SIRT1基因敲除對骨關節(jié)炎小鼠VEGF/AKT信號通路的影響

于斐 曾暉 雷鳴 熊奡 肖德明 袁昊

北京大學深圳醫(yī)院骨關節(jié)科，深圳 518036

骨關節(jié)炎(Osteoarthritis, OA) 是一種以關節(jié)軟骨退變?yōu)樘攸c，導致軟骨基質降解、軟骨細胞死亡和關節(jié)完整性破壞的慢性退行性病變，55歲以上人群的發(fā)病率為44%～70%[1]。目前，對于OA中軟骨退變的具體機制尚未完全闡明，而對其基因水平的研究近年來備受關注。

沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)是一個含有高度保守催化核心序列的基因，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，調控許多下游基因的轉錄，從而起到抑制或激活下游基因、調節(jié)機體代謝、延長壽命和控制細胞分化、再生以及存活等多個方面的生物學效應[2]。其可以通過抑制凋亡、調控新陳代謝、維持氧化應力下線粒體的正常功能以及抑制炎癥等多個方面來調控細胞的衰老[3]。VEGF/AKT通路在生物體中起到重要作用，該通路可以通過血管異常生成加強炎癥的發(fā)生，并通過調節(jié)軟骨細胞的存活和凋亡影響OA中關節(jié)軟骨的退變過程。

本研究應用Cre-Lox系統(tǒng)構建軟骨特異性敲除SIRT1基因(SIRT1 cKO)小鼠，并通過單側膝關節(jié)前交叉韌帶橫斷加內側半月板切除術建立OA模型，觀察SIRT1基因敲除后是否通過VEGF/AKT通路對OA關節(jié)軟骨退變產(chǎn)生影響，探討SIRT1基因通過VEGF/AKT通路調節(jié)OA關節(jié)軟骨退變的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SIRT1co/co小鼠和Col2-CreERT2小鼠均購買自美國杰克遜實驗室。實驗用小鼠飼養(yǎng)于北京大學/香港科技大學醫(yī)學中心深圳醫(yī)院實驗動物中心SPF級屏障區(qū)域的PVC鼠籠內，持續(xù)過濾通氣，自由飲食，清潔飲水，每日保持12 h光照/黑暗循環(huán)。實驗流程和小鼠處理均遵循實驗動物管理規(guī)范條例。

1.1.2主要儀器：光學顯微鏡(德國Leica公司)，高速冷凍離心機(德國SIGMA公司)，高壓滅菌器(日本Hirayama公司)，PCR熱循環(huán)儀(德國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)Dolphin-DOC(美國Weahec公司)，ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，包埋切片機(日本Sakura公司)。

1.1.3主要試劑：VEGF、AKT、SIRT1一抗(Abcam公司),生物素化兔抗山羊IgG、SABC-POD、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，他莫昔芬、玉米油(Sigma公司)，鹽酸賽拉嗪注射液(吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司)，TRE-trizol(Invitrogen公司)， PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa公司)，F(xiàn)ast Green Solution、Safranin O Solution(Scytek公司)。

1.2 方法

1.2.1軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的繁育：將Col2-CreERT2小鼠與SIRT1co/co小鼠交配，獲得Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠(SIRT1+/+小鼠)，15個月月齡Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠腹腔注射Tamoxifen(10mg/ml，1mg/ml·g體重，每日1次，連續(xù)注射5d),即獲得SIRT1 cKO小鼠(SIRT1-/-小鼠)。

1.2.2實驗分組及膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型的建立：Tamoxifen注射完畢7 d后，SIRT1+/+小鼠和SIRT1-/-小鼠行右側膝關節(jié)前交叉韌帶橫斷加內側半月板切除術建立OA模型，SIRT1+/+小鼠左側膝關節(jié)僅切開滑膜囊行假手術作為對照，手術后3個月建立膝關節(jié)OA模型。實驗樣本分為兩組：SIRT1+/+小鼠骨關節(jié)炎模型組(A組，n=6)：SIRT1基因未敲除，膝關節(jié)手術造成OA模型；SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組(B組，n=6)：SIRT1基因敲除，膝關節(jié)手術造成OA模型。模型建立后頸椎脫臼法處死小鼠，留取雙側膝關節(jié)，10%福爾馬林固定后石蠟包埋。

