小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用研究

路　暢，杜　肖，賀曉麗，王月華，杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1.藥用植物研究所，北京　100193；2.藥物研究所，北京　100050)

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小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用研究

路暢1，杜肖1，賀曉麗1，王月華2，杜冠華2

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1.藥用植物研究所，北京100193；2.藥物研究所，北京100050)

目的觀察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用。方法選用健康♂ SD大鼠，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注(MCAO)模型，缺血2 h后實(shí)現(xiàn)再灌注。應(yīng)用Zea-Longa′s級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)價(jià)動(dòng)物腦缺血程度，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥銀杏葉提取物EGb 761組，以假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組，術(shù)后1～14 d灌胃給藥，每日1次。通過(guò)Zea-Longa′s級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分、改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)和轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)(CT)等系列行為學(xué)評(píng)價(jià)手段，評(píng)測(cè)小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠不同恢復(fù)時(shí)期行為學(xué)的變化，每天1次，連續(xù)測(cè)定14 d；選用TTC染色法觀察大鼠腦梗死體積百分比；采用分光光度法檢測(cè)大鼠腦缺血半暗帶和缺血核心區(qū)腦組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性的變化。結(jié)果隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組能夠有效降低MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，表現(xiàn)為MCAO大鼠行走趨于正常，平衡木上停留時(shí)間增長(zhǎng)，感覺(jué)功能恢復(fù)，轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)中MCAO大鼠向右轉(zhuǎn)向的比率逐漸接近正常。自給藥5 d起，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組開始明顯改善MCAO大鼠上述神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)。并且小續(xù)命湯有效成分組能夠明顯降低術(shù)后5 d和14 d MCAO大鼠腦組織梗死體積百分比(P<0.01)。此外，小續(xù)命湯有效成分組能夠明顯減少M(fèi)CAO大鼠缺血半暗帶和核心區(qū)腦勻漿的MDA含量和降低NOS活力，提高SOD和GSH-Px活力。結(jié)論小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠損傷恢復(fù)早期即產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，可能與調(diào)節(jié)腦內(nèi)氧化-抗氧化平衡有關(guān)。

小續(xù)命湯有效成分組；腦缺血/再灌注；神經(jīng)功能恢復(fù)；神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)；氧化應(yīng)激；神經(jīng)保護(hù)

腦卒中(stroke)，又稱腦中風(fēng)，是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病。據(jù)報(bào)道，2.3億患有心腦血管疾病的中國(guó)患者中，缺血性腦卒中患者達(dá)66.4%[1]。該病常常在無(wú)癥狀的情況下剝奪人獨(dú)立生活的能力，其發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率之高，使之成為全球關(guān)注的健康難題，且將在未來(lái)20年中給世界尤其是發(fā)展中國(guó)家患者帶來(lái)更沉重的負(fù)擔(dān)[2]。

中藥復(fù)方小續(xù)命湯是中醫(yī)從外風(fēng)論治療缺血腦卒中的經(jīng)典有效方劑[3]。理論上，中藥復(fù)方小續(xù)命湯通過(guò)其多途徑、多靶點(diǎn)的治療手段，針對(duì)缺血性腦卒中復(fù)雜的病理環(huán)節(jié)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和臨床療效[4]。小續(xù)命湯有效成分組包含中藥復(fù)方小續(xù)命湯中所有與其治療腦缺血損傷密切相關(guān)的藥理活性組分[5]。前期研究結(jié)果顯示，大鼠術(shù)前5 d預(yù)防給予小續(xù)命湯有效成分組，能夠?qū)Τ掷m(xù)性大腦中動(dòng)脈缺血大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腦內(nèi)氧化-抗氧化平衡有關(guān)[6]。

目前，在抗腦缺血藥物評(píng)價(jià)中，對(duì)腦缺血損傷引起的神經(jīng)功能障礙和后期神經(jīng)功能恢復(fù)關(guān)注度較低，這是致使一些在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有很好療效的藥物，在臨床實(shí)驗(yàn)中卻大都以失敗告終的原因之一[7]。因此，基于上述考慮，并結(jié)合實(shí)際的臨床用藥，我們建立短暫性大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注大鼠模型，術(shù)后給予小續(xù)命湯有效成分組，從多種神經(jīng)功能評(píng)價(jià)指標(biāo)入手，探討其對(duì)局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康Sprague-Dawley (SD) ♂大鼠153只，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所無(wú)特殊病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)動(dòng)物房，自由飲水和攝食。

