金絲桃素在細(xì)胞水平對(duì)抗乙肝病毒新靶點(diǎn)pgRNA的作用研究

藍(lán)天云,范　紅，陳勇彬，楊翠萍，趙興旺，李　巖

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明　650032；2.云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明　650032；3.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明　650223)

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金絲桃素在細(xì)胞水平對(duì)抗乙肝病毒新靶點(diǎn)pgRNA的作用研究

藍(lán)天云1，2,范紅1,2，陳勇彬3，楊翠萍3，趙興旺1，李巖1,2

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650032；2.云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明650032；3.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明650223)

乙型病毒性肝炎是由乙型嗜肝DNA病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的一種世界范圍內(nèi)的傳染性疾病，對(duì)人類(lèi)健康危害重大[1]。目前，臨床上應(yīng)用最廣泛的抗乙肝病毒藥物是拉米夫定(lamivudine, 3TC)等核苷類(lèi)化合物[2]，但長(zhǎng)期應(yīng)用核苷類(lèi)藥物，編碼HBV DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶的基因區(qū)域會(huì)發(fā)生點(diǎn)突變而產(chǎn)生病毒耐藥株，使得抗病毒效果大為下降[3]。因此，尋找新的抗病毒藥物靶點(diǎn)成為乙肝研究中的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。金絲桃素(hypericin，4,4′,5,5′,7,7′-六羥基-2,2′-二甲基[中位]萘駢二蒽酮)，是貫葉連翹等金絲桃素植物的主要活性成分之一，有強(qiáng)效抗乙肝病毒活性，但與核苷類(lèi)藥物不同，其對(duì)HBV DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)抑制作用，卻可以明顯下調(diào)pgRNA表達(dá)水平，提示其藥物作用靶點(diǎn)可能與pgRNA相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)金絲桃素抗乙肝病毒作用進(jìn)行驗(yàn)證，并在此基礎(chǔ)上對(duì)金絲桃素的可能靶點(diǎn)pgRNA以及靶點(diǎn)相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)進(jìn)行了更加深入的研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料可分泌HBV活病毒的肝細(xì)胞株HepG2.2.15；金絲桃素(95%，HPLC，Sigma)；3TC(GSK)；高糖DMEM 培養(yǎng)液及胎牛血清(Gibco)；胰酶(碧云天)；地高辛標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒(Roche)；Bio-Rad反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒；AxyPrep液體病毒DNA/RNA提取試劑盒及總RNA小量制備試劑盒；乙型肝炎病毒表面抗原( Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg) 和乙型肝炎病毒e抗原( Hepatitis B virus e antigen，HBeAg)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海科華生物工程公司；實(shí)驗(yàn)所用抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及化合物干預(yù)將細(xì)胞以1～2×106接種于10 cm培養(yǎng)皿中，所有細(xì)胞均使用含有10%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分為3組，金絲桃素以半數(shù)有效濃度0.5 μmol·L-1為終濃度加入實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的培養(yǎng)基中，3TC以半數(shù)有效濃度1.0 μmol·L-1為終濃度加入對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)基中，去離子水為空白對(duì)照加入空白對(duì)照組的細(xì)胞的培養(yǎng)基。24 h更換一次培養(yǎng)基，72 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。1.2.2HBV DNA復(fù)制水平檢測(cè)使用AxyPrep液體病毒DNA/RNA小量制備試劑盒提取HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞分泌的HBV DNA。取各組所提取的DNA樣品30 μg，使用Southern blot檢測(cè)HBV DNA的復(fù)制情況，使用地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記的HBV DNA探針雜交過(guò)夜，化學(xué)發(fā)光顯影。取各組DNA樣品，使用染料法熒光定量PCR，檢測(cè)HBV DNA復(fù)制水平。

1.2.3ELISA 檢測(cè)HBsAg 和HBeAg 的抑制率吸取不同藥物處理后的各組細(xì)胞上清，用ELISA 法測(cè)定細(xì)胞上清液中的HBsAg 和HBeAg抗原量。

1.2.4總RNA的提取與目標(biāo)mRNA表達(dá)水平檢測(cè)收集各組細(xì)胞，使用 AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA。取各組所提取的總RNA 10 μg，Northern blot檢測(cè)pgRNA表達(dá)，地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記的pgRNA探針雜交，化學(xué)發(fā)光顯影。取各組所提取的總RNA 1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到cDNA為模板，使用染料法熒光定量PCR檢測(cè)pgRNA及肝富集因子mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，GAPDH為內(nèi)參，熒光定量PCR引物見(jiàn)Tab 1。

1.2.5總蛋白提取及指標(biāo)檢測(cè)將收集細(xì)胞的使用RIPALysis Buffer進(jìn)行重懸(50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)+150 mmol·L-1NaCl+1% NP-40+PMSF)，放入液氮中反復(fù)凍融2～3次，離心后取上清液。取各組所提取蛋白20 μg，Western blot檢測(cè)肝富集因子NF3β,HNF4α,PPARα/RXRα的表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參基因，SDS-PAGE膠電泳，pvdf膜印跡，脫脂牛奶封閉后，一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影。

