王海波,劉延軍,陳樹偉,武文龍,李鳳臣
(解放軍第107醫(yī)院 胃腸科,山東 煙臺 264002)
β-catenin/Akt信號通路在亞硒酸鈉誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的機(jī)制研究
王海波Δ,劉延軍,陳樹偉,武文龍,李鳳臣
(解放軍第107醫(yī)院 胃腸科,山東 煙臺 264002)
目的 探討β-catenin/Akt信號通路在亞硒酸鈉誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的機(jī)制研究。方法 培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC-7901,0、5、10、20 μmol/L亞硒酸鈉處理細(xì)胞,24 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率變化;10 μmol/L的亞硒酸鈉處理細(xì)胞,24 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化;10 μmol/L的亞硒酸鈉處理細(xì)胞,0、6、12、24 h后Western blot檢測β-catenin、cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)量及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)的活性。結(jié)果 5、10、20 μmol/L亞硒酸鈉處理細(xì)胞的凋亡率顯著高于0 μmol/L(P<0.01)。10 μmol/L的亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞24 h后,與對照組比較,G0/G1期細(xì)胞顯著減少,S期及G2/M期細(xì)胞顯著增加(P<0.05),G2/M期細(xì)胞增加(P<0.05);10 μmol/L的亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞后,β-catenin、cyclin D1和survivin在6、12和24 h的蛋白表達(dá)量顯著低于0h(P<0.01),且隨著時間的延長,蛋白的表達(dá)量逐漸減少;10 μmol/L的亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞后,p-Akt在6、12和24 h的含量顯著低于0 h(P<0.01),而Akt各時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 亞硒酸鈉能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡,阻滯細(xì)胞于S期,其作用機(jī)制可能與β-catenin/Akt信號通路有關(guān)。
亞硒酸鈉;β-catenin/Akt;胃癌;凋亡
癌癥是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的惡性增殖形成的惡性腫瘤。隨著人們生活方式以及環(huán)境的改變,癌癥的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,給人們的健康造成了嚴(yán)重的威脅。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,癌癥的早期診斷和治療有一定的突破,但癌癥的發(fā)病仍然很高[1-3]。硒是人體必需的一種微量元素,研究顯示,硒不僅能預(yù)防腫瘤的發(fā)生,而且能有效治療腫瘤,主要機(jī)制是引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡[4-5]。亞硒酸鈉是最早研究的一種無機(jī)硒,許多研究已經(jīng)證實亞硒酸鈉能促進(jìn)肝癌、骨肉瘤、直腸癌等細(xì)胞的凋亡,但亞硒酸鈉與胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制的研究比較少[6-8]。β-catenin對促進(jìn)細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞生存發(fā)揮重要作用[9],蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)能對腫瘤細(xì)胞的活性進(jìn)行調(diào)控[10],因此,本研究對β-catenin/Akt信號通路在亞硒酸鈉誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的機(jī)制研究,以期為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞:胃癌細(xì)胞株SGC-7901由山東大學(xué)細(xì)胞生物研究中心提供。
1.1.2 試劑:β-catenin、Akt、cyclin D1、survivin單克隆抗體均購自美國Abcaminc;DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco;亞硒酸鈉、胰蛋白酶均購自美國Sigma;Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國BD;碘化丙啶購自Sigma-Aldrich;RNA酶購自Invitrogen。
1.1.3 儀器:CK2-TRC-3型倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus;BB5060UV型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus;LSR II流式細(xì)胞儀購自美國BD;DYCZ-24EN垂直電泳槽購自北京六一儀器。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):從液氮罐中取出裝有胃癌細(xì)胞株SGC-7901的凍存管,放入事先調(diào)好溫度的37 ℃水浴鍋中解凍,并輕輕搖動冷凍管使其在1 min內(nèi)全部融化,加入含有10% FBS的DMEM細(xì)胞生長液的離心管中,1000 r/min離心8 min,棄上清,加入細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞,接種于細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,更換培養(yǎng)基。細(xì)胞融合度達(dá)到90%時,倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞2次,加入1 mL胰酶消化細(xì)胞,細(xì)胞呈單個存在時,終止消化,1000 r/min離心8 min,除去酶消化液,PBS重懸細(xì)胞,離心后加入細(xì)胞生長液,將細(xì)胞種植于培養(yǎng)板中,37 ℃,5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染:取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞株SGC-7901,0.25 %的胰酶消化細(xì)胞,觀察到細(xì)胞呈單個存在時,轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中,1000 r/min離心7 min,棄上清,加入不含有胎牛血清的不完全培養(yǎng)液接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。0、5、10、20 μmol/L亞硒酸鈉與不完全培養(yǎng)基混合后加入到胃癌細(xì)胞株SGC-7901中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后,更換為含有胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