1.2藥品與試劑小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所篩選中心提供；銀杏葉提取物EGb 761(金納多片，其中銀杏黃酮苷占24%，萜類內(nèi)酯占6%)，由德國(guó)威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3, 5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)，購(gòu)自Sigma公司；丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒和一氧化氮合酶(NOS)測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

2　方法

2.1大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型制備SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將大鼠禁食12 h，自由飲水。戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉SD大鼠，采用線栓法制備MCAO模型[8]。血流阻斷2 h后，拔出線拴，形成再灌注。假手術(shù)組大鼠只分離血管，不插入線拴。

2.2模型成功的判定按照Z(yǔ)ea-Longa’s級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法[9]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分等級(jí)為0～4分，分值越高，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

術(shù)后動(dòng)物清醒和24 h，分別對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分均在1～3分者為造模成功，評(píng)分為0分、4分以及生命體征不平穩(wěn)的動(dòng)物棄之不用。

2.3動(dòng)物分組及給藥將模型成功的大鼠按體重隨機(jī)分為5組：MCAO模型組(Model group)、XXMD低劑量組(XXMD-L，75 mg·kg-1)、XXMD中劑量組(XXMD-M，150 mg·kg-1)、XXMD高劑量組(XXMD-H，300 mg·kg-1)以及陽(yáng)性藥銀杏葉提取物EGb 761組(150 mg·kg-1)，以假手術(shù)組(Sham group)為對(duì)照組。

短暫性MCAO模型，給藥時(shí)間設(shè)定在再灌注24 h，之后每天1次灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d。小續(xù)命湯有效成分組和銀杏葉提取物組均用0.5%羧甲基纖維素鈉配置。假手術(shù)組與模型組給予等體積的溶劑對(duì)照。

2.4神經(jīng)行為學(xué)恢復(fù)評(píng)分我們采用多種行為學(xué)評(píng)分方法，包括Zea-Longa’s級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[9]、改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity scores，mNSS)[10]和轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)(corner test，CT)[11]，評(píng)估XXMD對(duì)缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。此檢測(cè)在術(shù)前1 d和術(shù)后1～14 d分別進(jìn)行，每天1次，實(shí)驗(yàn)固定在同一時(shí)間完成。

2.4.1Zea-Longa’s級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分見2.2。

2.4.2mNSS評(píng)分這是一個(gè)綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡和反射水平的評(píng)分方法，全面反映出動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)功能等級(jí)，廣泛應(yīng)用于腦缺血?jiǎng)游锷窠?jīng)功能評(píng)價(jià)[10]。mNSS總分18分，其中輕度損傷為0～6分，中度損傷為7～12分，重度損傷為13～18分，神經(jīng)功能損傷程度隨分值增大而加重。

2.4.3轉(zhuǎn)角試驗(yàn)轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)，能夠評(píng)價(jià)缺血/再灌注大鼠胡須刺激和轉(zhuǎn)向能力，測(cè)定大鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能。兩塊(60×40×1) cm3的木板固定成30°角，將SD大鼠面向夾角放在木板間，大鼠會(huì)向前行走，遇到阻礙后轉(zhuǎn)向朝外走。觀察并記錄重復(fù)10次大鼠的轉(zhuǎn)向方向，計(jì)算出大鼠向右轉(zhuǎn)向的比率。

2.5腦梗死體積測(cè)定采用TTC染色法測(cè)定大鼠腦組織梗死體積，此實(shí)驗(yàn)是在行為學(xué)檢測(cè)出現(xiàn)明顯改變后進(jìn)行，以進(jìn)一步確定XXMD對(duì)腦缺血大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的時(shí)間點(diǎn)。分別在給藥d 5和d 14行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死大鼠，進(jìn)行TTC染色[8]。為了消除腦水腫的影響，大鼠腦梗死體積百分比以如下公式計(jì)算。

