益生菌對大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

梁　惠，呂　銳，傅　泳，周治彤，劉　穎，周曉彬，王文成，劉　曼，馬愛國

(1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所，山東 青島　266021；2. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，山東 青島　266071；3. 江南大學(xué)食品科學(xué)與工程，江蘇 無錫　214122；4. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實驗室，山東 青島　266071；5. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)和衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，山東 青島　266021 )

?

益生菌對大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

梁惠1，呂銳2，傅泳1，周治彤3，劉穎4，周曉彬5，王文成1，劉曼1，馬愛國1

(1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所，山東 青島266021；2. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，山東 青島266071；3. 江南大學(xué)食品科學(xué)與工程，江蘇 無錫214122；4. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實驗室，山東 青島266071；5. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)和衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，山東 青島266021 )

目的探討益生菌對大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。方法建立酒精性肝損傷模型，同時以碧悠益生菌發(fā)酵乳5×108CFU·kg-1·d-1灌胃干預(yù)，持續(xù)8周。HE染色觀察各組大鼠肝組織病理學(xué)改變；透射電鏡觀察肝及小腸組織超微結(jié)構(gòu)變化；酶法檢測血清轉(zhuǎn)氨酶及ALP活力；ELISA法檢測血清DAO和D-LA水平；免疫組化法檢測小腸組織FOXO4表達(dá)情況；16S rDNA高通量測序進(jìn)行糞便腸道菌群結(jié)構(gòu)分子生態(tài)學(xué)分析。結(jié)果益生菌干預(yù)使酒精誘導(dǎo)的肝脂肪變性得到明顯緩解，肝及小腸組織超微結(jié)構(gòu)亦得到不同程度改善，其病理學(xué)評分明顯降低(P<0.05)；同時，血清ALT、AST、ALP、DAO和D-LA水平均明顯下降，小腸FOXO4表達(dá)明顯提高(P<0.05)。益生菌干預(yù)在腸道菌群菌門、菌屬水平均較酒精模型組有不同程度改變，豐度最高的前20個菌屬與正常對照組一致率達(dá)到90%，對恢復(fù)腸道菌群多樣性及豐度正常狀態(tài)具有一定調(diào)節(jié)作用。結(jié)論益生菌對大鼠酒精性肝損傷具有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與益生菌糾正腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，修復(fù)腸道屏障功能，改善腸道內(nèi)環(huán)境有關(guān)。

益生菌；酒精性肝損傷；腸道屏障功能；腸道菌群；16S rDNA高通量測序；分子生態(tài)學(xué)

長期過量酒精攝入可導(dǎo)致肝功能異常和肝纖維化，而“肝腸軸”的存在，使腸道微生態(tài)紊亂及腸道屏障功能破壞成為酒精性肝損傷重要發(fā)病機(jī)制之一[1-2]。益生菌制劑是一類能促進(jìn)腸道菌群生態(tài)平衡，對宿主健康有益的活體微生物制劑。1994年，Nanji[3]等首先發(fā)現(xiàn)乳酸菌Lactobacillus GG干預(yù)能夠緩解酒精灌胃大鼠內(nèi)毒素血癥和肝損傷。此后，越來越多的證據(jù)表明，補(bǔ)充益生菌對酒精性損傷具有明顯改善作用[4-5]。但目前從腸道菌群結(jié)構(gòu)分子生態(tài)學(xué)角度系統(tǒng)探討益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群，改善酒精性肝損傷作用機(jī)制研究鮮有報道。本實驗以碧悠益生菌發(fā)酵乳為干預(yù)物，觀察其對大鼠酒精性肝損傷改善效果，同時采用Illumina宏基因組高通量測序技術(shù)[6]對腸道菌群16S rDNA進(jìn)行測序分析，系統(tǒng)探討益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群，改善酒精性肝損傷分子生態(tài)學(xué)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器碧悠益生菌發(fā)酵乳，包含嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌及乳雙歧桿菌，其含量為1×1011CFU·L-1，由達(dá)能乳品銷售(上海)有限公司提供；兔抗FOXO4多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAO、D-LA ELISA檢測試劑盒(上海迪奧生物科技有限公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(QIAgen)。腸道菌群基因組DNA樣品16S rDNA高通量測序，委托上海生工生物工程股份有限公司完成。JEM1200EX透射電鏡(JEOL)；BioPhotometer plus6132型核酸蛋白檢測儀(Eppendorf)。

