兩種硫酸魚精蛋白效價測定方法的比較與分析

劉萍，顧建琴，孫杰，胡，姜珠慧，鄭釗鋮，唐黎明

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

兩種硫酸魚精蛋白效價測定方法的比較與分析

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

目的 分析并比較兩種硫酸魚精蛋白的效價測定方法。方法 分別采用肝素-結(jié)合力滴定法和生物測定法對5批硫酸魚精蛋白進行效價測定，滴定法依據(jù)國外藥典，生物測定法依據(jù)《中國藥典》施行。結(jié)果 肝素結(jié)合力-滴定法的滴定終點吸光度值在中(0.10 mg/mL)、高濃度(0.15 mg/mL)相對穩(wěn)定，效價數(shù)據(jù)的相對標準偏差(RSD)小于5%。三種待測液濃度與肝素標準品滴加量呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為1.000。將滴定法與生物測定法效價結(jié)果進行比較，兩種方法的相關(guān)性顯著(P=0.013)，誤差水平一致(P>0.05)，但滴定法測得的效價數(shù)值略低于生物測定法結(jié)果(P=0.045)。結(jié)論 肝素結(jié)合力-滴定法的方法可行、操作簡便，國內(nèi)應(yīng)積極推廣。

硫酸魚精蛋白；生物測定法；肝素-結(jié)合力滴定法

硫酸魚精蛋白(protamine sulphate)系適宜的魚類新鮮成熟精子中提取的一種堿性蛋白質(zhì)硫酸鹽[1]。本品為強堿性蛋白質(zhì)，帶強陽電荷，能與肝素分子中維持抗凝活性所必需的酸性基團迅速結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而使肝素失去抗凝能力，在心血管外科、肝臟外科等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的重要作用[2-3]?！吨袊幍洹穂4]中現(xiàn)行收載的標準中效價測定方法為兔全血法和豬/兔血漿法。該法需制備新鮮全血或血漿，操作繁瑣，實驗周期長，費時費力，特異性較差[5]，且受到生物差異和主觀終點判定的影響。相比之下，國外藥典均已采用肝素結(jié)合力-滴定法替代原有的生物測定法。該法利用硫酸魚精蛋白與肝素的結(jié)合活性，在硫酸魚精蛋白溶液中逐步滴加肝素。當溶液在可見光區(qū)的吸光度出現(xiàn)顯著增大時，將該吸光度突躍點記為滴定終點，并用該點的肝素加入量計算硫酸魚精蛋白的效價。

目前，肝素結(jié)合力-滴定法已為美國[6]、日本[7]、英國[8]、歐洲藥典[9]所接受，成為國外藥典硫酸魚精蛋白效價測定的常規(guī)方法之一。各國藥典的共通部分是均要求配制硫酸魚精蛋白(原料)的三種濃度待測液(0.15 mg/mL、0.10 mg/mL和0.05 mg/mL)，并在適宜波長下測定三種待測溶液的吸光度，基于吸光度突躍點計算其效價。美國、英國及歐洲藥典對測定波長并未規(guī)定，日本藥方局推薦500 nm。各國藥典對肝素標準品溶液的配制規(guī)定也有所不同。美國藥典規(guī)定肝素標準品濃度為80～120 U/mL，而日本藥典則規(guī)定為20 U/mL。

在我國，硫酸魚精蛋白注射液是臨床外科手術(shù)中用于中和肝素的手術(shù)必備藥品，然而由于生產(chǎn)企業(yè)少，藥品價格較低等原因，國內(nèi)曾出現(xiàn)市場短缺現(xiàn)象?！吨袊幍洹芬蟛捎蒙餃y定法檢測硫酸魚精蛋白及其注射液效價，使生產(chǎn)企業(yè)面臨試驗條件匱乏、操作困難的難題。因此，為順應(yīng)藥典簡化和減少生物測定法的趨勢[10]，并與國際接軌推行肝素結(jié)合力-滴定法，本研究致力于比較滴定法與生物測定法的異同，并對兩種方法結(jié)果的一致性進行討論，為《中國藥典》中硫酸魚精蛋白效價測定的方法修訂提供有效的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 肝素結(jié)合力-滴定法

