白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的純化及酶學(xué)特性

劉 瑋，徐 萌，張雅瑋，周 黎，馬志方，王復(fù)龍，彭增起*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

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白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的純化及酶學(xué)特性

劉 瑋，徐 萌，張雅瑋，周 黎，馬志方，王復(fù)龍，彭增起*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

摘 要：通過(guò)粗分離、50%～80%飽和度硫酸銨分級(jí)沉降、DE-52陰離子交換柱層析等步驟，從白鰱魚(yú)背側(cè)肌中分離純化出焦磷酸酶。通過(guò)變性凝膠電泳分析，該酶在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中僅有一個(gè)分子質(zhì)量為40 kD的條帶。酶學(xué)特性研究表明，白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶可專一性地水解焦磷酸鹽，反應(yīng)初速率時(shí)間范圍為0～15 min，最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最適反應(yīng)pH值為7.5。Mg2+對(duì)該酶有明顯的激活作用，在Mg2+濃度為5 mmol/L時(shí)酶活力最高。5 mmol/L的Ca2+、Zn2+、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用。該酶水解焦磷酸四鈉的最大反應(yīng)速率為0.051 U/mg，米氏常數(shù)為0.54 mmol/L。

關(guān)鍵詞：焦磷酸酶；純化；酶學(xué)特性；背側(cè)?。话做桇~(yú)

引文格式：

劉瑋， 徐萌， 張雅瑋， 等.白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的純化及酶學(xué)特性［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 130-135.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613023. http://www.spkx.net.cn

LIU Wei， XU Meng， ZHANG Yawei， et al.Purification and characterization of pyrophosphatase from dorsal muscle in silver carp （Hypophthalmichthys molitrix）［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 130-135.（in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613023. http://www.spkx.net.cn

焦磷酸鹽是魚(yú)糜制品加工中常用的一種添加劑，通常與其他多聚磷酸鹽復(fù)配使用，具有提高產(chǎn)品保水性的功能［1-4］。其作用機(jī)理類似于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的作用，能夠?qū)⒓?dòng)球蛋白解離成肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，從而提高肌肉蛋白質(zhì)的保水性［5-7］。然而，添加到肌肉中的焦磷酸鹽會(huì)被內(nèi)源水解酶降解，弱化了焦磷酸鹽的功能與作用［8-11］。研究發(fā)現(xiàn)，這種內(nèi)源水解酶是焦磷酸酶（pyrophosphatase，PPase）［12-13］。

Nakamura等［14］首次從兔骨骼肌中提取焦磷酸酶粗酶液，并發(fā)現(xiàn)有酸性焦磷酸酶和中性焦磷酸酶之分，最適pH值分別為5.2和7.4，但沒(méi)有將酶進(jìn)行分離純化。隨后，Morita等［15］純化了兔肉中的中性焦磷酸酶，并進(jìn)行酶學(xué)特性研究。目前，國(guó)內(nèi)已有報(bào)道分別從雞肉、鳙魚(yú)、牛肉和豬肉中分離純化了焦磷酸酶，并研究其生化特性［16-19］。雖然肌肉焦磷酸酶的生化特性有一定的相似性，但是不同的物種之間仍存在較大差異，這將直接導(dǎo)致焦磷酸鹽在不同物種的肌肉中水解情況不同［20］。

白鰱魚(yú)是我國(guó)的一種大宗經(jīng)濟(jì)型淡水魚(yú)類［21-22］，由于白鰱魚(yú)肉土腥味較重［23］，作為鮮魚(yú)銷售的商業(yè)價(jià)值不高，但白鰱魚(yú)肉顏色白嫩，因此常被用作加工魚(yú)糜制品的原料［24-25］。目前，對(duì)于白鰱魚(yú)中的焦磷酸鹽水解酶的分離純化及特性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究以白鰱魚(yú)背側(cè)肌肉為原料對(duì)焦磷酸酶進(jìn)行分離純化，并研究其酶學(xué)特性，對(duì)有效調(diào)控多聚磷酸鹽的水解，優(yōu)化多聚磷酸鹽在魚(yú)糜制品加工中的功能效用有著理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

