8-溴-7-甲氧基白楊素抑制肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞管結(jié)構(gòu)形成

崔迎紅，孫姝雯，鄒　輝，任凱群，鄭　郁，全梅芳，宋振威，李　朵，曹建國

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長沙　410013)

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8-溴-7-甲氧基白楊素抑制肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞管結(jié)構(gòu)形成

崔迎紅，孫姝雯，鄒輝，任凱群，鄭郁，全梅芳，宋振威，李朵，曹建國

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長沙410013)

研究表明，80%的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是由于肝纖維化和炎癥引起的[1]。肝星狀細(xì)胞可被肝損傷等激活為肌成纖維細(xì)胞樣表型，活化的肝星狀細(xì)胞可參與腫瘤微環(huán)境的形成[2]；腫瘤血管生成與腫瘤微環(huán)境的形成有密切關(guān)系[3]。先前的研究證明，8-溴-7-甲氧基白楊素(8-bromo-7-methoxychrysin, BrMC)具有靶向抑制肝癌干細(xì)胞作用[4-5]。本文旨在研究BrMC是否可以抑制肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞管結(jié)構(gòu)形成，并探討其作用機(jī)制是否涉及抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子-3(signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)激活。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑 BrMC 根據(jù)文獻(xiàn)[6]合成，用二甲基亞砜(DMSO)稀釋，母液濃度為10 mmol·L-1；鼠抗人α-肌動蛋白(α-SMA) -Cy3單克隆抗體購于美國Sigma-Aldrich 公司；兔抗人成纖維細(xì)胞激活蛋白-α(FAP-α)、p-STAT3和STAT3多克隆抗體均購于美國Abcam公司。

1.2細(xì)胞與成球培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞系(LX-2)購于上海博谷生物技術(shù)有限公司，人肝癌SMMC-7721細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細(xì)胞系購于中國上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。3種細(xì)胞系均用含胎牛血清和青、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行成球培養(yǎng)，取第3代球形成細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3條件培養(yǎng)基的獲取取第3代干樣細(xì)胞，用BrMC(0.0、5.0、10.0、20.0 μmol·L-1)處理24 h，參照文獻(xiàn)[7]方法，獲得SMMC-7721肝癌干樣細(xì)胞條件培養(yǎng)基(LCSLC-CM)。取LX-2細(xì)胞，用LCSLC-CM處理24 h后，采用同樣的方法獲得肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基(LCAHSC-CM)。

1.4免疫熒光和免疫印跡實驗取LX-2及肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞，按文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行免疫熒光實驗，檢測α-SMA和FAP-α表達(dá)；提取各組細(xì)胞總蛋白，按文獻(xiàn)[5]方法，采用抗α-SMA、FAP-α、p-STAT3和STAT3抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。

1.5內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成試驗采用LCAHSC-CM進(jìn)行內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成試驗。操作步驟參照文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。管結(jié)構(gòu)形成效率按照以下公式計算：管結(jié)構(gòu)形成率/%=各相應(yīng)處理組管結(jié)構(gòu)均數(shù)/完全培養(yǎng)基處理組管結(jié)構(gòu)均數(shù)×100%。

2　結(jié)果

2.1肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞的鑒定體外單層貼壁生長的肝星狀細(xì)胞呈星形或梭型，表達(dá)α-SMA，弱表達(dá)FAP-α蛋白；LCSLC-CM處理的肝星狀細(xì)胞(肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞)偽足增加，表達(dá)α-SMA，但FAP-α蛋白表達(dá)明顯增加。免疫印跡也得到了相似的結(jié)果(P<0.05)。

2.2BrMC抑制LCAHSC-CM誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細(xì)胞管結(jié)構(gòu)形成LCAHSC-CM 孵育人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細(xì)胞，其內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)明顯多于肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基對照組。BrMC處理后，LCAHSC-CM對血管形成的促進(jìn)作用明顯減弱，并且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3BrMC抑制肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞STAT3蛋白磷酸化結(jié)果顯示，與未處理的體外單側(cè)貼壁生長肝星狀細(xì)胞相比，LCSLC-CM處理的肝星狀細(xì)胞STAT3磷酸化蛋白高表達(dá)，BrMC處理降低STAT3磷酸化水平，呈劑量依賴性。結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

肝星狀細(xì)胞在肝損傷中被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞?；罨母涡菭罴?xì)胞及其周圍纖維化微環(huán)境可產(chǎn)生促進(jìn)HCC進(jìn)程作用[2]。另外大量研究證明肝癌干細(xì)胞是HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)[7]，LCSLC-CM處理的肝星狀細(xì)胞高表達(dá)FAP-α和α-SMA，說明SMMC-7721源性肝癌干樣細(xì)胞可以激活肝星狀細(xì)胞，使之呈肝癌相關(guān)成纖維細(xì)胞表型。

腫瘤血管生成對HCC發(fā)展進(jìn)程起重要作用。Qu等[11]證明肝癌細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞相互作用可以誘導(dǎo)肝癌血管生成。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LCAHSC-CM可以促進(jìn)HUVEC-12細(xì)胞內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成，并且這一作用可被新型白楊素衍生物BrMC劑量依賴性抑制。同時，我們發(fā)現(xiàn)BrMC也可以降低肝癌相關(guān)星狀細(xì)胞STAT3磷酸化水平。

總之，我們的研究結(jié)果證明，肝癌干樣細(xì)胞可以活化肝星狀細(xì)胞，激活的肝星狀細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤血管生成；并且這一作用可被BrMC通過抑制STAT3激活而減弱。因此，本研究的數(shù)據(jù)為BrMC通過抑制肝癌干樣細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞之間的交互作用，抑制HCC血管生成作用提供了實驗證據(jù)。

(致謝:本研究在湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗中心完成。感謝導(dǎo)師曹建國教授的悉心指導(dǎo)！感謝孫姝雯師姐以及鄒輝老師等人的幫助！)

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8-bromo-7-methoxychrysin inhibits tube formation of endothelial cells induced by liver cancer-associated stellate cells

CUI Ying-hong, SUN Shu-wen, ZOU Hui, REN Kai-qun, ZHENG Yu, QUAN Mei-fang, SONG Zhen-wei, LI Duo, CAO Jian-guo

(DeptPharmaceuticalScience,MedicalCollege,HunanNormalUniversity,Changsha410013,China)

SMMC-7721干樣細(xì)胞；肝癌星狀細(xì)胞；BrMC；STAT3；內(nèi)皮細(xì)胞；管結(jié)構(gòu)形成

SMMC-7721 stem-like cells; liver cancer-associated stellate cells; BrMC; STAT3; endothelial cells; tube formation

2016-01-26,

2016-04-17

國家自然科學(xué)基金面上項目(No 81172375)；國家自然科學(xué)青年基金項目(No 30760248)

崔迎紅(1992-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail:599085292@qq.com;曹建國(1956-)，男，博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 0731-88912434; E-mail: caojianguo2005@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.029

A文章編號：1001-1978(2016)07-1035-02

R322.47；R329.24；R735.7；R916.4

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.058.html