健骨方治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

何偉 李博寧 李同生 楊功旭 黎祥勝 彭靜

1.湖北省中醫(yī)院，武漢 430070 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)

膝關(guān)節(jié)退行性骨關(guān)節(jié)炎(KOA)多見于中老年人，是損害人類健康，影響人口勞動(dòng)力和生活質(zhì)量的一個(gè)嚴(yán)重疾病，造成巨大的社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)[1]，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。最近研究表明p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在OA的發(fā)病中也扮演著重要的作用[2]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎屬于“痹證”、“痛痹”、“骨痹”、“鶴膝風(fēng)”等范疇。本研究應(yīng)用名老中醫(yī)李同生祖?zhèn)髅胤浇」欠街委煷笫笙ス切躁P(guān)節(jié)炎。我們采用大鼠前交叉韌帶切斷(ACLT)方法建立OA模型[3],觀察健骨方干預(yù)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD清潔級(jí)大鼠40只，4個(gè)月齡，重達(dá)200±20 g，雌雄比例1∶1，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供(許可證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0009)。將雌雄大鼠隨機(jī)分成四組，隨機(jī)分為正常組、模型組、健骨方組、陽性對(duì)照組。各組動(dòng)物均在同一條件下雌雄分籠飼養(yǎng)，進(jìn)食普通飼料，自然光照，溫度20℃±2℃，濕度50%左右，與實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物的配制

臨床患者一日一劑的健骨方總重為146 g，患者體重70 kg，則患者日用量為2.086 g/kg。據(jù)體表面積等效劑量換算公式[4]：D1=D2×R1/R2×(W2/W1)1/3,計(jì)算出SD大鼠等效劑量為13.45 g健骨方/kg。陽性對(duì)照藥等效劑量為18.43 mg/kg。

制法：為保證中藥有效成分含量，與患者煎藥一樣。健骨方1付，加水沒過藥物2橫指，先煎猴骨等藥物30 min，在下其他中藥煮沸后文火煎煮20 min，過濾。繼續(xù)在中藥中加水沒過藥物2橫指，煮沸后20 min過濾?；旌隙嗡幰?，此法共煎10劑，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

陽性對(duì)照藥配制：取塞來昔布膠囊內(nèi)容物18.43 mg，5%CMC研磨配制成100 ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物處理方法

正常組為假手術(shù)組對(duì)照。其他三組采用Hulth法[3]建立大鼠膝OA模型。術(shù)中注意避免損傷關(guān)節(jié)面軟骨。術(shù)后大腿外側(cè)肌注青霉素8萬U，連續(xù)3 d。術(shù)后第二天，動(dòng)物飲食飲水正常，跛行，傷口無感染。術(shù)后第3天開始，每日驅(qū)趕30 min，持續(xù)驅(qū)趕2 m。而后對(duì)應(yīng)組灌胃給藥，喂藥3月后處死大鼠，取出患側(cè)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)期間不限制飲食，允許其在籠內(nèi)自由活動(dòng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1電泳：取適量RIPA裂解液勻漿組織，測蛋白濃度后，各樣品取50 ug總蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配制12%的PAGE膠電泳。根據(jù)預(yù)染marker顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。

1.4.2轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)：取出凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。按照黑色板-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色板依次放好，夾緊板后放入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)，黑色板的一面對(duì)照黑色負(fù)極。轉(zhuǎn)膜條件：p38-200 mA，100 min。

1.4.3封閉：用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。

1.4.4一抗：用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。p38-1∶400稀釋。

1.4.5二抗：TBST充分洗滌PVDF膜5-6次，5 min/次。用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗-1∶80 000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。

1.4.6顯色曝光：TBST充分洗滌PVDF膜5-6次，5 min/次。每張膜滴加適量的底物液，孵育數(shù)分鐘。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后放入顯影液顯影、定影液定影。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠P38表達(dá)變化。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 12.0版統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS INC)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，單因素方差分析。

2 結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，p38 MAPK 磷酸化產(chǎn)物在模型組持續(xù)表達(dá)，而在健骨方組的 p38 MAPK 磷酸化產(chǎn)物的表達(dá)呈下降趨勢，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 健骨方對(duì)各組膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠P-38表達(dá)的影響Table 1 The effect of Jiangu recipe on expression of p38 MAPK in knee osteoarthritis rats