1.2.3 流式儀檢測細(xì)胞凋亡:取加入0、5、10、20 μmol/L亞硒酸鈉處理的胃癌細(xì)胞株SGC-7901,培養(yǎng)24 h后,加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞為單個細(xì)胞,加入PBS重懸細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/mL,取1 mL細(xì)胞懸液至離心管中,1000 r/min,4 ℃離心8 min,棄去上清,PBS洗滌細(xì)胞2次,在沉淀中加入200 μL Binding Buffer,混合均勻后分別加入5 μL PI和 Annexin-V,避光室溫靜置20 min ,加400 μL緩沖液,流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。共檢測3次。
1.2.4 細(xì)胞周期檢測:取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞5×104個/mL培養(yǎng)24 h后,加入10 μmol/L的亞硒酸鈉共培養(yǎng)24 h,同時設(shè)置對照組(無亞硒酸鈉)。收集細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞,4 ℃乙醇固定12 h后,離心除去乙醇,加入1% 200 μL RNA酶溶液,37 ℃、15 min水浴,加入碘化丙啶,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。共檢測3次。
1.2.5 Western blot檢測β-catenin、cyclin D1、survivin的表達(dá)及Akt蛋白的活性:10 μmol/L的亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞0、6、12、24 h后,收集細(xì)胞,棄上清,PBS洗滌細(xì)胞3次,胰酶消化細(xì)胞,1000 r/min,離心8 min,PBS懸浮細(xì)胞。按照試劑盒步驟提取細(xì)胞蛋白和測定提取的蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合,100 ℃變性5 min。每孔加入50 μL樣品,調(diào)整電泳時電壓。電泳結(jié)束后,取出蛋白凝膠,將濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙依次夾好,4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜。取出PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后,分別以β-catenin、cyclin D1、survivin、Akt作為一抗(1:500),4℃孵育過夜,TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:1000),37 ℃孵育1h,TBST清洗后加入ECL發(fā)光劑顯影,以β-actin為內(nèi)參用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并計算蛋白表達(dá)率。
2.1 不同濃度亞硒酸鈉對細(xì)胞凋亡率的影響 0、5、10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞24 h后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。5、10、20 μmol/L的亞硒酸鈉處理的細(xì)胞的凋亡率(12.46±1.08、21.79±1.42、14.34±1.16)顯著高于 0 μmol/L(3.12±0.78)(P<0.01),其中10 μmol/L亞硒酸鈉處理的細(xì)胞凋亡率高于5 μmol/L和20 μmol/L(P<0.01),因此選擇10 μmol/L做后續(xù)研究。見圖1。
圖1 不同濃度的亞硒酸鈉處理對胃癌細(xì)胞凋亡率的影響A:流式細(xì)胞結(jié)果;B:細(xì)胞凋亡率**P<0.01,與0 μmol/L比較Fig.1 Effect of sodium selenite at different concentrations on apoptosis rate (n=3,±s)A:flow cytometry;B: apoptosis rate**P<0.01,compared with 0 μmol/L
2.2 細(xì)胞周期檢測 10 μmol/L亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞24 h后,與對照組比較,G0/G1期細(xì)胞減少,S期及G2/M期細(xì)胞增加(P<0.05,P<0.01),說明細(xì)胞發(fā)生S期阻滯,細(xì)胞增殖受到抑制。見表1。
表1 亞硒酸鈉處理對細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effect of sodium selenite on cell cycle (n=3,±s,%)
*P<0.05,**P<0.01,與0 μmol/L比較,compared with 0 μmol/L
2.3 Western blot檢測不同時間點β-catenin、cyclin D1和survivin檢測 10 μmol/L亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞后,β-catenin、cyclin D1和survivin在6、12、24 h的蛋白表達(dá)量顯著低于0 h(P<0.01),且隨著時間延長,蛋白的表達(dá)量逐漸減少,說明亞硒酸鈉處理能抑制細(xì)胞蛋白的表達(dá)。見圖2、表2。
圖2 Western blot檢測亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)量Fig.2 Related protein expression treated by sodium selenite detected by Western blot
組別蛋白表達(dá)率β?catenincyclinD1survivin0h0628±00150506±00110602±0014 6h0439±0012??0377±0012??0413±0013??12h0189±0007??0142±0007??0164±0009??24h0102±0004??0007±0002??0099±0003??
**P<0.01,與0 μmol/L比較,compared with 0 μmol/L
2.4 Western blot檢測Akt活性 10 μmol/L亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞后,Akt在0、6、12、24 h比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,p-Akt在6、12、24 h的蛋白表達(dá)量顯著低于0h(P<0.01),說明亞硒酸鈉能抑制Akt的激活。見圖3、表3。
圖3 Western blot檢測亞硒酸鈉處理細(xì)胞p-Akt及Akt蛋白變化情況Fig.3 p-Akt and Akt expression treated by sodium selenite detected by Western blot
組別蛋白表達(dá)量Aktp?Akt0h122±00110421±00076h120±00120302±0008??12h119±00100199±0007??24h121±00090105±0006??