約1.5 kg新鮮白鰱魚(yú)7 條 南京衛(wèi)崗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。白鰱魚(yú)宰后立即去內(nèi)臟，取出背側(cè)肌，并剔除明顯的魚(yú)刺，冰浴中冷卻0.5 h待用。

焦磷酸四鈉（tetrasodium pyrophosphate，TSPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）、六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，HMP） 美國(guó)Sigma公司；陰離子交換層析填料DE-52纖維素英國(guó)Whatman公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；寬范圍的蛋白質(zhì)Marker （10～250 kD） 美國(guó)Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreito，DTT）、考馬斯亮藍(lán)R250 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waring Blender 8010ES高速度組織勻漿機(jī) 美國(guó)Waring公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；AKTA Prime Plus蛋白低壓層析系統(tǒng) 美國(guó)GE Healthcare公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；蛋白電泳儀及凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸酶（pyrophosphatase，PPase）的分離純化

焦磷酸酶的分離純化參考Gao Ruichang等［17］的方法并稍作修改。取400 g預(yù)冷的白鰱魚(yú)背側(cè)肌切成約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的塊狀物，加入4 倍體積25 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖提取液（含5 mmol/L MgCl2）勻漿1 min，10 000×g離心30 min得上清即為粗酶液。向粗酶液中緩慢攪拌加入研磨后的硫酸銨至50%飽和度，靜置4 h后，10 000×g離心30 min，留取上清并棄去沉淀。向上清液中繼續(xù)攪拌加入硫酸銨至80%飽和度，靜置4 h后，10 000×g離心30 min并取沉淀。用Tris-HCl緩沖提取液溶解后，用提取液充分透析（透析袋的截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 kD）24 h，更換5 次透析液。隨后，用DE-52陰離子交換柱（20 cm×1.6 cm）對(duì)酶進(jìn)行純化，填料DE-52用提取緩沖液浸泡后裝柱，用pH 7.0 A液（25 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT）平衡，上樣5 mL，在穿刺峰出現(xiàn)后，以0～1 mol/L NaCl梯度濃度的B液（1 mol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT）進(jìn)行洗脫，洗脫體積200 mL，收集主要的洗脫峰。測(cè)定蛋白質(zhì)含量和酶活性后，收集純化的酶液，用超濾濃縮管（amicon YM-10超濾膜，截留分子質(zhì)量為10 kD）5 000×g離心濃縮，于－80 ℃保存待用。以上操作在4 ℃條件下進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。12.5%分離膠，4%濃縮膠，樣品進(jìn)入分離膠前電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓為100 V，用考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

DE-52陰離子交換柱層析后的蛋白濃度用Bradford方法［26］測(cè)定，其余步驟的蛋白質(zhì)濃度均用雙縮脲方法［27］測(cè)定。

1.3.3 焦磷酸酶活力測(cè)定

焦磷酸酶活力測(cè)定按照Yamazaki等［28］的方法并稍作修改。向50 μL焦磷酸酶中加入50 μL底物TSPP（含10 mmol/L MgCl2），于45 ℃反應(yīng)15 min后，立即加入35 μL pH 7.0終止液（1.33 g/L SDS、0.12 mol/L EDTA），再加入265 μL顯色劑（0.05 g/L硫酸亞鐵、0.05 g/L鉬酸銨、0.5 mol/L硫酸）顯色，25 ℃水浴15 min，用酶標(biāo)儀在640 nm波長(zhǎng)處比色。對(duì)照組在添加底物TSPP前先加入終止液使酶變性，結(jié)束反應(yīng)后與其他處理組同時(shí)加入底物TSPP和顯色劑。