1.1.1 儀器及試劑：Sartorius CP225D型電子天平(德國賽多利斯有限公司)，UV2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)。肝素鈉標準品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號：150509-200912)，每毫克相當于197 IU。水為滅菌注射用水，5批硫酸魚精蛋白及注射液由國內(nèi)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)提供，其中原料3批，注射液2批。

1.1.2 測定方法：根據(jù)國外藥典USP38、EP8.0、JP16等，每批原料(Y)精密稱取3份硫酸魚精蛋白粉末樣品，每份樣品用滅菌注射用水配制0.15、0.10和0.05 mg/mL 3個濃度的待測液，各濃度平行測定兩次。制劑(Z)按標示量配制三份0.15 mg/mL的待測溶液，每份樣品同樣平行測定兩次。取2.0 mL(Vs)待測液，置于比色杯內(nèi)并滴加肝素鈉標準品溶液，在500 nm處測定吸光度值，記錄加入肝素鈉標準品溶液體積和待測液的吸光度值。連續(xù)滴加，直至待測液吸光度值出現(xiàn)顯著升高。將每次滴定前后的吸光度值躍變差值ΔA的最大值點記為突躍點，并將該點作為滴定終點。記錄滴定終點處累計加入肝素鈉標準品溶液體積(VT)，并按下式計算硫酸魚精蛋白效價：

測得效價=(VT×CT)/(VS×CS)，其中VT：加入肝素鈉標準品的體積(mL)；CT：肝素鈉標準品的濃度(U)；VS：待測樣品的體積(mL)；CS：待測樣品的濃度(mg/mL)

原料應(yīng)計算三種濃度待測液和各份樣品測定結(jié)果的平均值和標準差，所有效價測定結(jié)果的平均值即為硫酸魚精蛋白供試品(干燥品)1 mg中和肝素的效價(單位)。制劑應(yīng)計算0.15 mg/mL濃度測定結(jié)果的平均值和標準差，全部效價結(jié)果的平均值即為制劑的效價(單位)。

1.2 生物測定法

1.2.1 實驗動物：新西蘭家兔，體質(zhì)量約2.0～2.5 kg，雌雄均可，雌者需無孕，由上海奉賢輝煌養(yǎng)殖場提供。試驗前在實驗動物室適應(yīng)性飼養(yǎng)至少3天。

1.2.2 測定方法：根據(jù)《中國藥典》(2015年版)和《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范(2010年版)》[11]中的硫酸魚精蛋白生物測定法，取新鮮兔全血，并配制肝素標準品溶液(系滴定法同批標準品)和硫酸魚精蛋白供試品溶液(1 mg/mL)。測定法及結(jié)果判斷嚴格按照《中國藥典》執(zhí)行，觀察并記錄各管凝結(jié)時間。每批樣品重復(fù)5次。5次結(jié)果的平均值即為硫酸魚精蛋白供試品(干燥品)1 mg中和肝素的效價(單位)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計方法運用SPSS 19.0進行操作。2種測定方法的相關(guān)性檢驗采用Pearson相關(guān)分析，同批樣品兩種方法測得的數(shù)據(jù)的差異運用配對樣本t檢驗進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝素結(jié)合力-滴定法結(jié)果

2.1.1 3批原料樣品與2批制劑樣品效價結(jié)果：肝素結(jié)合力-滴定法測得的硫酸魚精蛋白效價結(jié)果如表1所示。3批原料樣品的效價平均值分別為132.28、141.73和132.25 U/mL，相對標準偏差(RSD)分別為1.38%、1.10%和1.19%。2批制劑樣品的效價平均值分別為100.56和136.11 U/mL，RSD分別為1.71%和0.63%。5批樣品的RSD均在5%以下。

表1 肝素結(jié)合力-滴定法測得的硫酸魚精蛋白效價結(jié)果Tab.1 The potency results of heparin titration method