腦梗死體積百分比(BIVP)/%=(梗死對(duì)側(cè)正常腦組織面積-梗死側(cè)正常腦組織面積)/梗死對(duì)側(cè)正常腦組織面積×100%

2.6腦組織(缺血核心區(qū)和半暗帶區(qū))氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定給藥5 d時(shí)，通過(guò)測(cè)定腦組織勻漿中MDA含量、GSH-Px 、SOD 和NOS活性來(lái)反映小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血/再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響。將大鼠斷頭取腦，冰冷的生理鹽水漂洗，去除小腦、低位腦干和血管。應(yīng)用大鼠模具，在距離額葉前端3 mm和9 mm處分別進(jìn)行冠狀切片(依據(jù)腦組織梗死灶大小可適當(dāng)調(diào)整切片位置)，取中間的腦組織塊，將右側(cè)缺血的大腦半球沿矢狀縫側(cè)2 mm處做矢狀切片(棄去)，剩余的腦組織即為缺血核心區(qū)和半暗帶區(qū)[12]。然后，準(zhǔn)確稱取腦組織重量，按照重量(g) ∶體積(mL)=1 ∶9的比例加入相應(yīng)體積的預(yù)冷的生理鹽水，冰浴充分研磨后，3 000 r·min-1離心10 min，制備成10%的勻漿上清液備用。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行上述指標(biāo)的操作。

3　結(jié)果

3.1MCAO模型的驗(yàn)證MCAO模型的穩(wěn)定建立是本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)多次練習(xí)，預(yù)實(shí)驗(yàn)中，缺血/再灌注24 h后，MCAO模型成功率為82.35%，動(dòng)物死亡率為15%，經(jīng)TTC染色，腦梗死體積百分比為(50.64±8.19)%。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符[8]，因此，我們認(rèn)為SD大鼠MCAO模型建立成功，可以開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab 1　Five grades standard scores by Zea-Longa

3.2小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠體重的影響與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的體重有明顯的下降；隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠的體重均有不同程度的提高。如Fig 1所示，自給藥d 2開始，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組高劑量組大鼠體重有所提高(P<0.05)；自給藥d 6開始，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組(75、150、300 mg·kg-1)和陽(yáng)性藥銀杏葉提取物組的大鼠體重均出現(xiàn)明顯提高(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小續(xù)命湯有效成分組能夠促進(jìn)缺血/再灌注大鼠恢復(fù)體重。

Fig 1　Effect of XXMD(75～300 mg·kg-1)

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

3.3小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響腦缺血/再灌注大鼠出現(xiàn)不同程度的行為學(xué)損傷和神經(jīng)功能障礙，手術(shù)大鼠表現(xiàn)為右側(cè)Horner癥，提尾時(shí)大鼠左前肢屈曲內(nèi)收，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，假手術(shù)大鼠表現(xiàn)正常。與模型組相比，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，小續(xù)命湯有效成分組和陽(yáng)性藥銀杏葉提取物組的大鼠行為學(xué)障礙有明顯改善。mNSS綜合評(píng)分結(jié)果顯示，自給藥d 4開始，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組中劑量組(150 mg·kg-1)大鼠行為學(xué)有明顯改善(P<0.01)；自給藥d 5開始，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組(75，150，300 mg·kg-1)和陽(yáng)性藥組的大鼠行為學(xué)均出現(xiàn)明顯改善(P<0.05，P<0.01)。轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自給藥d 4開始，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組中劑量組(150 mg·kg-1)大鼠行為學(xué)有明顯改善(P<0.05)；自給藥d 6開始，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組(75、150、300 mg·kg-1)和陽(yáng)性藥組的大鼠行為學(xué)均出現(xiàn)明顯改善(P<0.05)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小續(xù)命湯有效成分組的中劑量組首先明顯改善缺血/再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)損傷，對(duì)缺血/再灌注大鼠起到保護(hù)作用；小續(xù)命湯有效成分組各劑量組自MCAO術(shù)后5 d起，能明顯改善缺血/再灌注大鼠上述神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，與模型組相比差異具有顯著性。見Fig 2。

