HIF-1α對病理性瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活力的影響及機制

胡強，隋爽，王國棟，姚利民

(解放軍第107醫(yī)院 燒傷整形科，山東 煙臺 264000)

HIF-1α對病理性瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活力的影響及機制

胡強Δ，隋爽，王國棟，姚利民

(解放軍第107醫(yī)院 燒傷整形科，山東 煙臺 264000)

目的 探究低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)在病理性瘢痕疙瘩發(fā)生中的具體作用機制，尋找瘢痕疙瘩治療的重要靶位點。方法 Real time PCR和Western blot檢測正常組織和瘢痕疙瘩中HIF-1α的mRNA及蛋白表達。MTT法檢測不同氧濃度環(huán)境下(20%、10%、5%、2%和1%)正常組織和瘢痕疙瘩中成纖維細胞的活性，檢測瘢痕疙瘩在5%低氧環(huán)境與20%正常氧環(huán)境下HIF-1α的mRNA及蛋白表達。HIF-1α shRNA病毒沉默HIF-1α后采用流式細胞儀檢測5%低氧環(huán)境下瘢痕疙瘩中成纖維細胞的數(shù)量變化。結(jié)果 Real time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示瘢痕疙瘩成纖維細胞中HIF-1α的表達較正常組織明顯升高(P<0.05)，且在低氧環(huán)境中(氧濃度5%、2%和1%)的成纖維細胞活性較正常組織顯著升高(P<0.05)。瘢痕疙瘩中成纖維細胞中HIF-1α的mRNA及蛋白表達在5%低氧環(huán)境顯著高于20%正常氧環(huán)境(P<0.05)。當沉默瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達后，5%低氧環(huán)境中的成纖維細胞凋亡數(shù)量顯著高于對照組[(0.021±0.001)% vs.(3.739±0.039)%,P<0.05]。結(jié)論 HIF-1α在病理性瘢痕疙瘩成纖維細胞中顯著升高且促進成纖維細胞的增殖及活力，對瘢痕疙瘩的形成具有一定的促進作用。

HIF-1α；瘢痕疙瘩；成纖維細胞；增殖

病理性瘢痕疙瘩是整形外科學常見的臨床并發(fā)癥，且由于病理性瘢痕疙瘩成纖維細胞具有過度增殖能力導致術(shù)后瘢痕的不可控性[1]，同時成纖維細胞分泌大量膠原，導致瘢痕疙瘩對周邊壓迫以及瘢痕攣縮可導致不同程度的功能障礙，造成患者術(shù)后的諸多不適[1-2]。盡管目前國內(nèi)外眾多學者開始對瘢痕進行更為細致深入的研究[3]，如二甲雙胍可能對瘢痕疙瘩的形成有抑制作用[4]，但是由于病理性瘢痕疙瘩是一個逐漸進展的受眾多基因調(diào)控的病理過程[5]，目前對于病理性瘢痕疙瘩的形成機制尚不明確，同時對于瘢痕疙瘩的治療亦是一個科學難題。