1.2.3熒光定量PCR反應鑒定軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的基因表型: 根據(jù)NCBI網(wǎng)站GeneBank查詢目的基因SIRT1序列，引物合成使用Primer Premier 5.0軟件，序列見表1。cDNA合成采用逆轉錄試劑盒。按照各目的基因退火溫度選擇三步法完成擴增，循環(huán)44次。根據(jù)熔解曲線判斷擴增產(chǎn)物的特異性，以GAPDH為內參。反應參數(shù)參考TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)試劑盒說明進行，運用Bio-Rad CFX96 Real Time PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6數(shù)據(jù)分析軟件，采用2^-ΔΔCt法開展數(shù)據(jù)分析。

表1 熒光定量PCR反應鑒定軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的引物Table 1 SIRT1 gene primers

1.2.4軟骨組織學檢測：組織標本修切后10%多聚甲醛固定24 h，脫鈣后石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚 5 um，行蘇木素-伊紅(HE)、番紅O-固綠雙染色。按照文獻[4]進行Mankin評分。

1.2.5免疫組化染色：烤片3 min；蒸餾水沖洗2次；抗原修復； PBS沖洗3次；滴加過氧化物酶阻斷劑；PBS液沖洗3次；滴加非免疫性動物血清；滴加SIRT1、VEGF和AKT-抗；PBS液沖洗3次；滴加生物素標記的二抗；滴加SP溶液；滴加2滴新鮮配制的DAB溶液。

1.2.6免疫組化結果觀察與判定：SIRT1、VEGF、AKT染色結果判定：經(jīng)DAB顯色，SIRT1、VEGF、AKT免疫組織化學以顯微鏡下染成棕黃色為陽性細胞；將染色強度分為4級：0級：陰性染色，1級：弱陽性染色，2級：中度陽性染色，3級：強陽性染色；再將每張切片中按所見陽性細胞范圍分為5級：0級：無陽性細胞，1級：陽性細胞占l%～20%，2級：陽性細胞占21%～50%，3級：陽性細胞占51%～75%，4級：陽性細胞占76%～100%；每張切片染色積分以兩者乘積表示。

2 結果

2.1 軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的鑒定

剪取A組小鼠和B組小鼠胸骨處關節(jié)軟骨提取總RNA，并通過熒光定量 PCR反應鑒定小鼠基因表型，結果顯示A組小鼠SIRT1 mRNA表達量為8.33467±1.800794，B組小鼠SIRT1 mRNA表達量為2.24417±1.316569，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1)，證實SIRT1-/-小鼠關節(jié)軟骨中SIRT1基因敲除成功。

圖1 實驗中所用小鼠SIRT1表達趨勢及電泳圖Fig.1 The expression of SIRT1 and electrophoresis of SIRT1 in the mice used in the experiment.注：**P<0.01；Note：**P<0.01.

2.2 軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠膝關節(jié)軟骨組織學觀察

A組小鼠對照側軟骨組織層次清楚，關節(jié)表面軟骨平整，軟骨細胞正常，排列較整齊，分布均勻，染色均勻，番紅O染色正常，潮線完整無血管通過，Mankin評分為2.6667±0.51640分；A組小鼠骨關節(jié)炎造模側膝關節(jié)表面軟骨毀損，形態(tài)不規(guī)則，發(fā)生糜爛，軟骨變薄，軟骨細胞分布不均勻，成簇排列，番紅O染色不均勻，血管通過潮線，Mankin評分為7.3333±0.51640分，兩側Mankin評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，證實小鼠骨關節(jié)炎模型建立成功。B組與A組相比膝關節(jié)表面軟骨毀損更嚴重，表面出現(xiàn)斷裂，甚至發(fā)生軟骨層缺失，軟骨細胞數(shù)量減少，番紅O失染，潮線前移且有血管通過，軟骨退變更嚴重，B組Mankin評分為9.8333±1.94079分，與A組相比Mankin評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2、3)。

圖2 各組膝關節(jié)軟骨組織學表現(xiàn)：HE染色，番紅O固綠雙染色，×100。A與D：SIRT1+/+小鼠假手術組膝關節(jié)表面軟骨情況；B與E：SIRT1+/+小鼠骨關節(jié)炎模型組膝關節(jié)表面軟骨情況；C與F：SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組膝關節(jié)表面軟骨情況。Fig.2 The histology of the knee joint cartilage: HE staining and Safranin O-Fast Green staining, ×100.A and D: SIRT1+/+ mice in OA group; B and E: SIRT1+/+ mice in OA group; C and F: SIRT1-/- mice in OA group.