3.4小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響TTC是能與組織中脫氫酶反應(yīng)的脂溶性光敏感復(fù)合物，可通過(guò)染色檢測(cè)動(dòng)物組織中缺血梗死灶大小。經(jīng)TTC染色，正常腦組織呈玫瑰紅色，缺血梗死灶脫氫酶活性低，呈白色。行為學(xué)結(jié)果顯示，小續(xù)命湯有效成分組各劑量組自MCAO術(shù)后5 d起，能明顯改善缺血/再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。因此，我們?cè)谌毖?再灌注后d 5、14 分別測(cè)定大鼠腦梗死體積，以進(jìn)一步確定XXMD對(duì)腦缺血大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的時(shí)間點(diǎn)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織均有明顯的梗死灶。與模型組相比，給藥5 d和14 d時(shí)，小續(xù)命湯有效成分組低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥銀杏葉提取物組均能明顯降低大鼠腦梗死體積百分比(P<0.01)。其中，給藥5 d和14 d時(shí)，小續(xù)命湯有效成分高劑量組降低MCAO大鼠腦梗死體積的效果最好，梗死范圍縮小到33.27%和30.40%(P<0.01),結(jié)果見Fig 3。

3.5小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響大鼠右側(cè)大腦缺血/再灌注造成腦組織能量耗竭和線粒體結(jié)構(gòu)功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織氧化和抗氧化水平失調(diào)。缺血/再灌注術(shù)后5 d時(shí)，缺血核心區(qū)和缺血半暗帶腦勻漿中MDA含量、GSH-Px、SOD和NOS酶活力的測(cè)定結(jié)果如Fig 4所示。MCAO大鼠短暫缺血后，其腦組織MDA含量和NOS活力明顯升高(P<0.01)，GSH-Px和SOD活力明顯下降(P<0.05，P<0.01)。而小續(xù)命湯有效成分給藥組和陽(yáng)性藥EGb 761組能明顯降低缺血/再灌注大鼠腦組織MDA含量(P<0.01，P<0.05)，并且增加其SOD活力(P<0.01)；小續(xù)命湯有效成分低、中劑量組和陽(yáng)性藥EGb 761組能夠降低缺血/再灌注大鼠腦組織NOS活力(P<0.05)；小續(xù)命湯有效成分低、中劑量組和陽(yáng)性藥EGb 761組能夠明顯提高缺血大鼠腦組織的GSH-Px活力(P<0.01，P<0.05)。

Fig 2　Effect of XXMD(75～300 mg·kg-1) on neurological deficit scores in rats following transient ±s,n=15～22)

A：Modified neurological severity scores(mNSS)；B：Corner test(CT).*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

4　討論

缺血性腦卒中是由多因素、多環(huán)節(jié)損傷所致的動(dòng)態(tài)復(fù)雜的疾病，可大致分為缺血急性期、恢復(fù)期和后遺癥時(shí)期。腦卒中急性期和恢復(fù)期的治療，直接關(guān)系到患者的身體健康和生活質(zhì)量。目前，臨床上治療急性腦卒中唯一安全有效的藥物為溶栓藥物—重組組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activa-tor，t-PA)[13]，但是t-PA的治療時(shí)間窗為3～6 h，并且有嚴(yán)重的腦出血并發(fā)癥，其使用受到嚴(yán)重限制[14]。中藥大多通過(guò)挽救缺血半暗帶區(qū)域尚有活力的神經(jīng)組織，改善臨床神經(jīng)功能預(yù)后，發(fā)揮神經(jīng)治療作用，在腦卒中治療中有明顯優(yōu)勢(shì)。但在國(guó)內(nèi)眾多治療腦卒中的中成藥中，治療腦血管病恢復(fù)期的藥物寥寥無(wú)幾。銀杏葉提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)腦循環(huán)和代謝發(fā)揮藥效[15]，用于治療急慢性腦機(jī)能不全，對(duì)腦血管后遺癥有較好療效。中藥復(fù)方制劑小續(xù)命湯針對(duì)缺血腦卒中復(fù)雜的病理環(huán)節(jié)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和臨床療效[4]，在治療腦卒中疾病中具有悠久的歷史和廣闊的前景，但其抗腦缺血損傷的機(jī)制尚不明確。小續(xù)命湯有效成分組是根據(jù)復(fù)方小續(xù)命湯的適應(yīng)癥和缺血腦卒中的病理機(jī)制應(yīng)用多種手段篩選出的治療腦缺血疾病的有效成分組[16]。