對于病理性瘢痕疙瘩的形成，可以歸結(jié)為3個方面：瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及活性較高，膠原合成功能旺盛以及具有一定的內(nèi)分泌功能。瘢痕愈合過程中主要的效應細胞為成纖維細胞，且瘢痕組織中該細胞的增殖和合成分泌功能多較為活躍，細胞的過度增殖和膠原的過度堆積最終導致創(chuàng)面修復過度，形成病理性瘢痕。對于這一個病理過程最重要的調(diào)控因素即低氧，而低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)作為一個重要的低氧條件下的響應因子，可以調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)錄組基因，包括血管生成因子、代謝酶等基因[6]，介導缺氧條件下細胞周期進程和信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控[7-8]。本研究旨在探究HIF-1α在病理性瘢痕疙瘩發(fā)生中的具體作用機制，尋找瘢痕疙瘩治療的重要靶位點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本的收集：所有標本均來自本院2013年10月～2014年6月期間在整形外科燒傷瘢痕疙瘩修復手術(shù)的患者標本，共10例，年齡25～63歲，作為病例組；同時選擇同期因其他疾病進行手術(shù)切除的手術(shù)標本周邊的正常皮膚組織8例，年齡19～65歲，作為正常對照組進行研究，取材部位均為耳后部皮膚，皮膚大小長約0.5 cm，寬約0.5 cm。所有病例組入組者術(shù)前均未進行任何的瘢痕疙瘩的手術(shù)以及藥物治療，且標本經(jīng)病理科醫(yī)生切片觀察，鑒定為瘢痕疙瘩。所有入組者均無局部皮膚的感染以及潰瘍，無皮膚病、免疫性疾病、甲狀腺疾病以及垂體和腎上腺疾??；所有入組者近期均未服用相應的激素、抗生素以及免疫抑制相關(guān)藥物。與所有入組者說明取標本的目的以及研究的性質(zhì)，征得患者的同意并簽署患者知情同意書，并通過了醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.1.2 試劑：M199培養(yǎng)基、胰酶購自Thermo公司，胎牛血清購自Ausgenex公司，MTT試劑盒購自上海煊翎有限公司，HIF-1α抗體以及tubulin抗體購自上海銀海圣生物科技有限公司。HIF-1αsiRNA病毒購買于上海吉瑪有限公司。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green和DEPC水購自Invitrogen公司，氯仿、異丙醇和乙醇購自上海潤捷化學試劑有限公司。

HIF-1α引物以及actin引物使用Primer 5.2設計并合成于上海吉瑪有限公司，引物序列如下:

HIF-1α forward:ACTTCTTAGCCCGATCGATGCA;

HIF-1α reverse:ACTTGCATCGATCGATCAATCG;

actin forward:ACCGTCCCGTTGTGGAACTGCTG;

actin reverse:CTGATCGTCGCACCCTGCATGTGT。

1.2 方法

1.2.1 原代成纖維細胞的提取：所有手術(shù)標本在無菌條件下取材后立即剪成小塊(體積約1 mm3)，用培養(yǎng)液沖洗后接種于M199培養(yǎng)液中，加入20%的胎牛血清，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在接種的5～7 d后在小塊周圍長出的生長暈即為成纖維細胞(成纖維細胞為細長狀，用Real time PCR檢測波形蛋白vimentin作為成纖維細胞標志物[9])，將鋪滿培養(yǎng)皿的成纖維細胞用胰酶消化后進行傳代。

1.2.2 檢測正常組織和瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達：分別將正常組織和瘢痕疙瘩中提取的成纖維細胞傳代，鋪板，待細胞匯聚度約80%時提取細胞RNA和蛋白，Real time PCR和Western blot分別檢測HIF-1α在mRNA和蛋白水平的含量，實驗重復進行3次。

1.2.3 檢測不同氧濃度下正常組織和瘢痕疙瘩中成纖維細胞的活性：分別將正常組織和瘢痕疙瘩中提取的成纖維細胞傳代，鋪板，待細胞匯聚度約60%時，將細胞培養(yǎng)皿(10%FBS的DMEM)放入低氧裝置中，使用缺氧/低氧培養(yǎng)裝置(Billups-rothenberg公司，MIC-01)設置不同氧濃度20%、10%、5%、2%、1%，其中20%作為正常氧濃度，其他為低氧濃度，37 ℃低氧培養(yǎng)4h后利用MTT實驗檢測不同氧濃度下細胞的活性。實驗重復進行3次，MTT實驗步驟參照試劑盒說明。

1.2.4 檢測低氧環(huán)境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達：分別將正常組織和瘢痕疙瘩中提取的成纖維細胞傳代，鋪板，待細胞匯聚度約60%時，將細胞培養(yǎng)皿放入低氧裝置中，設置低氧濃度為5%，同時將20%作為正常氧濃度，培養(yǎng)4 h后提取細胞RNA和蛋白，檢測低氧濃度下HIF-1α mRNA和蛋白水平的表達，實驗重復進行3次。

1.2.5 病毒轉(zhuǎn)染：在目的細胞中(細胞濃度為1.87×106/mL)加入6×107pu的HIF-1α shRNA病毒液10 μL，在對照細胞中(細胞濃度為1.59×106/mL)加入5×107pu shRNA載體病毒10 μL，混勻后放于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)孵育48 h。