Tab 1　Fluorescence quantitative PCR primers

2　結(jié)果

2.1金絲桃素對(duì)HBV DNA復(fù)制的影響對(duì)HBV DNA的Southern blot和熒光定量PCR檢測(cè)表明，與空白對(duì)照組相比，金絲桃素組與3TC組的HBV DNA的表達(dá)有明顯下調(diào)(P<0.05)。

2.2金絲桃素對(duì)HBsAg 和HBeAg的抑制率ELISA法檢測(cè)各組HBsAg 和HBeAg在藥物處理后的表達(dá)變化可見(jiàn)，3TC組、金絲桃素組相較于空白對(duì)照組，HBsAg 和HBeAg的數(shù)量明顯下降，抑制率均有升高(P<0.05)。

2.3金絲桃素對(duì)pgRNA的表達(dá)水平的影響Northern blot結(jié)果和熒光定量PCR結(jié)果均顯示金絲桃素組與空白對(duì)照組相比，HepG2.2.15 細(xì)胞株pgRNA下降明顯(P<0.05)，但3TC組與空白對(duì)照組相比，pgRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.4金絲桃素對(duì)肝富集因子的影響為了了解pgRNA表達(dá)水平降低的原因，研究分別從mRNA與蛋白質(zhì)水平初步探查了金絲桃素對(duì)調(diào)控pgRNA轉(zhuǎn)錄的幾個(gè)相關(guān)的肝富集轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響。Western blot結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果都表明，金絲桃素組相比于空白對(duì)照組，HepG2.2.15細(xì)胞株HNF3β的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，HNF4α表達(dá)降低(P<0.05)，而PPARα/RXRα的表達(dá)沒(méi)有明顯變化(P>0.05)，而拉米夫定組與空白對(duì)照組相比，4種調(diào)控因子均無(wú)明顯表達(dá)變化(P>0.05)。

3　討論

本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，金絲桃素實(shí)驗(yàn)組中，HepG2.2.15產(chǎn)生的HBV DNA與HBsAg與HBeAg均有下降，證明金絲桃素具有強(qiáng)效抗乙肝病毒活性，但其作用靶點(diǎn)與核苷類(lèi)化合物并不相同[4]，其會(huì)明顯降低pgRNA的表達(dá)。而pgRNA不僅是HBsAg與HBeAg的翻譯模板，同時(shí)也是HBV DNA的反轉(zhuǎn)錄模板[10-11]。其表達(dá)量下調(diào)，不僅可以減少生成核衣殼的核心蛋白的表達(dá)，更能直接減少病毒逆轉(zhuǎn)錄生成新的HBV DNA，因此金絲桃素的作用靶點(diǎn)很可能與pgRNA相關(guān)。pgRNA的下游產(chǎn)物HBs和HBe對(duì)pgRNA的生成不具有調(diào)節(jié)作用[12]。pgRNA的表達(dá)由上游的肝富集調(diào)控因子調(diào)控，HNF3β對(duì)HBV的復(fù)制有抑制作用，HNF4α和PPARα/RXRα對(duì)HBV的復(fù)制起正向調(diào)控的作用[13-15]。為了進(jìn)一步探究金絲桃素如何作用于pgRNA，實(shí)驗(yàn)在藥物干預(yù)后，檢測(cè)了HepG2.2.15細(xì)胞中的4種調(diào)控因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示，金絲桃素在肝臟細(xì)胞中能使pgRNA表達(dá)下調(diào)的肝富集因子HNF3β蛋白表達(dá)水平升高，使pgRNA表達(dá)上調(diào)的HNF4α蛋白表達(dá)水平下降。而另外兩種調(diào)控因子PPARα/RXRα表達(dá)無(wú)變化。這說(shuō)明金絲桃素有可能作用于調(diào)控pgRNA轉(zhuǎn)錄的肝富集因子HNF3β、HNF4α，使其表達(dá)水平發(fā)生變化，從而使pgRNA的表達(dá)降低。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院肝病研究所完成，在此深表感謝！)

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Primary research of the effects and target of hypericin in HepG2.2.15 cells

LAN Tian-yun1,2,FAN Hong1,2,CHEN Yong-bin3,YANG Cui-ping3,ZHAO Xing-wang1,LI Yan1,2

(1.MedicalFacultyofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650032,China;2.theFirstPeople′sHospitalofProvince,Kunming,650032,China; 3.KunmingInstituteofZoology,CAS,Kunming650223,China)

乙型肝炎病毒；pgRNA；金絲桃素；肝富集轉(zhuǎn)錄因子；HNF3β；HNF4α

Hepatitis B virus; pregenomic RNA; hypericin; liver enriched transcription factor; HNF3β；HNF4α

◇研究簡(jiǎn)報(bào)◇

2016-01-05,

2016-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No 81300324)；云南省科技應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No 2011FZ282)

藍(lán)天云(1990-)，女，碩士生，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：lty404@hotmail.com；李巖(1981-)，女，博士，主治醫(yī)生，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化內(nèi)科，通訊作者，E-mail：hepatocellular@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.028

A文章編號(hào)：1001-1978(2016)07-1033-03

R284.1；R342.2；R373.21；R394.2；R512.62；R978.7

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.056.html