1.2動物模型建立及分組SPF級♂ Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，青島市藥品檢驗所提供，動物合格證號：SCXK(魯)20090007。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組。正常對照組給予生理鹽水灌胃，持續(xù)8周；酒精模型組給予56°紅星二鍋頭灌胃，5.5 mL·kg-1·d-11周+7.5 mL·kg-1·d-11周+8.0 mL·kg-1·d-11周+9.0 mL·kg-1·d-11周+11 mL·kg-1·d-14周；益生菌干預(yù)組給予5×108CFU·kg-1·d-1灌胃，1 h后給予56°紅星二鍋頭灌胃，劑量同酒精模型組，持續(xù)8周。末次灌胃后，采用代謝籠收集各組大鼠糞便各3～5粒，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。腹主動脈取血，摘取肝及小腸組織用于后續(xù)實驗。

1.3肝組織病理學(xué)觀察取肝組織(0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm)，體積分?jǐn)?shù)為0.1的中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4肝臟及小腸組織超微結(jié)構(gòu)觀察將肝臟及腸組織(1 mm3)分別于體積分?jǐn)?shù)為0.025的戊二醛固定4 h，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗，體積分?jǐn)?shù)為0.01的鋨酸固定1 h。磷酸緩沖液漂洗，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，50～70 nm厚度切片，體積分?jǐn)?shù)為0.03的醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5肝臟功能血清學(xué)指標(biāo)檢測采用賴氏法檢測各組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力，采用微量酶標(biāo)法檢測血清堿性磷酸酶(ALP)活力，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6腸黏膜屏障功能血清學(xué)指標(biāo)檢測采用ELISA實驗檢測血清二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸(D-LA)水平，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7免疫組化實驗檢測小腸組織中FOXO4表達(dá)按照免疫組化SP試劑盒說明書對小腸組織切片進(jìn)行免疫組化染色。每組切片隨機(jī)選取50個視野，采用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)，于光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織中叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4(FOXO4)表達(dá)情況。對所測定組織的背底進(jìn)行光密度值(OD)檢測，定出標(biāo)準(zhǔn)作為參考值；通過手動選擇陽性細(xì)胞及陽性區(qū)域，計算機(jī)數(shù)據(jù)自動統(tǒng)計系統(tǒng)計算出所測細(xì)胞平均光密度值。FOXO4表達(dá)陽性細(xì)胞以細(xì)胞核染色出現(xiàn)棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)，OD值越大，表明FOXO4陽性表達(dá)越強(qiáng)。

1.8糞便腸道菌群16S rDNA高通量測序稱取100 mg糞便樣品，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒獲得腸道菌群基因組DNA，將濃度及純度檢測合格的DNA樣品送至上海生工生物工程股份有限公司，對16S rDNA V3～V4區(qū)域進(jìn)行高通量測序，測序平臺為Illumina Miseq 2×300，引物為341F，805R。使用Qiime、Muscle 3.8.31、MEGAN 5.7.1、RDP classifier、fasttree 2.1.3等多種軟件對測序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的腸道菌群結(jié)構(gòu)分子生態(tài)學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1益生菌干預(yù)對大鼠肝臟組織病理學(xué)改變的影響結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索呈放射狀排列，肝細(xì)胞亦無明顯脂肪變性。酒精模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)明顯脂肪變性，胞質(zhì)空泡化，可見炎性細(xì)胞浸潤和壞死，其病理學(xué)評分較正常對照組明顯升高(P<0.05)。益生菌干預(yù)組大鼠肝臟脂肪變性較酒精模型組明顯得到改善，肝索排列較為整齊，組織結(jié)構(gòu)趨向正常，肝臟病理學(xué)評分較酒精模型組明顯降低(P<0.05)。見Tab 1，F(xiàn)ig 1。

