jié)晶纖維素表面的水解，故水解速度減慢，到水解后期，剩下的高結(jié)晶纖維素更難水解，故水解速度緩慢。有研究[11]表明：可通過(guò)及時(shí)除去生成的葡萄糖來(lái)解除產(chǎn)物抑制作用，如采用真空抽濾和超濾間歇除去葡萄糖，同時(shí)回收了纖維素酶。酶水解過(guò)程中簡(jiǎn)單的固液分離就能使終產(chǎn)物濃度下降，從而可提高后續(xù)反應(yīng)的酶平均反應(yīng)速率。

2.2.2纖維素酶水解分段方式的選擇實(shí)驗(yàn)選擇的不同分段方案對(duì)纖維素酶水解得率的影響結(jié)果如

表 1纖維素酶分段水解NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木的水解得率

Table 1Multi-stage hydrolysis yield of NaOH-Fenton pretreated mulberry wood

水解方案scheme酶水解得率enzymatichydrolysisyield/%第一段thefirststage第二段thesecondstage第三段thethirdstage第四段thefourthstage合計(jì)total24h39.2739.2712+12h24.0320.1744.208+8+8h19.2620.2015.9455.406+6+6+6h18.7217.6511.799.2457.40

表1所示。酶水解反應(yīng)后，纖維素酶蛋白吸附于底物上，稱之為結(jié)合酶。研究表明[12],分段酶水解充分利用了酶解殘?jiān)系慕Y(jié)合酶，簡(jiǎn)單離心分離解除產(chǎn)物抑制后，大量活性的纖維素酶蛋白吸附在底物上，酶解殘?jiān)系慕Y(jié)合酶的協(xié)同水解活性得到改善；短時(shí)間的反應(yīng)使得溫度、剪切力等因素對(duì)結(jié)合酶活性的影響不大，底物上的結(jié)合酶仍然具備高的協(xié)同降解天然纖維素的反應(yīng)性。

由表1可知，NaOH-Fenton試劑預(yù)處理后的桑木經(jīng)分段酶水解后，酶水解得率均高于一段水解。兩段(12+12 h)、 三段(8+8+8 h)和四段(6+6+6+6 h)的水解得率分別為44.20 %、 55.40 %和57.40 %；同一段水解(24 h)的水解得率(39.27 %)相比，兩段、三段和四段的水解得率分別提高了12.55 %、 41.07 %和46.17 %。這是因?yàn)榉侄嗡饧夹g(shù)通過(guò)簡(jiǎn)單的離心分離，解除了水解產(chǎn)物——纖維二糖和葡萄糖對(duì)反應(yīng)的抑制作用。從表中可以看出，在兩段、三段和四段的分段水解過(guò)程中，第二段的水解得率分別為20.17 %、 20.20 %和17.65 %，8 h的水解得率最大，雖然12 h水解得率與8 h相當(dāng)，但第一段酶解殘?jiān)械臍執(zhí)潜? h多，并且水解時(shí)間長(zhǎng)也影響了纖維素酶的活性，而6 h的水解時(shí)間較短，酶解得率不高；在三段和四段的分段水解過(guò)程中，第三段的水解得率分別為15.94 %和11.79 %，8 h的水解得率大于6 h，6 h的水解時(shí)間不夠。第四段的水解得率為9.24 %，低的水解得率與底物結(jié)構(gòu)和酶活力以及水解時(shí)間有關(guān)。理論上把酶水解過(guò)程進(jìn)行無(wú)限分段后，纖維素將會(huì)被完全水解，如三段(8+8+8 h)比二段(12+12 h)、四段(6+6+6+6 h)比三段(8+8+8 h)能夠得到更多的糖。但是分段越多，水解工藝就越復(fù)雜，操作費(fèi)用也會(huì)相應(yīng)增加，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了三段酶水解技術(shù)。

2.2.3酶解條件對(duì)桑木三段酶水解的影響

2.2.3.1產(chǎn)物抑制的解除對(duì)三段水解反應(yīng)速率的影響在纖維素酶水解過(guò)程中，各種酶組分的活力受其產(chǎn)物的反饋抑制調(diào)節(jié)。纖維素酶三段(8+8+8 h)水解可以達(dá)到一段72 h水解得率，并且反應(yīng)時(shí)間比一段水解縮短了48 h。纖維素酶三段(8+8+8 h)水解過(guò)程中水解得率和酶平均反應(yīng)速率的變化如圖2所示。由圖2可知，在三段水解過(guò)程中，隨著反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的去除，酶反應(yīng)速率呈迅速增加趨勢(shì)。在第一段除去終產(chǎn)物后，纖維素酶反應(yīng)速率從1.25 g/(L·h)(8 h)提高到2.21 g/(L·h)(10 h)，比一段水解的酶反應(yīng)速率1.43 g/(L·h)(12 h)提高了54.55 %；在第二段除去終產(chǎn)物后，18 h纖維素酶反應(yīng)速率為1.54 g/(L·h)，比一段水解18 h的酶反應(yīng)速率0.89 g/(L·h)提高了73 %。以上數(shù)據(jù)表明，纖維素酶分段水解，產(chǎn)物抑制的解除提高了酶水解反應(yīng)的速率，從而改善了纖維素酶各組分協(xié)同降解纖維素的活性，導(dǎo)致了酶水解得率的增加。本研究選擇三段水解，在水解8 h和16 h時(shí)及時(shí)地移走反應(yīng)產(chǎn)物——纖維二糖和葡萄糖，有效地解除了產(chǎn)物抑制作用，使酶水解得率顯著提高。