一個(gè)酶活力單位定義為在pH 7.5、45 ℃條件下，每分鐘得到1 μmol產(chǎn)物Pi所需酶量。

1.3.4 焦磷酸酶的酶學(xué)特性

1.3.4.1 焦磷酸酶的酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線

在pH 7.5、45 ℃條件下，測(cè)定每隔5 min反應(yīng)時(shí)間時(shí)生成的產(chǎn)物Pi的量，以焦磷酸酶酶促反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)制作反應(yīng)進(jìn)程曲線。

1.3.4.2 焦磷酸酶的底物專一性

分別以TSPP、STPP和HMP為底物，在pH 7.5、45 ℃條件下，按照上述方法測(cè)定焦磷酸酶活力并繪制酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線。

1.3.4.3 底物濃度對(duì)焦磷酸酶活力的測(cè)定

在pH 7.5、45 ℃條件下，測(cè)定焦磷酸酶與不同濃度的TSPP（0.5、1、2、3、4、5 mmol/L）反應(yīng)時(shí)的酶活力，將測(cè)得的最大值定為100%。

1.3.4.4 最適反應(yīng)溫度及溫度的穩(wěn)定性

在pH 7.5條件下，分別測(cè)定焦磷酸酶在不同反應(yīng)溫度下（25、35、40、45、55、65 ℃）的酶活力，將測(cè)得的最大值定為100%。此外，將焦磷酸酶在不同溫度下（25、35、40、45、55、65 ℃）水浴1 h，冷卻至4 ℃后，測(cè)定酶活力，將4 ℃放置的焦磷酸酶的活力定為100%。

1.3.4.5 最適反應(yīng)pH值及pH值的穩(wěn)定性

在45 ℃條件下，分別測(cè)定焦磷酸酶在不同pH值的緩沖體系中（檸檬酸-檸檬酸鈉pH 4.0、5.0、6.0、6.5；Tris-HCl pH 7.0、7.5、8.0；甘氨酸-氫氧化鈉 pH 9.0）的酶活力，將測(cè)得的最大值定為100%。此外，4 ℃條件下將焦磷酸酶在不同pH值（4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0）條件下放置1 h，回調(diào)pH值至7.0后，測(cè)定酶活力，將測(cè)得的最大值定為100%。

1.3.4.6 Mg2+、Ca2+、Zn2+對(duì)焦磷酸酶活力的影響

在pH 7.5、45 ℃條件下，測(cè)定添加不同濃度的Mg2+、Ca2+和Zn2+（0、1、5、10、15、20 mmol/L，其中Ca2+和Zn2+中含有最適濃度的Mg2+）對(duì)焦磷酸酶活力的影響，將測(cè)得的最大值定為100%。

1.3.4.7 抑制劑對(duì)焦磷酸酶活力的影響

在pH 7.5、45 ℃條件下，測(cè)定添加不同濃度的EDTA-Na2、EDTA-Na4、KIO3、NaF對(duì)焦磷酸酶活力的影響，將未經(jīng)抑制劑處理的酶活力定為100%。

1.3.4.8 焦磷酸酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

測(cè)定當(dāng)反應(yīng)體系中TSPP終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol/L時(shí)焦磷酸酶的反應(yīng)初速率。按照Lineweaver-Burk Plot雙倒數(shù)法作圖，得出最大反應(yīng)速率vmax和米氏常數(shù)Km。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)測(cè)定3 次。采用Origin 8.0軟件分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的分離純化

從白鰱魚(yú)背側(cè)肌中提取的焦磷酸酶粗酶液，經(jīng)初步分離、50%～80%硫酸銨分級(jí)沉降、DE-52陰離子交換柱層析等步驟得到純化，純化結(jié)果見(jiàn)表1。其中，層析洗脫曲線見(jiàn)圖1，在用NaCl溶液梯度洗脫之前，出現(xiàn)了一個(gè)蛋白穿刺峰（峰Ⅰ），這是一些沒(méi)有與柱子結(jié)合的蛋白組分。開(kāi)始梯度洗脫后，在NaCl濃度約為0.18～0.40 mol/L的范圍和0.40～0.60 mol/L的范圍中出現(xiàn)了兩個(gè)洗脫峰（峰Ⅱ、Ⅲ），對(duì)相應(yīng)的收集管內(nèi)的蛋白組分進(jìn)行酶活力測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)第22、23、24、25、26管的酶活力較高，其余管的酶活力較低，峰Ⅲ中的蛋白組分幾乎沒(méi)有焦磷酸酶活力。因此，焦磷酸酶的活力成分主要為0.24～0.37 mol/L的NaCl洗脫出來(lái)的蛋白質(zhì)組分。