2.2益生菌干預(yù)對大鼠肝臟組織超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果顯示，正常對照組肝細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核膜完整，核仁清晰，線粒體形態(tài)正常，嵴結(jié)構(gòu)清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，核糖體豐富，少見脂滴。酒精模型組肝細(xì)胞核呈不規(guī)則形，核膜不規(guī)則或模糊，脂滴增多。線粒體腫脹變形，嵴結(jié)構(gòu)模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹斷裂，排列紊亂。益生菌干預(yù)組肝細(xì)胞核形態(tài)趨于正常，核膜完整，胞質(zhì)脂滴數(shù)量減少，線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，病變明顯減輕，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)退化與排列紊亂程度有所改善。見Fig 2。

Tab 1　Effect of probiotics on pathological observation of liver tissue in ±s)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsalcohol group

Fig 1　Pathological observation of liver tissue by HE staining in rats(×400)

A：Control;B:Alcohol;C:Probiotics

Fig 2　Transmission electron microscopy of liver in rats

A：Control;B:Alcohol;C:Probiotics

2.3益生菌干預(yù)對大鼠小腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果顯示，正常對照組小腸上皮柱狀細(xì)胞排列整齊，小腸絨毛豐富，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完整清晰。酒精模型組出現(xiàn)小腸微絨毛排列稀疏，緊密連接腫大等病理改變。益生菌干預(yù)組小腸柱狀上皮及微絨毛排列情況均得到不同程度改善，緊密連接腫脹減輕。見Fig 3。

Fig 3　Transmission electron microscopy of small intestine in rats

A：Control;B:Alcohol;C:Probiotics

2.4益生菌干預(yù)對大鼠肝臟功能的影響結(jié)果顯示，酒精模型組大鼠血清ALT、AST及ALP水平均明顯上升，分別為正常對照組的1.4、1.3和1.4倍(P<0.05)。益生菌干預(yù)組ALT、AST及ALP水平均較酒精模型組明顯降低(P<0.05)。見Tab 2。

Tab 2Effect of probiotics on serum ALT,

GroupnALTASTALPControl1340.55±5.60102.55±13.27135.87±12.47Alcohol857.17±8.24*131.64±14.22*190.38±17.08*Probiotics1045.81±7.75#110.69±13.28#165.06±13.44#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsalcohol group

2.5益生菌對大鼠血清中DAO及D-LA水平的影響結(jié)果顯示，酒精模型組大鼠血清中DAO及D-LA水平明顯升高，均達(dá)到正常對照組的1.3倍(P<0.05)；補(bǔ)充益生菌后大鼠血清中DAO及D-LA水平分別較酒精模型組明顯降低了20.2%和23.6%(P<0.05)。見Tab 3。

Tab 3　 Changes of plasma DAO and

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsalcohol group

2.6益生菌對大鼠小腸組織FOXO4表達(dá)的影響結(jié)果顯示，酒精模型組FOXO4表達(dá)明顯減少，達(dá)到正常對照組的50.0%，益生菌干預(yù)組FOXO4表達(dá)則較酒精模型組明顯提高了38.5%(P<0.05)。見Fig 4，Tab 3。

Fig 4　Expression of FOXO4 in small intestine detected by immunohistochemistry(×400)

A：Control;B:Alcohol;C:Probiotics

2.7糞便腸道菌群16S rDNA高通量測序分析

2.7.1測序概況各組樣品共獲得453 467條高質(zhì)量標(biāo)簽序列，在97%相似性水平下對序列進(jìn)行聚類分析，共產(chǎn)生91 104條OTU序列。分析結(jié)果顯示，各組間標(biāo)簽序列及OTU序列數(shù)目有所差別，但差異均無顯著性(P>0.05)。見Tab 4。

Tab 4　Comparison of sequence number in fecal intestinal ±s)

同時，本實驗以O(shè)TU數(shù)據(jù)為計算依據(jù)構(gòu)建VENN圖進(jìn)行菌群多樣性定性分析。結(jié)果顯示，酒精模型組與正常對照組的共有OTU序列為1 956條，而益生菌干預(yù)組與正常對照組的共有序列則為2 061條；同時，酒精模型組的OTU中有46.7%在其他組中沒有出現(xiàn)，而正常對照組和益生菌干預(yù)組的這一數(shù)值分別是54.1%和52.9%。提示酒精損傷后大鼠腸道菌群多樣性可能受到了一定影響，益生菌補(bǔ)充對恢復(fù)腸道菌群正常狀態(tài)具有一定調(diào)節(jié)作用。見Fig 5。