注：模型組與正常組比較，給藥組與模型組比較*P<0.05
Ps：Compared Model group with normal group，compared Dose group with normal group*(P<0.05)

圖1 不同組別大鼠P-38的表達(dá)結(jié)果(western)Fig.1 The result of p38 MAPK expression in rats

3 討論

1995年,在國際骨性關(guān)節(jié)炎專題會(huì)議上提出了骨性關(guān)節(jié)炎的最新定義[4],即骨性關(guān)節(jié)炎是在力學(xué)因素和生物學(xué)因素的共同作用下,軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)及軟骨下骨三者間分解和合成代謝失衡的結(jié)果。骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病基礎(chǔ)來自軟骨的損傷,關(guān)節(jié)軟骨損傷是啟動(dòng)骨性關(guān)節(jié)炎的首要因素。炎癥介質(zhì)、基質(zhì)和機(jī)械應(yīng)力通過軟骨特定的受體,轉(zhuǎn)導(dǎo)這些信號(hào)到細(xì)胞核,啟動(dòng)基質(zhì)分解酶和炎性基因,但目前骨性關(guān)節(jié)炎具體發(fā)病機(jī)制尚還沒有很充分的闡明，本課題主要認(rèn)為OA發(fā)病過程中起主要作用的炎性介質(zhì)IL-1β和TNF-α通過激活關(guān)節(jié)軟骨p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來發(fā)揮作用[11,12]，健骨方中的有效成分能夠減少P38的表達(dá)從而保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨。

p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在真核細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激活化蛋白激酶,是細(xì)胞外引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一。此信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)(軟骨炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生)、細(xì)胞的生長分化(軟骨細(xì)胞表型的保持和分化，軟骨細(xì)胞的肥大化、鈣化、凋亡以及軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶的合成)過程中具有重要作用，在OA的發(fā)病中扮演著重要的角色[5，7，10]。p38信號(hào)通路在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中可能處于一個(gè)樞紐地位，阻斷或減少p38的表達(dá)會(huì)對(duì)軟骨起到保護(hù)作用[9]。

p38可分為p38α、p38β、p38γ和p38δ等4種，在各種組織中的含量不一。一般所說的p38即是指p38α，普遍存在于各種組織中[8]。p38靜息狀態(tài)主要散在分布于細(xì)胞漿，炎癥信號(hào)激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)[6]，從而啟動(dòng)基質(zhì)分解酶和炎性基因。被炎性介質(zhì)IL-1β和TNF-α激活后能再通過調(diào)節(jié)激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，激活MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-9的活性，加速膠原的病理性降解[13，14,15]，從而造成關(guān)節(jié)軟骨損傷。綜上所述，在OA發(fā)病早期，受損的軟骨細(xì)胞在周圍炎癥因子的作用下激活p38的表達(dá)，p38被炎癥因子激活后通過調(diào)節(jié)激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，MMPs降解軟骨基質(zhì)，使關(guān)節(jié)軟骨的完整性破壞，削弱軟骨抵抗外界機(jī)械應(yīng)力的能力，造成惡性循環(huán)使軟骨細(xì)胞更易暴露于眾多炎性因子的攻擊之下，使軟骨基質(zhì)成分游離出軟骨，軟骨破壞，最終導(dǎo)致軟骨質(zhì)量不斷下降和進(jìn)行性退化，因而通過影響p38 MAPK的表達(dá)，從而對(duì)軟骨細(xì)胞退變起到干預(yù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥復(fù)方健骨方能有效影響p38 MAPK表達(dá)水平，從以上研究結(jié)果可以看出，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與p38MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路密切相關(guān)，通過在信號(hào)通路水平干預(yù)和調(diào)控p38MAPK的表達(dá)和活性，將有希望成為治療膝骨關(guān)節(jié)炎的有效途徑。此外，健骨方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制與調(diào)節(jié)p38MAPK這一細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。中藥復(fù)方健骨方是李同生教授經(jīng)過多年臨床實(shí)踐，治療寒熱骨痹、治虛治實(shí)、治氣治血等多功效和雙相作用。

本研究通過研究健骨方影響p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，闡明健骨方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效與機(jī)制，為臨床更加合理有效的治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供了理論依據(jù)。