表 1 白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的分離純化Table 1 Purification of PPasefrom silver carpdorsalmuscle分離純化步驟 酶總活力/U總蛋白質(zhì)量/mg酶比活力/ （U/mg）純化倍數(shù)酶活力回收率/%粗酶液 8 184.27 19 373.08 0.42 1.00 100.00硫酸銨分級(jí)沉降、透析 5 871.09 11 276.86 0.52 1.23 71.74 DE-52陰離子交換柱層析 1 032.26 381.00 2.71 6.41 12.61

將粗分離、硫酸銨分級(jí)沉降和層析等主要純化步驟分別得到的焦磷酸酶樣品用SDS-PAGE測(cè)定，從圖2 SDS-PAGE圖譜中可見(jiàn)，經(jīng)層析純化后的焦磷酸酶只在40 kD有一個(gè)條帶。該結(jié)果表明，分離純化后的焦磷酸酶不含雜質(zhì)蛋白。

2.2 焦磷酸酶的酶學(xué)特性

2.2.1 焦磷酸酶的酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線

在酶活力測(cè)定中，合理地選擇酶促反應(yīng)時(shí)間是研究酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的必要前提［16］。由圖3可知，在15 min時(shí)間范圍內(nèi)，焦磷酸酶酶促反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物Pi含量與反應(yīng)時(shí)間幾乎成正比。當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至20 min，酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線雖呈上升趨勢(shì)，但曲線的斜率不斷降低，說(shuō)明反應(yīng)的速率逐漸變慢。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，不再有更多的Pi生成，反應(yīng)趨于平穩(wěn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在0～15 min的初速率時(shí)間范圍內(nèi)測(cè)定白鰱魚(yú)焦磷酸酶活力，這短于雞肉和牛肉的焦磷酸酶的初速率時(shí)間范圍（0～25 min）［16，18］。

2.2.2 焦磷酸酶的底物專一性

由圖4可知，以STPP和HMP為反應(yīng)底物時(shí)，在30 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，二者被水解生成的產(chǎn)物Pi的含量很少。而白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶對(duì)底物TSPP有著較強(qiáng)的水解能力，使得反應(yīng)產(chǎn)物Pi大量生成。因此，白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶對(duì)TSPP的底物專一性較強(qiáng)，這與前人的研究結(jié)果一致，雞胸大肌、牛半腱肌、豬背最長(zhǎng)肌中的焦磷酸酶都能專一性地水解底物焦磷酸鹽［16，18，29］。

2.2.3 底物濃度對(duì)焦磷酸酶活性的影響

由圖5可知，在底物TSPP濃度較低的條件下（0.5～2 mmol/L），隨著底物濃度的增加，白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的活力不斷增加，在TSPP濃度為2～3 mmol/L時(shí)，焦磷酸酶的活力最高，而鳙魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的活力在底物濃度為5 mmol/L達(dá)到最大［17］。當(dāng)TSPP濃度超過(guò)3 mmol/L時(shí)，白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的活力開(kāi)始降低，當(dāng)TSPP濃度為5 mmol/L時(shí)，焦磷酸酶活力僅為最高酶活力的67%左右，可見(jiàn)高濃度的底物可以抑制酶活力，這一趨勢(shì)與靳紅果等［29］的關(guān)于豬肉焦磷酸酶的研究一致。其原因可能是大量的TSPP與Mg2+結(jié)合［17］，導(dǎo)致Mg2+激活焦磷酸酶的能力下降。