圖 2　纖維素酶三段水解預(yù)處理桑木的得率 和平均酶反應(yīng)速率Fig. 2　Three-stage enzymatic hydrolysis yield and average reaction rate on pretreated mulberry wood

2.2.3.2纖維素酶用量的影響在底物質(zhì)量濃度100 g/L時(shí)，纖維素酶用量分別為15、 20、 25、 30、 35和40 FPIU/g，以纖維素酶一段水解NaOH-Fenton預(yù)處理桑木作為對(duì)照，酶用量對(duì)桑木一段和三段水解得率的影響如圖3所示。

由圖3 可知，無(wú)論是一段水解還是三段水解，纖維素酶水解得率均隨著酶用量的增加而提高，在底物濃度不變的條件下，酶用量的增加意味著酶與底物接觸的機(jī)會(huì)增加，酶-底物復(fù)合物形成的增加，從而導(dǎo)致更多的纖維素酶吸附到底物上，增加了酶平均反應(yīng)速率。當(dāng)酶用量從15 FPIU/g提高到40 FPIU/g時(shí)，在一段酶水解中，72 h纖維素酶水解得率從55.54 %提高到81.52 %；在三段酶水解中， 24 h纖維素酶水解得率從55.40 %提高到88.08 %。由圖3(a)可以看出，相對(duì)于20～30 FPIU/g范圍，酶用量在30～40 FPIU/g之間，對(duì)纖維素酶一段水解得率的影響變小，說(shuō)明酶用量只是在一定范圍內(nèi)影響纖維素酶水解得率，除了酶用量外，底物中纖維素的聚合度、結(jié)晶度和木質(zhì)素等對(duì)纖維素酶水解得率也有影響。同時(shí)由圖3(b)還可以看出，在三段酶水解過(guò)程中，在第一個(gè)8 h，酶用量對(duì)纖維素酶水解得率的影響不大；而在第二段(8～16 h)和第三段(16～24 h)過(guò)程中，當(dāng)酶用量在30～40 FPIU/g時(shí)，酶水解得率相對(duì)第一段增加更加明顯。酶用量增加到一定程度時(shí)，水解速率增加緩慢，主要是由于纖維表面最初吸附的酶形成單分子層，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)全部被纖維素酶分子飽和后，即使再增加過(guò)量的纖維素酶也起不到提高水解得率的作用[13]。因此，在木質(zhì)纖維原料酶水解過(guò)程中，增加纖維素酶的用量在一定程度上對(duì)水解有利，可以提高水解得率，但當(dāng)纖維素酶量超過(guò)一定量后，對(duì)水解的影響不大，而且過(guò)高的纖維素酶用量將直接導(dǎo)致水解成本的增加。

圖 3　纖維素酶用量對(duì)預(yù)處理桑木水解得率的影響Fig. 3　Effect of enzymatic dosage on hydrolysis yield of pretreated mulberry wood

2.3纖維素酶在預(yù)處理桑木上的吸附研究

為了進(jìn)一步分析水解底物上結(jié)合酶對(duì)分段酶水解的貢獻(xiàn)，建立和分析了Langmuir吸附動(dòng)力學(xué)方程和吸附等溫曲線，以微晶纖維素Avicel做對(duì)比，比較了纖維素酶在NaOH-Fenton試劑預(yù)處理前后的桑木上的吸附情況，以在Avicel上的吸附作為對(duì)照樣，吸附等溫曲線見(jiàn)圖4。大量研究表明，纖維素酶對(duì)纖維素的吸附符合Langmuir等溫吸附方程。結(jié)合圖4中的平衡吸附量計(jì)算得到，纖維素酶在桑木、NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的桑木、Avicel和NaOH-Fenton試劑預(yù)處理Avicel上的最大吸附量Γmax分別為0、 8.08、 20.37和48.48 mg/g，分配系數(shù)R值分別為0、 0.03、 0.219和0.101 L/g。由數(shù)據(jù)可以看出桑木經(jīng)NaOH-Fenton試劑預(yù)處理后，纖維素酶在底物上的最大吸附量得到了增加。這是由于經(jīng)NaOH-Fenton試試劑預(yù)處理后的桑木，去除了半纖維素，并且改變了纖維素的超分子結(jié)構(gòu)，增加了纖維素與纖維素酶的結(jié)合位點(diǎn)。同樣地，以Avicel作為底物，經(jīng)NaOH-Fenton預(yù)處理后的吸附量比原料增加了28.11 mg/g，這說(shuō)明NaOH-Fenton試劑預(yù)處理能夠解聚纖維素，使纖維素結(jié)構(gòu)疏松，從而提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，最終達(dá)到提高桑木酶水解得率的目的。