圖3 SIRT1+/+小鼠骨關節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組小鼠膝關節(jié)Mankin評分Fig.3 The Mankin’s score of SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group.注：*P<0.05；Note:*P<0.05.

2.3 SIRT1、VEGF、AKT免疫組化染色

A、B兩組膝關節(jié)軟骨中SIRT1免疫組化染色積分分別為3.6667±1.21106、3.3333±1.96638；VEGF免疫組化染色積分分別為7.0000±1.54919、10.0000±2.44949；AKT免疫組化染色積分分別為3.1667±0.40825、1.3333±1.21106。SIRT1免疫組化結果中，B組與A組比較差異統(tǒng)計學意義不明顯(P>0.05)；VEGF免疫組化結果中，B組與A組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AKT免疫組化結果中，B組與A組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖4、5)。

圖4 各組膝關節(jié)軟骨組織免疫組化，×400。A與B為SIRT1+/+小鼠骨關節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組SIRT1表達情況；C與D為SIRT1+/+小鼠骨關節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組VEGF表達情況；E與F為SIRT1+/+小鼠骨關節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組AKT表達情況。Fig.4 The immunohistochemical images of the knee joint cartilage, ×400.A and B: The expression of SIRT1 in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group; C and D: The expression of VEGF in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group; E and F: The expression of AKT in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group.

圖5 SIRT1+/+小鼠骨關節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關節(jié)炎模型組兩組SIRT1、AKT、VEGF在膝關節(jié)軟骨中免疫組化染色積分。Fig.5 Immunohistochemical staining integral of SIRT1, AKT, and VEGF in the knee joint cartilage in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group.注：**P<0.01，*P<0.05；Note：**P<0.01,*P<0.05.

3 討論

OA以關節(jié)軟骨的退變磨損為主要特征，近年的研究表明長壽基因SIRT1在OA關節(jié)軟骨退變中起重要作用，該基因與衰老關系密切，是多種退行性病變發(fā)生的根源。

SIRT1基因可通過調節(jié)通路中蛋白的乙酰化影響軟骨細胞存活，使軟骨區(qū)域糖蛋白減少，鈣元素沉積加速，導致關節(jié)軟骨退變[5]。OA發(fā)生時，軟骨細胞中SIRT1的表達水平明顯降低，抑制SIRT1表達可引起軟骨細胞凋亡[6]。而凋亡不僅加速成骨細胞和血管進入，還伴有鈣的積累和基質鈣化,加速關節(jié)軟骨病理性退變。因此，SIRT1基因在OA關節(jié)軟骨的退變中起到重要作用。為了研究SIRT1基因的功能及作用機制，我們把軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠，和與其具有相同品系、月齡和飼養(yǎng)條件的SIRT1基因未敲除小鼠作對照，最大限度減少其他因素干擾。而Mankin評分是對OA評價的一種評分標準，分數(shù)越高，OA程度越嚴重，軟骨退變越明顯，結合該評分可以說明骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展程度。為了模擬OA的好發(fā)年齡，我們使用15月齡小鼠進行實驗[7]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，Tamoxifen誘導后小鼠的軟骨組織中SIRT1基因敲除成功，當SIRT1基因敲除后，OA發(fā)生時小鼠的關節(jié)軟骨退變程度更嚴重，Mankin評分與SIRT1+/+小鼠OA模型組相比升高更明顯；SIRT1基因未敲除時，發(fā)生OA關節(jié)軟骨退變的一側膝關節(jié)中SIRT1的表達量顯著下調，Mankin評分與SIRT1+/+小鼠假手術側相比顯著升高。這說明SIRT1基因敲除可以加重OA關節(jié)軟骨的退變，并且實驗中骨關節(jié)炎小鼠模型建立成功，當OA發(fā)生時，關節(jié)軟骨中SIRT1表達水平明顯下調。