2.2.4 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

由圖6可知，白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的最適溫度為45 ℃左右，低于豬肉、鳙魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶（50 ℃）和牛肉焦磷酸酶（47 ℃），高于雞肉焦磷酸酶（40 ℃）［16-19］。25 ℃條件下，焦磷酸酶的相對(duì)酶活力為55.4%。在25～45 ℃的溫度范圍內(nèi)，焦磷酸酶的活力隨著溫度的升高而不斷變大，單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物與酶的有效碰撞次數(shù)增加［30］。當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，焦磷酸酶活力又逐漸下降。在65 ℃時(shí)，焦磷酸酶活力僅剩余42.9%。該酶的熱穩(wěn)定性隨處理溫度的升高呈劇烈下降的趨勢(shì)，45 ℃時(shí)其活力降至58.7%，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃以上，焦磷酸酶幾乎完全失活，這說(shuō)明高溫會(huì)使酶發(fā)生熱變性，對(duì)酶活力有強(qiáng)烈的抑制作用。

2.2.5 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

由圖7可知，白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶最適反應(yīng)pH值為7.5，稍低于鳙魚(yú)的焦磷酸酶（pH 8.0）［17］。該酶在pH 4.0～6.0的范圍內(nèi)幾乎沒(méi)有水解活性，在pH 6.5～9.0范圍內(nèi)酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。焦磷酸酶對(duì)pH值的依賴性比較強(qiáng)。在中性范圍內(nèi)（pH 7.0左右）保持較高的穩(wěn)定性，在pH 4.0～6.5的范圍內(nèi)幾乎完全失活。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的條件下，由于電荷的排斥作用和離子鍵的減少會(huì)導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而使酶失去活力［30］。由此可見(jiàn)該酶為中性焦磷酸酶，在肌肉中起主要水解焦磷酸鹽作用的酶也是中性焦磷酸酶［14］。

2.2.6 Mg2+、Ca2+、Zn2+對(duì)焦磷酸酶活性的影響

由圖8可知，適當(dāng)濃度的Mg2+對(duì)焦磷酸酶有較強(qiáng)的激活作用，這與前人研究一致［16-19］。Leone等［31］報(bào)道，這一激活作用可能是由于Mg2+引發(fā)焦磷酸酶的構(gòu)象發(fā)生改變，提高了酶的活力。當(dāng)未添加Mg2+時(shí)，焦磷酸酶相對(duì)活力很低（2.0%左右）。而隨著Mg2+濃度不斷增加，焦磷酸酶的活力迅速提高，當(dāng)Mg2+濃度達(dá)到5 mmol/L時(shí)酶活力最高。在Mg2+濃度高于5 mmol/L后，酶活力有所下降，但基本保持在80%以上，因此5 mmol/L為最適Mg2+濃度。而Ca2+和Zn2+則對(duì)焦磷酸酶有著強(qiáng)烈的抑制作用。當(dāng)分別添加1 mmol/L的Ca2+和Zn2+后，焦磷酸酶的酶活力迅速下降，其相對(duì)酶活力分別為11.4%和5.4%。而當(dāng)Ca2+和Zn2+濃度繼續(xù)增加，該酶幾乎完全失活。

2.2.7 抑制劑對(duì)焦磷酸酶活性的影響

抑制劑對(duì)白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶活性的影響如表2所示，EDTA-Na2和EDTA-Na4對(duì)焦磷酸酶有強(qiáng)烈的抑制作用，分別向反應(yīng)體系添加1 mmol/L的EDTA-Na2和EDTA-Na4后，焦磷酸酶的殘留活力僅為14.5%和7.9%，而當(dāng)5 mmol/L的EDTA-Na2和EDTA-Na4存在時(shí)，該酶幾乎完全失去活性。Li Rongrong等［9］將100 g/kg的EDTA-Na2與雞胸肉斬拌勻漿發(fā)現(xiàn)，TSPP的含量在48 h內(nèi)沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明適當(dāng)濃度的EDTA-Na2可以有效地抑制TSPP被焦磷酸酶水解。此外，KIO3和NaF也對(duì)焦磷酸酶的活力有抑制作用。5 mmol/L的KIO3存在時(shí)，焦磷酸酶相對(duì)酶活力僅為9.2%，低濃度（1 mmol/L）的NaF幾乎完全抑制該酶的活力，這與靳紅果等［29］的研究結(jié)果一致。