1.2.6 MTT法檢測細胞存活率：收集對數(shù)期細胞，鋪板(48孔板)，低氧處理后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)培養(yǎng)5 h后再每孔加入200 μL二甲基亞砜，為了使結(jié)晶物充分溶解，將細胞培養(yǎng)板置搖床上低速振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀(深圳雷杜，Rayto RT-6000)570 nm處測量各孔的吸光度值。

1.2.7 流式細胞計數(shù)法計算細胞數(shù)量：為了檢測HIF-1α對成纖維細胞增殖的影響，利用流式細胞計數(shù)儀檢測5%低氧環(huán)境下HIF-1α siRNA沉默后的瘢痕疙瘩中成纖維細胞數(shù)量，首先將病毒感染后48 h的細胞制備細胞懸液，分別在細胞懸液中加入2 μL PI,分裝于專用的流式管中進行檢測，每一進樣重復3次，以未染PI的細胞為陰性對照，檢測細胞染PI的陽性率。

1.2.8 Real time PCR檢測HIF-1α mRNA表達：TRIzol法抽提總RNA。經(jīng)過TRIzol裂解，氯仿去除蛋白，異丙醇沉淀RNA，75%乙醇(用DEPC水配)洗滌沉淀，最后用DEPC水溶解RNA。然后兩步法反轉(zhuǎn)RNA，首先RNA和random primer以及dNTP 65 ℃ 5 min,冰浴4 min后，加入M-MLV Buffer、DTT、Rnase out、M-MLV總體積20 μL進行反轉(zhuǎn)錄。最后應用熒光實時定量PCR儀(Thermo Ficher,9600型)檢測HIF-1α mRNA的表達。

1.2.9 Western blot檢測HIF-1α蛋白表達：按照實驗操作步驟，進行細胞蛋白抽提，蛋白樣品處理，蛋白樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、HIF一抗孵育(1:1 000)、山羊抗小鼠IgG二抗孵育(1:5 000)、 膠片的壓片檢測、凝膠圖象掃描(愛普生，V550)分析。

2 結(jié)果

2.1 正常組織和瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達 正常組織和瘢痕疙瘩中成纖維細胞Real time-PCR(圖1A)和Western blot(圖1B)結(jié)果顯示：在瘢痕疙瘩成纖維細胞中HIF-1α在mRNA水平的表達含量較對照組(2.48±0.54 vs.1.00±0.12)及蛋白質(zhì)水平的表達含量(2.33±0.31 vs.1.00±0.23)均顯著升高(P<0.05)，這表明HIF-1α在瘢痕疙瘩中的發(fā)生和發(fā)展中具有一定的作用。

圖1 正常組織和瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達(n=3)*P<0.05，**P<0.01，與正常組織比較Fig.1 The expression of HIF-1α in normal tissue and pathological scar(n=3)*P<0.05，**P<0.01，compared with normal tissue

2.2 不同氧濃度下正常組織和瘢痕疙瘩中成纖維細胞的活性 MTT結(jié)果顯示，在低氧培養(yǎng)條件下，隨著氧濃度的降低，病理性瘢痕成纖維細胞細胞仍保持較高活性，而正常組織的成纖維細胞隨著氧濃度的升高，細胞活性明顯降低，2組之間有明顯的差異[5%(0.21±0.03 vs.0.11±0.02)，2%(0.18±0.02 vs.0.07±0.01)，1%(0.15±0.01 vs.0.04±0.01),均P<0.05]。見圖2。

圖2 不同氧濃度下正常組織和瘢痕疙瘩中成纖維細胞的活性(n=3)*P<0.05，與正常組織比較Fig.2 The activity of fiber cell in pathological scar and normal tissue under different oxygen concentration(n=3)*P<0.05，compared with normal tissue