Fig 5　Qualitative analysis of intestinal microbial flora diversity among groups

C:Control;M:Alcohol;L:Probiotics

2.7.2Alpha多樣性分析Alpha多樣性反映的是單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，包括ACE指數(shù)、chaol指數(shù)、coverage、shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等。本實驗對所有樣品alpha多樣性進(jìn)行計算，并做出相應(yīng)稀疏曲線圖。

2.7.2.1菌群豐度評估通過ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)等評估各組樣品菌群豐度。結(jié)果顯示，酒精損傷后腸道菌群豐度有所降低，益生菌對恢復(fù)菌群豐度具有一定調(diào)節(jié)作用，但各組間差異均未見顯著性(P>0.05)。見Tab 5，F(xiàn)ig 6。

2.7.2.2菌群多樣性分析通過shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評估各組樣品菌群多樣性。結(jié)果顯示，酒精損傷使腸道菌群多樣性有所降低，而益生菌對恢復(fù)菌群多樣性具有一定調(diào)節(jié)作用，但各組間差異均未見顯著性(P>0.05)。見Tab 5，F(xiàn)ig 6。

2.7.2.3樣品文庫覆蓋率評估為衡量樣本取樣深度，進(jìn)行Coverage指數(shù)和稀疏性曲線分析。結(jié)果表明，隨著測序量的增加，還會有新的物種出現(xiàn)。但各組樣本Coverage指數(shù)均趨近于85 %，提示測序深度已經(jīng)基本能夠覆蓋該微生物群落中絕大多數(shù)細(xì)菌。分析結(jié)果還顯示，在測序量較低(<500)時，各組樣本Shannon指數(shù)均明顯上升，隨著測序量的擴(kuò)大，Shannon指數(shù)逐漸變緩并最終均達(dá)到平臺期，Shannon指數(shù)均趨近于7.0，Simpson指數(shù)多小于0.006，表明多樣性已基本達(dá)到飽和，均勻度較高，可用于后續(xù)分析。見Tab 5，F(xiàn)ig 6。

Fig 6　Alpha analysis of intestinal microbial flora among groups

A：ACE rarefaction plot;B:Chao1 rarefaction plot;C:Richness rarefaction plot;D:Shannon rarefaction plot

2.7.3腸道菌群菌門水平豐度分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠腸道菌群主要分屬11個菌門，其最優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門(firmicutes)、擬桿菌門(bacteroidetes)和變形菌門(proteobacteria)。酒精模型組腸道菌群中厚壁菌門數(shù)量較正常對照組明顯減少，而擬桿菌門數(shù)量明顯增多(P<0.05)；益生菌干預(yù)后，厚壁菌門數(shù)量較酒精模型組增加，而擬桿菌門數(shù)量有所減少，但差異均未見顯著性(P>0.05)。非優(yōu)勢菌門中，酒精模型組柔膜菌門(tenericutes)和迷蹤菌門(elusimicrobia)數(shù)量與正常對照組比較明顯增高，而益生菌干預(yù)組迷蹤菌門數(shù)量則較酒精模型組明顯降低(P<0.05)。變形菌門及其余非優(yōu)勢菌門在各組間差異均未見顯著性或含量微乎其微(P>0.05)。見Tab 6。

Tab 5　Alpha diversity of intestinal microbial flora among ±s)

Tab 6　Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum ±s)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsalcohol group

2.7.4腸道菌群菌屬水平豐度分析結(jié)果顯示，正常對照組檢測到約170個菌屬，酒精模型組約為154個菌屬，益生菌干預(yù)組約為164個菌屬，分別較正常對照組減少了9.4%和3.5%。酒精模型組豐度最高的前20個菌屬與正常對照組一致率僅為75%，且各菌屬豐度亦較正常對照組有較大差別。益生菌干預(yù)組豐度最高的前20個菌屬與正常對照組一致率達(dá)到90%，且其中大部分菌屬的豐度構(gòu)成比較酒精模型組更接近于正常對照組。各組大鼠腸道菌群豐度前20位菌屬分布見Fig 7。