2.1.2 3批原料樣品滴定終點吸光度結(jié)果：三種濃度硫酸魚精蛋白待測液的滴定終點吸光度有所不同。如表2所示，當待測液濃度為0.15 mg/mL，滴定終點的吸光度值多在0.5～0.8之間，且3批原料供試品(0.15 mg/mL)滴定終點的RSD分別為6.87%、17.63%和7.53%；當待測液濃度為0.10 mg/mL時，滴定終點的吸光度值在0.2～0.5之間，三份樣品的RSD分別為3.31%、25.36%和22.32%；當待測液濃度為0.05 mg/mL時，終點吸光度值始終在0.2以下，且RSD較高，有兩份樣品的RSD達24.21%和28.21%。根據(jù)以上數(shù)據(jù)計算，0.15 mg/mL、0.10 mg/mL和0.05 mg/mL待測液的平均RSD分別為10.68%、16.99%和22.25%。由此可知0.05 mg/mL待測液的滴定終點吸光度值的穩(wěn)定性低于其他兩種濃度待測液。

表2 硫酸魚精蛋白不同濃度待測液滴定終點吸光度值Tab.2 The absorbance at the end-point of different test solutions

2.2 回歸分析

2.2.1 各濃度滴定終點吸光度和肝素加入體積回歸分析：根據(jù)各濃度滴定吸光度和肝素加入體積繪制吸光度變化曲線圖。如圖1所示，各濃度滴定終點前4個點的吸光度值均在0.2以下，且吸光度值十分接近。當躍變發(fā)生時，待測液濃度越大，其吸光度的變化越顯著，肉眼也能觀察到比色杯中白色渾濁出現(xiàn)。對三種濃度的滴定終點吸光度-肝素加入體積進行回歸分析，可見良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.991，說明加入肝素標準品的體積與硫酸魚精蛋白待測液的滴定終點吸光度成正比，因此滴定終點吸光度值可以作為指示硫酸魚精蛋白中和肝素的敏感指標。

圖1 三種濃度硫酸魚精蛋白待測液的滴定曲線圖Fig.1 The relationship of the absorbance with volumes oftitrant at three test solutions

2.2.2 供試品待測液濃度和肝素加入體積的回歸分析：對供試品待測液濃度和肝素加入體積進行回歸分析，結(jié)果見圖2。相關(guān)系數(shù)R2為1.000，回歸方程為y=2640x+0.5。該結(jié)果表明肝素結(jié)合力-滴定法在待測液不同濃度有良好的線性關(guān)系，適于多種濃度硫酸魚精蛋白的效價分析。

圖2 三種濃度硫酸魚精蛋白與肝素加入體積線性關(guān)系圖Fig.2 The Linear relationship of three test solutions with volumes of heparin titrant(±s,n=6)

2.3 肝素結(jié)合力-滴定法與生物測定法結(jié)果比較 為比較滴定法與生物測定法測得結(jié)果的一致性，同批樣品分別采用兩種方法進行效價測定。生物測定法每批樣品重復(fù)5次，共5個結(jié)果。結(jié)果見表3，3批原料樣品的效價平均值分別為144.00、146.00和146.00 U/mL,RSD分別為2.91%、1.53%和2.87%。2批制劑樣品的效價平均值分別為105.00和137.00 U/mL，RSD分別為0.00%和2.00%。生物測定法的RSD水平與滴定法(表1)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，兩者誤差大小一致。

運用Pearson相關(guān)分析進一步檢驗兩種方法的相關(guān)性，結(jié)果顯示Pearson相關(guān)系數(shù)為0.951，兩種方法的相關(guān)性顯著(P=0.013)。運用配對樣本t檢驗比較同批樣品兩種方法測得的數(shù)據(jù)是否存在差異。檢驗結(jié)果顯示，滴定法測得的硫酸魚精蛋白效價水平顯著低于生物測定法結(jié)果(P=0.045)。

表3 硫酸魚精蛋白生物測定法效價結(jié)果Tab.3 The potency results of biological assay

3 討論

本研究采用肝素結(jié)合力-滴定法和生物測定法檢測并比較了5批硫酸魚精蛋白原料及制劑的效價。結(jié)果顯示，肝素結(jié)合力-滴定法雖然在低濃度時的滴定終點吸光度值誤差較大，但中、高濃度的滴定終點吸光度值相對穩(wěn)定；高中低三種濃度測得的效價數(shù)據(jù)相對標準偏差小，待測液濃度與肝素標準品滴加量呈顯著的線性關(guān)系，提示該方法線性與專屬性良好。與生物測定法進行結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)，兩種方法的誤差水平一致，且數(shù)據(jù)呈顯著相關(guān)性。