表 2 抑制劑對(duì)白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶活性的影響Table 2 Effect ofinhibitorson the activityof PPase from silvercarpdorsalmuscle抑制劑 濃度/（mmol/L） 相對(duì)酶活力/% 無(wú)0 100.00±4.50 EDTA-Na21 14.50±2.99 5 0.63±1.25 EDTA-Na41 7.94±2.87 5 0.69±1.21 KIO31 24.63±2.02 5 9.19±0.50 NaF 1 2.25±1.50

2.2.8 焦磷酸酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

由圖9可知，白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的最大反應(yīng)速率vmax為0.051 U/mg，米氏常數(shù)Km值為0.54 mmol/L。豬肉焦磷酸酶的Km值為0.36 mmol/L，鳙魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的Km值為1.98 mmol/L，這表明白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶有較強(qiáng)的底物親和力。

3 結(jié) 論

純化的白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的SDS-PAGE圖譜中只有一個(gè)40 kD的條帶。白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶專一性水解焦磷酸鹽，vmax為0.051 U/mg，Km為0.54 mmol/L，不能水解三聚磷酸鹽和六偏磷酸鹽；其反應(yīng)初速率時(shí)間范圍為0～15 min。該酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最適反應(yīng)pH值為7.5，且在25～40 ℃之間及中性范圍（pH 7.0左右）保持較高的穩(wěn)定性。Mg2+能明顯激活白鰱魚(yú)背側(cè)肌焦磷酸酶的活力，在5 mmol/L時(shí)酶活力達(dá)到最大值；而5 mmol/L的Ca2+、Zn2+、EDTA-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均會(huì)強(qiáng)烈的抑制該酶的活力。因此，當(dāng)多聚磷酸鹽應(yīng)用于魚(yú)糜及魚(yú)糜制品加工時(shí)，維持低溫、非中性條件，或添加一定量的Ca2+、Zn2+、EDTA-Na2等物質(zhì)，可以有效地抑制焦磷酸酶活性、減緩焦磷酸鹽的水解，使多聚磷酸鹽發(fā)揮持久高效的作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ LEE C M， TOLEDO R T.Factors affecting textural characteristics of cooked comminuted fish muscle［J］.Journal of Food Science， 1976，41（2）: 391-397.DOI:10.1111/j.1365-2621.1976.tb00627.x.

［2］ JOHNSEN S O， J?RGENSEN K B， BIRKELAND S， et al.Effects of phosphates and salt in ground raw and cooked farmed cod （Gadus morhua） muscle studied by the water holding capacity （WHC）， and supported by31P-NMR measurements［J］.Journal of Food Science，2009， 74（3）: C211-C220.DOI:10.1111/j.1750-3841.2009.01086.x.

［3］ WEISS J， GIBIS M， SCHUH V， et al.Advances in ingredient and processing systems for meat and meat products［J］.Meat Science，2010， 86（1）: 196-213.DOI:10.1016/j.meatsci.2010.05.008.

［4］ KULAKOVSKAYA T V， VAGABOV V M， KULAEV I S.Inorganic polyphosphate in industry， agriculture and medicine: modern state and outlook［J］.Process Biochemistry， 2012， 47（1）: 1-10.DOI:10.1016/ j.procbio.2011.10.028.

［5］ NAUSS K M， KITAGAWA S， GERGELY J.Pyrophosphate binding to and adenosine triphosphatase activity of myosin and its proteolytic fragments implications for the substructure of myosin［J］.Journal of Biological Chemistry， 1969， 244（3）: 755-765.