Fig 3　Effect of XXMD(75～300 mg·kg-1) on cerebral infarct in rats following transient ±s,n=5)

A：Representive ischemic lesions in the coronal slices with TTC staining on POD 5;B：Representive ischemic lesions in the coronal slices with TTC staining on POD 14;C：The volume percentage of cerebral infarct of rats in different groups.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsmodel group.

Fig 4　Effect of XXMD on content of MDA, enzyme activities of GSH-Px,SOD and NOS in ischemic core area and penumbra tissues of MCAO ±s，n=5)

世界卒中組織(WSO)強(qiáng)調(diào)評(píng)價(jià)藥物最終臨床療效的重要指標(biāo)之一是神經(jīng)行為學(xué)功能恢復(fù)檢測(cè)，因?yàn)檫@既是影響患者生活質(zhì)量的重要問(wèn)題，更關(guān)系到醫(yī)藥學(xué)界治療腦卒中藥物臨床前研究和臨床研究的順利銜接[17]?；谏鲜隹紤]，我們?cè)贛CAO術(shù)后24 h首次給予小續(xù)命湯有效成分組，通過(guò)系列行為學(xué)評(píng)價(jià)手段來(lái)評(píng)測(cè)小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)有無(wú)積極促進(jìn)作用，探討腦缺血后延遲給予小續(xù)命湯有效成分組治療是否有效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血后，大鼠表現(xiàn)為左側(cè)前肢屈曲內(nèi)收和/或行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈的神經(jīng)功能障礙。經(jīng)過(guò)連續(xù)14 d神經(jīng)行為學(xué)缺損評(píng)分，小續(xù)命湯有效成分組能夠使大鼠的Horner癥逐漸減輕，左前肢功能障礙減輕，平衡能力和感覺(jué)功能逐漸恢復(fù)，說(shuō)明小續(xù)命湯有效成分組減輕了缺血/再灌注引起的神經(jīng)功能損傷，且神經(jīng)功能恢復(fù)程度與給藥時(shí)間密切相關(guān)。其中自MCAO術(shù)后d 5起，與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組開始明顯改善MCAO大鼠上述神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，差異具有顯著性。因此，我們?cè)谌毖?再灌注后d 5、14分別測(cè)定大鼠腦梗死體積，以進(jìn)一步確定其對(duì)腦缺血大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的時(shí)間點(diǎn)。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥5 d時(shí)，小續(xù)命湯有效成分各給藥組的神經(jīng)功能有明顯恢復(fù)，腦梗死體積百分比明顯降低，說(shuō)明小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血/再灌注損傷恢復(fù)早期即產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用。