肝素結(jié)合力-滴定法和生物測定法都建立在硫酸魚精蛋白與肝素分子具有結(jié)合活性的基礎(chǔ)上。但是兩種方法的原理和性質(zhì)卻大相徑庭。首先，生物測定法的試驗體系是新鮮兔全血或豬/兔血漿，一定量的魚精蛋白和不同肝素劑量混合后，再加入新鮮血液與之作用。生物測定法的優(yōu)點是提供了與臨床療效一致的藥品的生物活性信息，可監(jiān)測不曾預(yù)料、不易發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象變化，在生化藥品的鑒別、純度、安全、活性、效價和穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用[12]。但是其缺點是存在生物變異帶來的實驗誤差，例如本試驗采用的動物和基底血液的差異會直接導(dǎo)致測定結(jié)果不同。另一方面，魚精蛋白還能與生物體內(nèi)的粘多糖、核酸以及纖維蛋白原等物質(zhì)結(jié)合。如果基底血液中已經(jīng)存在肝素或非正常水平的粘多糖就會造成實驗結(jié)果偏差[13]。

相比之下，肝素結(jié)合力-滴定法不使用血液或血漿，利用魚精蛋白和肝素結(jié)合后產(chǎn)生復(fù)合物的特點，將吸光度躍變值最大的一點定為滴定終點。該法避免了生物變異帶來的偏差，且用儀器測定代替了肉眼觀察終點，方法相對客觀，操作簡便。但是由于分光光度計測定值的最佳范圍在0.3～0.7之間，故滴定終點吸光度值如果低于0.3或高于0.7就會引入一定誤差。在本研究中可見0.05 mg/mL待測液的滴定終點吸光度值相對偏差較大。另一方面，當吸光度值發(fā)生躍變時，由于吸光度值改變速度較快，因此肝素標準品加入至吸光度測定之間的等待時間如有不同，也會對滴定終點吸光度值的判定帶來影響。除此之外，肝素滴定液加入體積大則試驗誤差大，在小濃度待測液中如果一次滴加過量肝素，會造成躍變點被掩蓋的現(xiàn)象，導(dǎo)致吸光度值改變不明顯?；谝陨锨闆r，本研究在滴定0.15、0.10及0.05 mg/mL待測液時，分別采用不同的肝素滴加體積(10、5和2 μL)，并且嚴格規(guī)定肝素標準品加入至吸光度測定之間的等待時間為30 s，據(jù)此得出精密度較高的滴定法效價結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)滴定法和生物測定法的數(shù)據(jù)呈顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.951，該結(jié)果說明滴定法和生物測定法數(shù)據(jù)呈線性相關(guān)性，即用生物測定法得出的效價水平越高，用滴定法也能得出較高水平。然而另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)滴定法測得的效價水平低于生物測定法的數(shù)值。造成該差異的原因除了方法原理和性質(zhì)不同外，還可能受到了終點判定方式的影響。生物測定法要求在試驗前進行魚精蛋白效價預(yù)測。當魚精蛋白和肝素混合后，應(yīng)立即搖勻并放置1 min后觀察。如全部管均出現(xiàn)不透明渾濁，則肝素劑量應(yīng)加大，直到出現(xiàn)半透明渾濁管[14]。生物測定法的終點管往往介于不透明渾濁管和半透明渾濁管之間。相比之下，滴定法依據(jù)的是魚精蛋白和肝素結(jié)合后渾濁出現(xiàn)的躍變點，且需在短時間內(nèi)盡快測定吸光度值。因此，滴定法的判定終點可能出現(xiàn)在生物測定法之前。另外，本研究的硫酸魚精蛋白比對樣品僅為5批，結(jié)果可能受限于樣本量較小帶來的誤差，其統(tǒng)計學(xué)差異P值也僅為0.045，差異判定的強度較弱。因此，滴定法和生物測定法是否真正存在差異，還需未來進一步研究。