VEGF/AKT信號通路作為一個與血管生成密切相關的通路[8]，它在促進血管內皮生成、完整性維持及內皮細胞增殖分化方面起重要作用，同時它還可以影響細胞的衰老凋亡，對病理性退變產(chǎn)生作用。研究證實[9，10]，VEGF可以激活AKT，共同影響新生血管中內皮細胞增值分化，加速新生血管的形成；激活內皮細胞中SIRT1表達后可引起細胞中AKT表達上調，減輕內皮細胞凋亡，血管生成速度減慢，并且用VEGF刺激時，血管內皮細胞的生成又恢復正常，血管生成加速，SIRT1過表達后AKT的磷酸化水平升高，其通過下調氧化應激抑制血管內皮的衰老。

在OA中，VEGF/AKT通路通過血管異常生成加強炎癥發(fā)生，并通過調節(jié)軟骨細胞的存活影響關節(jié)軟骨退變。其中，VEGF誘導的血管生成分布在骨軟骨連接處，該處的血管生成與軟骨退化、疾病活動性相關[11]。在正常組織中，關節(jié)軟骨和軟骨下骨交界處的血管生成和抗血管生成處于平衡狀態(tài)，而OA的滑膜炎癥刺激了血管生成，誘導軟骨發(fā)生退變，導致潮線前移、骨贅形成。隨著軟骨基質被血管侵蝕，VEGF與AKT影響軟骨細胞導致鈣化層內的細胞發(fā)生凋亡， 軟骨基底被新生的骨組織取代。當OA關節(jié)部位骨贅生成時，該區(qū)不僅出現(xiàn)VEGF的表達上調[12]而且在下調的AKT協(xié)同作用下出現(xiàn)軟骨細胞凋亡。也有研究表明[13，14]，在OA中，軟骨變性、軟骨基質成分改變可引起VEGF和AKT作用，導致血管的生成，因炎癥致敏的神經(jīng)纖維又引起炎癥，進一步刺激血管生成；增多的VEGF也引起基質金屬蛋白酶等因子升高，分解軟骨基質，破壞軟骨組織，這些升高的因子又誘導VEGF的表達，形成惡性循環(huán)，加重OA的軟骨退變。而AKT是一個比較保守的基因，可以調節(jié)能量的代謝，與細胞的壽命相聯(lián)。該基因可能反式作用于VEGF的啟動子，促進VEGF的表達分泌[15]；AKT本身可以通過磷酸化下游基因促進軟骨細胞的存活,負向調控p53抑制軟骨細胞凋亡，并可以產(chǎn)生抗凋亡作用，AKT還可降低下游過氧化氫酶的表達，使細胞更易受到活性氧的影響發(fā)生衰老凋亡[16，17]。

那么在OA關節(jié)軟骨的退變中，SIRT1與VEGF/AKT通路是否存在著關聯(lián)？我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因敲除與未敲除兩組小鼠中，當OA發(fā)生時VEGF和AKT的表達量均發(fā)生變化，其中VEGF發(fā)生上調，AKT發(fā)生下調。而當SIRT1基因敲除后，OA發(fā)生時VEGF的上調與AKT的下調比SIRT1基因未敲除時更為顯著。這可能是由于SIRT1基因敲除后VEGF/AKT通路被激活，上調的VEGF與下調的AKT協(xié)同作用引起鈣化區(qū)軟骨細胞向肥大表型分化進而促進軟骨細胞發(fā)生去分化和細胞凋亡[13,16]，而VEGF引起滑膜、關節(jié)軟骨和軟骨下骨連接處異常血管生成并侵入凋亡細胞所在位置[11]，在引起神經(jīng)源性炎癥的同時導致軟骨基質分解、軟骨基底發(fā)生骨化并被新生骨組織取代，潮線前移的同時引起骨贅生成，而骨贅區(qū)軟骨細胞也在VEGF和AKT的作用下出現(xiàn)凋亡[12,16]，進而軟骨組織發(fā)生病理性退變和鈣化，骨贅形成、軟骨基質成分的改變、軟骨的退化又進一步導致VEGF分泌增加而AKT分泌減少，形成惡性循環(huán)，最終加重OA中軟骨組織退變。

OA中關節(jié)軟骨退變的具體機制至今尚未完全闡明，而特定基因如何通過信號通路影響關節(jié)軟骨的變化近年來備受關注。我們在建立膝關節(jié)OA的小鼠模型上闡明了SIRT1基因敲除可能通過激活VEGF/AKT這一通路加重OA關節(jié)軟骨的退化，因此SIRT1基因可能對骨關節(jié)炎起到保護作用，這對于研究骨關節(jié)炎的發(fā)病機制及治療措施具有一定的意義。