3　討論

腸道菌群是人體在長期進(jìn)化過程中形成的腸道正常微生物群，它們按一定數(shù)量和比例分布在腸道不同節(jié)段與部位，對宿主發(fā)揮機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障等重要生理作用。長期過量飲酒可使腸道微生物群的組成和分布發(fā)生紊亂[7-8]，細(xì)菌易位、部分革蘭陰性菌(G-)過度繁殖均可造成腸道黏膜屏障的完整性破壞及功能障礙，促使內(nèi)毒素、氨、硫醇等腸源性毒物過度產(chǎn)生并滲漏入血，經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟后，最終導(dǎo)致和加重酒精性肝損傷狀況[9-10]。因此，維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定，恢復(fù)腸黏膜屏障功能，對防治酒精性肝損傷具有重要意義[11]。

Fig 7　Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level

A：Control;B:Alcohol;C:Probiotics

研究表明，合理攝入活性益生菌制劑，對腸道菌群失調(diào)具有良好的改善、修復(fù)作用。2001年，我國衛(wèi)生部公布了雙歧桿菌(bifidobacterium)、乳酸桿菌(lactobacillus)、嗜熱鏈球菌( streptococcus thermophilus )等3類共計9種可用于保健食品的益生菌名單。本實驗采用包含以上3類益生菌的碧悠發(fā)酵乳作為干預(yù)物，研究其對酒精性肝損傷及腸道屏障功能的改善效果。結(jié)果顯示，益生菌對酒精攝入導(dǎo)致的肝組織損傷具有一定保護(hù)作用，與相關(guān)報道一致[4-5,12-13]。D-LA是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，DAO是哺乳動物腸黏膜上層絨毛細(xì)胞中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，二者在腸黏膜細(xì)胞遭到破壞時均可釋放入血，從而成為腸道屏障功能檢測血清學(xué)敏感評價指標(biāo)。FOXO4是叉頭框蛋白轉(zhuǎn)錄因子O亞家族的一員，研究表明，腸黏膜組織中FOXO4表達(dá)降低與腸黏膜屏障功能障礙密切相關(guān)[14]。本實驗檢測結(jié)果顯示，補(bǔ)充益生菌可明顯改善小腸組織超微結(jié)構(gòu)損傷狀況，血清D-LA和DAO水平明顯降低，F(xiàn)OXO4表達(dá)則明顯增多，表明益生菌干預(yù)對酒精攝入引起的腸道黏膜屏障破壞具有一定修復(fù)作用。

為了進(jìn)一步探討益生菌改善腸道屏障功能，緩解肝組織損傷的作用機(jī)制是否與其對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，本研究采用16S rDNA高通量測序技術(shù)對大鼠糞便腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)的分子生態(tài)學(xué)分析。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)相對應(yīng)的DNA序列。由于16S rDNA能夠較好體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，故而作為細(xì)菌分類學(xué)研究最有用的“分子鐘”而被普遍使用[6]。本實驗測序結(jié)果表明，酒精誘導(dǎo)使腸道菌群多樣性及菌門、菌屬豐度均受到一定影響，主要表現(xiàn)為：① OTU、VENN、Shannon指數(shù)等多樣性評價指標(biāo)均較正常對照組降低；② 厚壁菌門及擬桿菌門等優(yōu)勢菌門、柔膜菌門及迷蹤菌門等非優(yōu)勢菌門數(shù)量均較正常對照組差異具有顯著性；③ 正常對照組分布前3位的菌屬分別為普氏菌屬(Prevotella)、Barnesiella菌屬和梭菌屬XlVa，而酒精模型組分布前3位的菌屬中，帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)取代了Barnesiella菌屬位于第2位；④ 正常對照組分布于前20位的菌屬中施氏菌屬、嗜膽菌屬、螺桿菌屬(Helicobacter)、Johnsonella菌屬和代爾夫特菌屬(Delftia)在酒精模型組前20位菌屬分布中均未出現(xiàn)，取而代之的是理研菌屬(Rikenella)、新月菌屬(Meniscus)、Sporobacter菌屬、蝙蝠弧菌屬(Vampirovibrio)和羅氏菌屬(Roseburia)5種菌屬。補(bǔ)充益生菌對恢復(fù)腸道菌群正常狀態(tài)具有一定調(diào)節(jié)作用。主要表現(xiàn)為：① 各種多樣性評價指數(shù)均較酒精模型組更接近正常對照組；② 各優(yōu)勢菌門數(shù)量與酒精模型組比較差異雖無顯著性，但均有所改善，更趨向于正常大鼠，且迷蹤菌門數(shù)量明顯降低至正常水平。③ 分布在前2位的菌屬與正常對照組一致；④ 分布在前20位的菌屬中，只有理研菌屬與酒精模型組一致而未出現(xiàn)在正常對照組中，而作為有益菌的乳桿菌屬(Lactobacillus)只出現(xiàn)在益生菌干預(yù)組。以上結(jié)果表明，酒精誘導(dǎo)使腸道菌群發(fā)生擾動，補(bǔ)充益生菌可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，有效改善腸道菌群紊亂狀況，修復(fù)腸黏膜屏障，減少內(nèi)毒素等有毒物質(zhì)滲漏入血，從而延緩酒精性肝損傷進(jìn)程。