綜上，肝素結(jié)合力-滴定法的精密度、線性與專屬性均良好，采用的試劑和儀器在我國實驗室內(nèi)普遍，操作省時省力，易于推廣。雖然測得的效價結(jié)果低于生物測定法，但兩種方法的相關(guān)性顯著，相對標準偏差大小一致，且滴定法的實驗誤差易于控制，實用性優(yōu)秀?，F(xiàn)今，隨著全球?qū)游锉Ｗo意識的提高和3R原則[15]的廣泛施行，用理化方法取代生物測定法已經(jīng)是生產(chǎn)、技術(shù)、環(huán)境等多方面的共同要求。在未來的生化藥品檢測中，生物測定法可以逐步轉(zhuǎn)化為輔助理化方法的定性或半定量測定，使兩種方法共同在生化藥品的效價檢測中發(fā)揮積極作用。

[1] 傅紅霞,杜榮茂,應(yīng)鐵進,等.魚精蛋白的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展前景[J].食品科技,2003(4)：25-27.

[2] 肖祥勝,張躍民.魚精蛋白用于中和肝素時的副反應(yīng)[J].醫(yī)學(xué)信息：醫(yī)學(xué)與計算機應(yīng)用,2001,14(8)：517-519.

[3] 謝安,魏蔚.魚精蛋白的應(yīng)用現(xiàn)狀及存在的問題[J].中國胸心血管外科臨床雜志,2016,23(1)：78-82.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版四部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[5] Snycerski A,Dudkiewicz-Wilczynska J, et al.Determination of protamine sulphate in drug formulations using high performance liquid chromatography[J].J Pharm Biomed Anal,1998,18(4-5)：907-910.[6] The United Stateds Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia(USP 38)[S].Baltimore：United Book Press,2015.

[7] Society of Japanese Pharmacopeia.Japanese Pharmacopoeia XVI[S].Tokyo：YAKUJINIPPO,2011.

[8] British Pharmacopeia Commission Office.British Pharmacopoeia[S].London：The Stationery Office,2014.

[9] Council of Europe.European Pharmacopoeia 8.0[S].N?rdlingen：Druckerei C.H.Beck,2014.

[10] 李湛軍,范慧紅,徐康森.2010版藥典生化藥品的生物測定和安全性檢查的剖析[J].藥物分析雜志,2010(11)：2241-2245.

[11] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范(2010年版)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[12] 王亞敏.生物檢定在藥品質(zhì)量標準中的作用[J].中國生化藥物雜志,2007,28(2)：133-136.

[13] Jaques LB.Protamine-antagonist to heparin[J].Canadian Medical Association Journal,1973,108(10)：1291-1297.

[14] 冷煒.藥品的生物檢定[M].北京：氣象出版社,1995.

[15] Balls M.3R和仁慈準則[M].北京：科學(xué)出版社,2014.

(編校：王儼儼)

Comparison and analysis of two potency assay methods of protamine sulfate

LIU Ping, GU Jian-qin, SUN Jie, HU Yue, JIANG Zhu-hui, ZHENG Zhao-cheng, TANG Li-mingΔ

(Shanghai Institute for Drug and Food Control,Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo analyze and compare two potency assay methods of protamine sulfate.MethodsHeparin titration method was according to foreign pharmacopoeia,while biological assay method was according to China pharmacopoeia(2015).ResultsThe absorbance at the end-point was stable at 0.10 mg/mL and 0.15 mg/mL test solutions.The relative standard deviations(RSDs)of potency results were all less than 5%.Three test solutions and volumes of the titrant had a good linear relationship(R2=1.000).The results of titration method were significantly related to those of biological assay(P=0.013),with similar RSD(P>0.05).However,the potency of titration method were significantly lower than those of biological assay(P=0.045).ConclusionHeparin titration method is good-using,convenient,and need to be applied widely at home.

protamine sulfate;biological assay;heparin titration method

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.041

劉萍，女，博士，檢驗員，研究方向：藥理毒理，E-mail：liuping19876@163.com；唐黎明，通信作者，男，碩士生導(dǎo)師，主任藥師，研究方向：藥理毒理，E-mail：tangliming@smda.gov.cn。

R927.11；R973.2

A