大腦中動(dòng)脈的缺血/再灌注導(dǎo)致腦組織ATP耗竭，線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，產(chǎn)生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)[18]，過(guò)量的ROS進(jìn)一步促使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，加速ROS大量生成[19]，造成腦組織的氧化損傷，MDA含量增高。同時(shí)，過(guò)量的ROS破壞了內(nèi)源性的還原物質(zhì)，降低了GSH-Px和SOD的活力。腦組織缺血/再灌注病理進(jìn)程中，NO既能促進(jìn)恢復(fù)缺血半暗帶區(qū)的供血，減少神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，又能促進(jìn)ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物生成加重腦組織損傷[20]。NOS是催化O2和L-精氨酸合成NO的關(guān)鍵酶，NOS的活力與NO的生成量息息相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥5 d時(shí)，小續(xù)命湯有效成分組能夠降低缺血/再灌注大鼠腦組織中缺血半暗帶和核心區(qū)的MDA含量，提高其GSH-Px和SOD的活力，說(shuō)明小續(xù)命湯有效成分組能夠減輕缺血/再灌注腦組織的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)維護(hù)腦組織內(nèi)源性的抗氧化水平。同時(shí)，缺血/再灌注大鼠模型組腦缺血核心區(qū)和缺血半暗帶組織T-NOS活性明顯提高，各個(gè)給藥組相應(yīng)部位的T-NOS活力明顯減小，說(shuō)明小續(xù)命湯有效成分組可能通過(guò)降低缺血/再灌注腦組織的T-NOS活性來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠損傷恢復(fù)早期即產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，能夠明顯促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，這可能與其調(diào)節(jié)腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們將對(duì)MCAO大鼠腦組織缺血半暗帶和核心區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)的氧化-抗氧化水平研究，并且將對(duì)缺血/再灌注病理進(jìn)程中尤為重要的細(xì)胞器—線粒體的相關(guān)機(jī)制展開進(jìn)一步考察。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)是在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心賀曉麗副研究員的悉心指導(dǎo)和熱忱鼓勵(lì)下完成。在此，衷心的感謝我的導(dǎo)師賀曉麗副研究員，感謝您在實(shí)驗(yàn)中為我指點(diǎn)迷津，開拓思路，幫助我順利完成實(shí)驗(yàn)和論文。同時(shí)，衷心的感謝師兄李鳳金、宋維才、師姐張曉菲對(duì)我的鼓勵(lì)和實(shí)驗(yàn)技能的指導(dǎo)，感謝師妹杜肖和同學(xué)胡亞在我實(shí)驗(yàn)和生活上的幫助和關(guān)心。)

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Neuroprotective effect of active components of Xiaoxuming decoction on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats during early recovery period

LU Chang1, DU Xiao1, HE Xiao-li1, WANG Yue-hua2, DU Guan-hua2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China;2.InstituteofMateriaMedica，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100050，China)

AimTo explore the protective effect of active components of Xiaoxuming decoction(XXMD) on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats during early recovery period.MethodsThe ischemia and reperfusion of middle cerebral artery model rats were established by nylon wire with 2 hours ischemic time on healthy male SD rats. The models of MCAO were evaluated by Zea-Longa′s standard score. The model rats were randomly divided into sham operation group, the ischemia/reperfusion model group, the active components group of Xiaoxuming decoction and the positive group (extract of ginkgo biloba leaves EGb 761). Rats were orally administrated with different drugs 24 h after operation for up to 14 days, once a day. The effect of active components of Xiaoxuming decoction on behavior changes of MCAO rats in different recovery period was evaluated by a series of behavioral assessent methods such as modified neurological severity scores and corner test. The infarct volume was observed by TTC staining. Moreover, the contents of MDA and the activities of GSH-Px, SOD and NOS in the penumbra and core tissues of rat brain were detected by spectrophotometric method.ResultsCompared with the I/R model group，the active components group of XXMD could significantly alleviate the neurological deficit scores with prolonged administration. The motion function tended to be normal, stayed longer on the balance beam, sensory function gradually restored sensitivity, reduced the radio of turning to the right. Among them, compared with model group, the active components of XXMD could effectively improve the neurological dysfunction after five days of administration(P<0.05,P<0.01). Meanwhile, the active components of Xiaoxuming decoction could significantly reduce the infarct volume percentage in the cerebral tissue on post operation day 5 and 14(P<0.01). In addition, the active components of XXMD could reduce the content of MDA and the activity of NOS, increase the activity of SOD and GSH-Px.ConclusionThe active components of XXMD can generate neuroprotective effect in early stage of recovery and may play a major role in regulating the level of oxidative stress in rat brain.

active components of XXMD; cerebral ischemia reperfusion; recovery of neurological function; neurological behavioral evaluation; oxidative stress; neuroprotective effect

2016-02-23,

2016-04-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473586；81202192；81273654)

路暢(1989-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：lu890402@163.com；賀曉麗(1982-)，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)和抗腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，Tel:010-57833233,E-mail：xlhe@implad.ac.cn；杜冠華(1956-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，E-mail：dugh@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.011

A

1001-1978(2016)07-0938-07

R-332；R289.5；R322.81；R743.310.531

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.022.html