［6］ XIONG Y L， LOU X， WANG C， et al.Protein extraction from chicken myofibrils irrigated with various polyphosphate and NaCl solutions［J］.Journal of Food Science， 2000， 65（1）: 96-100.DOI:10.1111/j.1365-2621.2000.tb15962.x.

［7］ XIONG Y L.Role of myofibrillar proteins in water-binding in brineenhanced meats［J］.Food Research International， 2005， 38（3）: 281-287.DOI:10.1016/j.foodres.2004.03.013.

［8］ BELTON P S， PACKER K J， SOUTHON T E.31P NMR studies of the hydrolysis of added phosphates in chicken meat［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture， 1987， 40（3）: 283-291.DOI:10.1002/ jsfa.2740400311.

［9］ LI R R， KERR W L， TOLEDO R T， et al.31P NMR analysis of chicken breast meat vacuum tumbled with NaCl and various phosphates［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture， 2001， 81（6）: 576-582.DOI:10.1002/jsfa.846.

［10］ 彭增起， 周光宏， 徐幸蓮， 等.四種多聚磷酸鈉在雞胸肉中水解的31P核磁共振研究［J］.食品科學(xué)， 2005， 26（8）: 61-65.DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2005.08.008.

［11］ PARK J W.Surimi and surimi seafood［M］.3rd ed.Boca Raton: CRC Press， 2013: 485-487.

［12］ YASUI T， FUKAZAWA T， TAKAHASHI K， et al.Phosphate effects on meat， specific interaction of inorganic polyphosphates with myosin B［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1964， 12（5）: 399-404.DOI:10.1021/jf60135a003.

［13］ SUTTON A H.The hydrolysis of sodium triphosphate in cod and beef muscle［J］.International Journal of Food Science and Technology，1973， 8（2）: 185-195.DOI:10.1111/j.1365-2621.1973.tb01705.x.

［14］ NAKAMURA S， YAMAGUCHI M.Muscle pyrophosphatases［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1969， 17（3）: 633-638.DOI:10.1021/jf60163a018.

［15］ MORITA J， YASUI T.Purification and some properties of a neutral muscle pyrophosphatase［J］.Journal of Biochemistry， 1978， 83（3）: 719-726.

［16］ 姚蕊， 彭增起， 周光宏， 等.雞胸大肌中焦磷酸酶的分離純化及特性研究［J］.食品科學(xué)， 2007， 28（7）: 299-304.DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.07.070.

［17］ GAO R C， XUE C H， YUAN L， et al.Purification and characterization of pyrophosphatase from bighead carp （Aristichthys nobilis）［J］.LWTFood Science and Technology， 2008， 41（2）: 254-261.DOI:10.1016/ j.lwt.2007.02.006.

［18］ 孫珍珍， 彭增起， 靳紅果， 等.牛肉半腱肌中焦磷酸酶的分離純化及特性研究［J］.食品科學(xué)， 2010， 31（5）: 160-164.

［19］ 靳紅果， 萬(wàn)可慧， 田銳花， 等.豬背最長(zhǎng)肌焦磷酸酶的分離純化與酶學(xué)特性［J］.食品科學(xué)， 2012， 33（3）: 168-173.

［20］ 石金明， 靳紅果， 彭增起， 等.肌肉焦磷酸酶和三聚磷酸酶的特性與應(yīng)用［J］.肉類研究， 2011， 25（11）: 47-49.DOI:10.3969/ j.issn.1001-8123.2011.11.012.

［21］ FAN W J， SUN J X， CHEN Y C， et al.Effects of chitosan coating on quality and shelf life of silver carp during frozen storage［J］.Food Chemistry， 2009， 115（1）: 66-70.DOI:10.1016/j.foodchem.2008.11.060.

［22］ GUO W J， TONG J G， YU X M， et al.A second generation genetic linkage map for silver carp （Hypophthalmichethys molitrix） using microsatellite markers［J］.Aquaculture， 2013， 412（6）: 97-106.DOI:10.1016/j.aquaculture.2013.06.027.