2.3 低氧環(huán)境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達 由2.2中結(jié)果可看出，在5%低氧濃度時，正常對照組成纖維細胞活性明顯降低，因此將低氧環(huán)境設為5%氧濃度，將正常氧濃度定為20%作為對照，檢測低氧環(huán)境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達。由HIF-1α基因的Realtime-PCR和Western blot結(jié)果可知，在低氧濃度培養(yǎng)的病理性瘢痕疙瘩成纖維細胞中HIF-1α，無論是在mRNA水平(見圖3A)還是在蛋白質(zhì)表達水平(見圖3B)，其表達均明顯高于正常氧濃度環(huán)境，差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 低氧環(huán)境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表達(n=3)*P<0.05，與正常氧環(huán)境比較Fig.3 The expression of HIF-1α in pathological scar in hypoxic environment(n=3)*P<0.05，compared with normal oxygen concentration

2.4 檢測HIF-1α shRNA病毒沉默效果 利用HIF-1α shRNA病毒轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩中成纖維細胞，48 h后檢測HIF-1α shRNA病毒沉默效果，發(fā)現(xiàn)較對照組，HIF-1α shRNA病毒在mRNA水平(1.00±0.21vs.0.48±0.43)和蛋白質(zhì)水平(1.00±0.43vs.0.38±0.37)均顯著抑制HIF-1α的表達(P<0.05)，表明HIF-1α shRNA病毒有效沉默HIF-1α基因表達。見圖4。

圖4 HIF-1α shRNA病毒沉默效果(n=3)*P<0.05，與對照組比較Fig.4 The silence effect of HIF-1α shRNA virus(n=3)*P<0.05，compared with control group

2.5 HIF-1αshRNA沉默后的瘢痕疙瘩中成纖維細胞的數(shù)量變化 流式結(jié)果顯示，與對照組(0.021±0.001)%比較，HIF-1αshRNA沉默組瘢痕疙瘩中成纖維細胞的凋亡數(shù)量明顯增加(3.739±0.039)%，差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖5。

圖5 HIF-1αshRNA沉默后的瘢痕疙瘩中成纖維細胞的凋亡變化Fig.5 The changes of the number of fibroblasts after the silence of HIF-1α

3 討論

病理性瘢痕疙瘩是由于細胞增殖、細胞分泌、細胞分化與細胞凋亡等過程紊亂所致的組織細胞的異常生長所致。當機體受到創(chuàng)傷，機體會調(diào)動一切因素，促進自愈。因此瘢痕組織中細胞的代謝速率較高，同時由于瘢痕組織中血管新生是一個血管內(nèi)皮細胞的激活、增殖、遷移、重建形成新血管和血管網(wǎng)的復雜過程，其進程較慢，且瘢痕疙瘩中的血管較正常組織中明顯較少，最終導致高代謝的瘢痕組織呈現(xiàn)低氧狀態(tài)，因此低氧是病理性瘢痕疙瘩形成的關(guān)鍵病理因素之一。

細胞對缺氧的基本的適應性改變是改變一系列基因的表達，改變細胞的代謝水平，這是哺乳動物正常生理機能所必需的[10]。在阻止正常細胞分裂的同時，低氧耐受細胞的增殖以及活性增加對于自身生存能力的維護也是必要的。許多的研究報道指出，缺氧條件下細胞阻滯或增殖是由特定的細胞系、低氧張力決定的[11]，而HIF-1α是調(diào)控這一復雜過程的重要介導因子，不僅參與調(diào)控低氧條件下眾多基因的改變，而且在腫瘤血管形成、腫瘤組織的低氧代謝以及侵襲轉(zhuǎn)移中均具有極其關(guān)鍵的作用[12]。HIF-1是一種異源二聚體，能持續(xù)性表達芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT )和低氧誘導因子(HIF-1α)。HIF-1α受細胞O2濃度的影響改變其轉(zhuǎn)錄活性。在常氧條件下，HIF-1α半衰期不到5min。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是通過兩個脯氨酸殘基羥基化進行調(diào)節(jié)的，并受脯氨酰羥化酶家族的控制。HIF-1α的脯氨酰羥化酶在常氧條件下可以導致VHL蛋白的粘合和蛋白體的退化[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩成纖維細胞中HIF-1α在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達含量均顯著高于正常皮膚組織(P<0.05)，且低氧濃度培養(yǎng)的病理性瘢痕疙瘩成纖維細胞中HIF-1α表達水平明顯高于正常皮膚成纖維細胞(P<0.05)。隨著氧濃度的降低，病理性瘢痕成纖維細胞細胞仍保持較高活性，而正常組織的成纖維細胞隨著氧濃度的降低，細胞活性明顯降低，然而當瘢痕疙瘩成纖維細胞中HIF-1α基因沉默后，其凋亡數(shù)量明顯增加(P<0.05)，表明HIF-1α在病理性瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖以及活力中具有一定的促進作用。