綜上所述，益生菌通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)紊亂，改善腸道屏障功能，對大鼠酒精性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用。益生菌作為一種安全有效的活體微生物制劑，值得在酒精性肝損傷治療領(lǐng)域得到進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

(致謝:本實驗在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所實驗室完成，感謝實驗室全體老師對本實驗的大力支持和幫助。)

[1]邱萍，李相，孔德松，等. 酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究的新進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報，2014，30(2)：160-3.

[1]Qiu P, Li X, Kong D S, et al. Research progress on pathogenesis of alcoholic liver disease[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(2):160-3.

[2]Szabo G,Bala S. Alcoholic liver disease and the gut-liver axis[J].WorldJGastroenterol, 2010, 16(11):1321-9.

[3]Nanji A A, Khettry U, Sadrzadeh S M. Lactobacillus feeding reduces endotoxemia and severity of experimental alcoholic liver(disease)[J].ProcSocExpBiolMed,1994, 205(3):243-7.

[4]Chang B, Sang L, Wang Y,et al. The protective effect of VSL#3 on intestinal permeability in a rat model of alcoholic intestinal injury[J].BMCGastroenterol,2013,13:151.

[5]Komatsuzaki N,Shima J. Effects of live Lactobacillus paracasei on plasma lipid concentration in rats fed an ethanol-containing diet[J].BiosciBiotechnolBiochem,2012,76(2):232-7.

[6]Ong S H,Kukkillaya V U,Wilm A,et al. Species identification and profiling of complex microbial communities using shotgun Illuminasequencing of 16S rRNA amplicon sequences[J].PLoSOne,2013,8(4):e60811.

[7]Mutlu E A,Gillevet P M,Rangwala H, et al. Colonic microbiome is altered in alcoholism[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2012,302(9):G966-78.

[8]Kavanaugh M J,Clark C, Goto M, et al. Effect of acute alcohol ingestion prior to burn injury on intestinal bacterial growth and barrier function[J].Burns,2005,31(3):290-6.

[9]Mutlu E, Keshavarzian A, Engen P,et al. Intestinal dysbiosis: a possible mechanism of alcohol-induced endotoxemia and alcoholic steatohepatitis in rats[J].AlcoholClinExpRes,2009,33(10):1836-46.

[10]吳夏飛，連娜琦，陸春風(fēng)，等. 腸道菌群對慢性肝臟疾病影響的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報，2013，29(12)：1644-7.

[10]Wu X F, Lian N Q, Lu C F, et al. Research progress on effect of intestinal flora on chronic liver diseases[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(12):1644-7.

[11]Szabo G. Gut-liver axis in alcoholic liver disease[J].Gastroenterology,2015,148(1): 30-6.

[12]張波,魯曉嵐,宋亞華,等.腸道內(nèi)環(huán)境在酒精性脂肪肝發(fā)病中的初始作用及益生菌的治療效果[J].中華肝臟病雜志，2012，20(11)：848-52.