［23］ YUAN C， FUKUDA Y， KANENIWA M， et al.Comparison of gelforming properties of silver carp （Hypophthalmichthys molitrix） surimi prepared in different seasons［J］.Journal of Food Science， 2005， 70（5）: C326-C331.DOI:10.1111/j.1365-2621.2005.tb09961.x.

［24］ BARRERA A M， RAMIREZ J A， GONZáLEZ-CABRIALES J J，et al.Effect of pectins on the gelling properties of surimi from silver carp［J］.Food Hydrocolloids， 2002， 16（5）: 441-447.DOI:10.1016/ S0268-005X（01）00121-7.

［25］ LUO Y K， SHEN H X， PAN D D， et al.Gel properties of surimi from silver carp （Hypophthalmichthys molitrix） as affected by heat treatment and soy protein isolate［J］.Food Hydrocolloids， 2008， 22（8）: 1513-1519.DOI:10.1016/j.foodhyd.2007.10.003.

［26］ BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Analytical Biochemistry， 1976， 72（72）: 248-254.DOI:10.1006/abio.1976.9999.

［27］ GORNALL A G， BARDAWILL C J， DAVID M M.Determination of serum proteins by means of the biuret reaction［J］.Journal of Biological Chemistry， 1949， 177（2）: 751-766.

［28］ YAMAZAKI M， SHEN Q W， SWARTZ D R.Tripolyphosphate hydrolysis by bovine fast and slow myosin subfragment 1 isoforms［J］.Meat Science， 2010， 85（3）: 446-452.DOI:10.1016/ j.meatsci.2010.02.014.

［29］ 靳紅果.豬肉多聚磷酸酶調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)凝膠特性的研究［D］.南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011: 31-51.

［30］ 高瑞昌.鳙中多聚磷酸鹽水解機(jī)理及無(wú)磷保水劑的研究［D］.青島:中國(guó)海洋大學(xué)， 2007: 73-85.DOI:10.7666/d.y1112232.

［31］ LEONE F A， REZENDE L A， CIANCAGLINI P， et al.Allosteric modulation of pyrophosphatase activity of rat osseous plate alkaline phosphatase by magnesium ions［J］.International Journal of Biochemistry and Cell Biology， 1998， 30（1）: 89-97.DOI:10.1016/ S1357-2725（97）00077-0.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613023

中圖分類號(hào)：TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0130-06

收稿日期：2015-10-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271898）

作者簡(jiǎn)介：劉瑋（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿庵破芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：2013108012@njau.edu.cn

*通信作者：彭增起（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：zqpeng@njau.edu.cn

Purification and Characterization of Pyrophosphatase from Dorsal Muscle in Silver Carp （Hypophthalmichthys molitrix）

LIU Wei， XU Meng， ZHANG Yawei， ZHOU Li， MA Zhifang， WANG Fulong， PENG Zengqi*
（Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition， College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract:Pyrophosphatase （PPase） was extracted and purified from silver carp （Hypophthalmichthys molitrix） dorsal muscle by crude extraction， 50%-80% saturated ammonium sulfate precipitation and DE-52 anion exchange column chromatography.The purified enzyme migrated as a single band with a molecular mass of 40 kD on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）.The enzymatic characterization showed that the purified enzyme could hydrolyze pyrophosphates， and the time range for its initial velocity was 0-15 min.The optimum temperature for the purified PPase was 45 ℃ and the optimum pH was 7.5.Mg2+was necessary for PPase activation and the activity reached up to the maximum value at Mg2+concentration of 5 mmol/L.The activity of PPase was strongly inhibited by 5 mmol/L Ca2+， Zn2+，EDTA-Na2， EDTA-Na4， KIO3or 1 mmol/L NaF.The kinetic constants vmaxand Kmof the purified PPase for tetrasodium pyrophosphate as substrate were 0.051 U/mg and 0.54 mmol/L， respectively.

Key words:pyrophosphatase； purification； enzymatic characterization； dorsal muscle； silver carp