圖 4　不同底物對(duì)纖維素酶的吸附Fig. 4　Cellulase adsorption on different subtrates

Langmuir常數(shù)K表示纖維素酶與底物之間的相對(duì)親和力，纖維素酶與桑木、NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的桑木之間的常數(shù)K分別為0和3.73 L/g。酶與底物的吸附作用主要受靜電作用和疏水作用的影響，桑木由于復(fù)雜的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)使其無(wú)法輕易和纖維素酶蛋白結(jié)合，故沒(méi)經(jīng)預(yù)處理的桑木難以吸附纖維素酶；經(jīng)NaOH-Fenton試劑預(yù)處理后，破壞桑木中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間的致密結(jié)構(gòu)，暴露出纖維素酶的結(jié)合位點(diǎn)，其中包括纖維素酶與纖維素和木質(zhì)素之間的吸附，因而親和力增加。

3結(jié) 論

3.1采用分段酶水解經(jīng)NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的桑木，通過(guò)移除產(chǎn)物葡萄糖與纖維二糖來(lái)減輕抑制作用，提高桑木的酶水解得率及縮短反應(yīng)時(shí)間。結(jié)果顯示，三段水解(8+8+8 h)過(guò)程中，隨著反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的去除，酶反應(yīng)速率呈迅速增加趨勢(shì)。在第一段除去終產(chǎn)物后，纖維素酶反應(yīng)速率從8 h時(shí)的1.25 g/(L·h)提高到10 h時(shí)的2.21 g/(L·h)；在第二段除去終產(chǎn)物后，18 h纖維素酶反應(yīng)速率為1.54 g/(L·h)，比一段水解18 h的酶反應(yīng)速率0.89 g/(L·h)提高了73 %。

3.2纖維素酶三段水解經(jīng)NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的桑木，水解過(guò)程中，纖維素酶水解得率隨著酶用量的增加而提高，當(dāng)酶用量為40 FPIU/g(以纖維素計(jì))時(shí)，24 h纖維素酶水解得率達(dá)到88.08 %，三段水解充分利用了酶解殘?jiān)系慕Y(jié)合酶進(jìn)行后續(xù)水解。

3.3桑木經(jīng)NaOH-Fenton試劑預(yù)處理后，對(duì)纖維素酶的最大吸附量(Γmax)由未處理前的0增至8.08 mg/g，由此可見(jiàn)，預(yù)處理增加了纖維素酶與桑木間的吸附位點(diǎn)。

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doi:10.3969/j.issn.1673-5854.2016.04.006

收稿日期：2016-01-06

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011FZ137)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31260162)；廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(GXFC13-06)

作者簡(jiǎn)介：王燕云(1991— ),女，江蘇蘇州人，碩士生，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能源；E-mail:1394938725@qq.com *通訊作者：楊 靜(1976— )，女，博士，副教授，主要從事木質(zhì)纖維素的生物降解與轉(zhuǎn)化的研究；E-mail:kmjingyang@163.com。

中圖分類號(hào)：TQ35

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-5854(2016)04-0031-06

Process Resrarch of Multi-stage Enzymatic Hydrolysis of NaOH-Fenton Pretreated Mulberry Wood

WANG Yan-yun1,2, WU Kai1,2, LEI Fu-hou3, YANG Jing1,2

(1. Yunnan Provincial Key Laboratory of Wood Adhesives and Glued Products,Southwest Forestry University, Kunming 650224,China; 2. College of Materials Science and Engineering,Southwest Forestry University, Kunming 650224, China ;3. Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Nanning 530006, China)

Abstruct:During the multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials,the product inhibitions were reduced by the removal of end products at each stage to enhance the hydrolysis efficiency and shorten the hydrolysis time with NaOH-Fenton pretreated mulberry as raw material. During the three-stage (8+8+8 h) hydrolysis,as the enzymatic dosage was 15 FPIU/g(calculated by the mass of cellulose,similarly here in after),enzymatic average reaction rate increased from 1.25 to 2.21 g/(L·h) at the first stage,and after the second stage,it reached 1.54 g/(L·h) and increased rapidly by 73 % comparing with that of unsegmented hydrolysis.When enzymatic dosage was 40 FPIU/g ,the three-stage (8+8+8 h) hydrolysis could reach 88.08 %.Multi-stage hydrolysis made full use of the absorbed cellulase on substrate.The classical Langmuir adsorption isotherm was used tot the cellulase enzyme adsorption on substrates.The adsorption capacity of cellulase on NaOH-Fenton pretreated mulberry was studied with the maximum adsorption capacity of 8.08 mg/g substrate.The adsorbed sites were enhanced in the pretreatment process.

Key words:cellulase;enzymatic hydrolysis;enzymatic reaction rate;cellulose adsorption

·研究報(bào)告——生物質(zhì)化學(xué)品·