[12]Zhang B, Lu X L, Song Y H, et al. Changes in the intestinal microenvironment during development of alcoholic fatty liver disease and related effects of probiotic therapy[J].ChinJHepatol,2012,20(11):848-52.

[13]Wang Y, Kirpich I, Liu Y, et al.Lactobacillus rhamnosus GG treatment potentiates intestinal hypoxia-inducible factor, promotes intestinal integrity and ameliorates alcohol-induced liver injury[J].AmJPathol,2011,179(6): 2866-75.

[14]Chang B,Sang L,Wang Y,et al. The role of FoxO4 in therelationship between alcohol-induced intestinal barrier dysfunction and liver injury[J].IntJMolMed,2013,31(3):569-76.

Effects of probiotics on alcoholic liver injury in rats and its mechanisms

LIANG Hui1, LYU Rui2, FU Yong1, ZHOU Zhi-tong3, LIU Ying4,ZHOU Xiao-bin5,WANG Wen-cheng1, LIU Man1, MA Ai-guo1

(1.TheInstituteofHumanNutrition,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266021,China;2.LaboratoryofPathogenBiology,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266071,China;3.TheSpecialtyofFoodScienceandEngineering,JiangnanUniversity,WuxiJiangsu214122,China;4.LaboratoryofCellularandMolecularBiology,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266071,China;5.TeachingandResearchSectionEpidemicofDiseaseandHealthStatistics,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266021,China)

AimTo observe the protective effects of probiotics on alcoholic liver injury in rats.MethodsMale Wistar rats were randomly divided into the following three groups: control group, normal diet with normal (5×108CFU·kg-1·d-1) treatment group. Excluding the rats in the normal control group, the other animals were initially received intragastric administration with 56%(V/V) ethanol 5.5～11.0 mL·kg-1·day-1for 8 weeks. Then the rats’ faeces were collected, and the liver and the small intestine were obtained for pathologic and ultrastructural observation. Serum ALT, AST and ALP was measured by method of biochemistry. Serum DAO and D-LA was measured by enzyme linked immunosorbent assay. The expression of FOXO4 in small intestine was detected by immunohistochemistry. The intestinal flora genome DNA was extracted from faeces and the sequence of 16S rDNA was analyzed by high-throughput sequencing technologies.ResultsHepatic steatosis was obviously improved in probiotics treatment groups compared with ethanol-treated group, and the ultrastructural such as mitochondrial and rough endoplasmic reticulum pathological changes was significantly alleviated. The ultrastructural changes in intestinal were better in probiotics treatment group than in the ethanol-treated group. And ethanol-induced rats’ serum ALT, AST, ALP, D-LA and DAO levels showed a significant reduction in the probiotics treatment groups compared with the ethanol-treated group(P<0.05). The FOXO4 expression was increased obviously in the probiotics treatment groups compared with the ethanol-treated group(P<0.05). And the intestinal flora diversity was impacted after feeding alcohol, and probiotics had a certain regulative action in helping the intestinal flora back to normal state; At phylum level, the Firmicutes quantity was lower and the Bacteroidetes quantity was higher in ethanol-treated group than those in the control group(P<0.05), and the conditions were improved after supplementing probiotics. At genus level, the percent of genus abundance was similar to normal control group in the probiotics treatment groups compared with the ethanol-treated group.ConclusionProbiotics can relieve liver injury induced by alcohol in rats, and the mechanism may be related to the modulation of probiotics on the intestinal flora distribution and intestinal barrier.

probiotics; alcoholic liver disease; intestinal barrier; intestinal flora;16s rDNA high throughput sequencing;molecular ecology

2016-02-18,

2016-04-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81573137)；達(dá)能營養(yǎng)中心膳食營養(yǎng)研究與宣教基金資助項目(No DIC2014-03)； 青島大學(xué)創(chuàng)新型教學(xué)實驗室研究項目

梁惠(1964-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：醫(yī)學(xué)營養(yǎng)學(xué)，Tel:0532-82991503,E-mail:qdlianghui@126.com;馬愛國(1956-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師,通訊作者,E-mail:magfood@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.021

A

1001-1978(2016)07-0991-07

R-332；R154；R322.45；R575.01；R975

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.042.html