盡管HIF-1α對于瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和細胞活力具有一定的影響[14]，然而HIF-1α在調(diào)控基因參與細胞周期阻滯的作用一直不明。有研究發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下的細胞，其細胞周期被阻礙在G0/G1期，HIF-1α可以誘發(fā)G0/G1期的細胞積累[15]，同時BrdU試驗也發(fā)現(xiàn)缺氧細胞很快增殖下降[16]，那么HIF-1α是如何調(diào)控細胞周期的進程將是本課題組下一步研究的重點。Gardner等的研究表明：p27和p21是低氧誘導細胞阻滯的主要決定因素[17]，在缺氧條件下，CKIs(如p27、p21，p57)上調(diào)，Rb去磷酸化，p27是第一個被指出與細胞周期調(diào)節(jié)蛋白-CDK復合物結(jié)合，并參與促進RB的去磷酸化的物質(zhì)[18]。在缺氧條件下HIF-1α調(diào)控下的成纖維細胞的細胞周期阻滯是否和p21及p27有關(guān)，也將是本課題組下一步研究的重點。同時肝臟、心臟以及腎臟的纖維化也可看做是一種病理性的修復過程[6,19-20]，那么HIF-1α在這些纖維化疾病中是否也具有一定的作用呢？這些問題同樣值得探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩成纖維細胞中，HIF-1α是缺氧誘導成纖維細胞增殖的促進因素，在缺氧條件下HIF-1α促進成纖維細胞增殖及生長活性，抑制其凋亡，在瘢痕疙瘩的形成中具有重要作用，是瘢痕疙瘩藥物研發(fā)的重要靶點。

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(編校：王儼儼)

Effect of HIF-1α on proliferation of pathological scar fibroblasts and its mechanism

HU QiangΔ, SUI Shuang, WANG Guo-dong, YAO Li-min

(Department of Burn & Plastic surgery, No.7 Hospital of PLA, Yantai 264000, China)

ObjectiveTo explore the effect of hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)in pathological scar and its specific mechanism,and the therapy target of pathological scar.MethodsReal time PCR and Western blot was used to test the expression of HIF-1α in normal tissue and pathological scar,meanwhile to detect the effect of hypoxic environment on the expression of HIF-1α.Fibroblasts activity in pathological scar and normal tissue under different oxygen concentration(20%,10%,5%,2% and 1%)was determined by MTT method.Determine the different expression of HIF-1α mRNA and protein in normal environment(20% oxygen)and hypoxic environment(5% oxygen).The changes of the number of fibroblasts after the silence of HIF-1α by HIF-1α shRNA virus using flow cytometer.ResultsThe Real time PCR and Western blot results showed that the expressions of HIF-1α mRNA and protein in fibroblasts of pathological scar was significantly higher than that in normal tissue(P<0.05),and the activity of the keloid fibroblasts in hypoxia environment(5%,2% and 1%)was also higher than that in normal tissue(P<0.05).The expressions of HIF-1α mRNA and protein in keloid fiber cells were higher in hypoxia environment(5% oxygen)than those in normal environment(20% oxygen),but when silence the expression of HIF-1α in keloid fibroblasts,the apoptosis of fibroblast in hypoxia environment(5% oxygen)were significantly higher than control group[(0.021±0.001)% vs.(3.739±0.039)%,P<0.05].ConclusionHIF-1α increases significantly in the pathological keloid fibroblasts and could promote the proliferation of fibroblasts and its vitality,which could accelerate the formation of pathological scar.

HIF-1α;pathological scar;fibroblast;proliferation

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.009

胡強，通信作者，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：皮膚燒傷，E-mail：huqiang92@126.com。

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