**P<0.01,與0 μmol/L比較,compared with 0 μmol/L
硒是生物體必須的一種微量元素,主要以硒化合物的形式存在,研究顯示,硒對人類的健康發(fā)揮重要的作用,能延緩衰老、抗腫瘤等作用,已受到廣大研究者的關(guān)注[11-12]。胃癌是一種消化道惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)胞的惡性增殖和異常分化有關(guān),而且與腫瘤細(xì)胞的凋亡也有很大的關(guān)系[13-14]。因此,研究硒對腫瘤細(xì)胞的影響機(jī)制具有重要意義。
硒化合物能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增加細(xì)胞毒性從而對腫瘤細(xì)胞造成影響[15]。當(dāng)高濃度的硒化合物作用于腫瘤細(xì)胞時,能引起細(xì)胞直接的毒性作用,使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)造成損傷,導(dǎo)致細(xì)胞膜崩解,從而達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的[16-17]。研究顯示,亞硒酸鈉能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,作用機(jī)制與細(xì)胞周期有關(guān)[18]。本研究中,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5、10、20 μmol/L的亞硒酸鈉處理的細(xì)胞的凋亡率顯著高于 0 μmol/L(P<0.01)。進(jìn)一步研究亞硒酸鈉對細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)10 μmol/L的亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞24 h后,與對照組比較,G0/G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增加(P<0.01),其原因可能是亞硒酸鈉使細(xì)胞發(fā)生S期阻滯,進(jìn)而使細(xì)胞增殖受到抑制有關(guān)。
β-catenin是Wnt中的一員,在細(xì)胞通訊中占有重要作用,參與腫瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移[19]。當(dāng)細(xì)胞中無Wnt信號時,β-catenin被糖原合成激酶-3(Glycogen Synthase Kinase3,GSK-3)磷酸化,與結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)等蛋白結(jié)合而被降解。當(dāng)Wnt與β-catenin受體結(jié)合后,能抑制GSK3,β-catenin不能被降解,在胞質(zhì)中不斷積累,積累過多時,就會轉(zhuǎn)入核內(nèi),與淋系增強子結(jié)合因子1(lymphoid enhancer factor,LEF1)和轉(zhuǎn)錄因子-4(transcription factor 4 ,TCF4)結(jié)合,對cyclin D1、survivin等靶基因進(jìn)行調(diào)控,從而參與細(xì)胞的活動,調(diào)控多種疾病的發(fā)生[20-21]。本研究用10 μmol/L的亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞后,結(jié)果顯示,β-catenin、cyclin D1和survivin在6、12 h和24 h的蛋白表達(dá)量顯著低于0h(P<0.01),且隨著時間的延長,蛋白的表達(dá)量逐漸減少,說明亞硒酸鈉處理能抑制細(xì)胞蛋白的表達(dá)。
Akt在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量很高,是細(xì)胞內(nèi)重要的促進(jìn)存活因子[22]。研究表明,Akt能使β-catenin發(fā)生磷酸化,促進(jìn)β-catenin的入核和轉(zhuǎn)錄[23]。因此,本研究用10 μmol/L亞硒酸鈉作用于胃癌細(xì)胞后,結(jié)果顯示亞硒酸鈉能降低Akt的磷酸化(P<0.01),說明亞硒酸鈉能抑制Akt的激活。
綜上所述,亞硒酸鈉能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡,阻滯細(xì)胞于S期,其作用機(jī)制可能與β-catenin/Akt信號通路相關(guān)。
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(編校:王儼儼)
Mechanism of β-catenin/Akt signaling pathway in apoptosis of gastric cancer cells induced by selenite sodium
WANG Hai-boΔ, LIU Yan-jun, CHEN Shu-wei, WU Wen-long, LI Feng-chen
(Department of Gastroenterology, PLA 107th hospital, Yantai 264000, China)
ObjectiveTo explore the mechanism of β-catenin/Akt signaling pathway in the apoptosis of gastric cancer cells induced by selenite sodium.MethodsGastric cancer cell line SGC-7901 was cultured, and 0 mol/L, 5 mol/L, 10 mol/L and 20 mol/L selenite sodium treated cells; flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate after 24 h; 10 mol/L sodium selenite treated cells, flow cytometry was used to detect the cell cycle changes after 24 h; 10 mol/L sodium selenite treated cells,protein expression of β- catenin,cyclin D1 and protein kinase B (Akt) activity were detected by Western blot after 0,6,12,24 h.ResultsCells apoptosis rate was significantly higher than 0 mol/L after cells was treated by 5 mol/L, 10 mol/L and 20 mol/L sodium selenite, due to cells apoptosis rate was higher by 10 mol/L sodium selenite treated than 5 mol/L and 20 mol/L, 10 mol/L sodium selenite treated cells for follow-up study; gastric cancer cells was treated by 10 mol/L sodium selenite for 24 h, compared with the control group, G0/G1 phase cells decreased, cells in S phase and G2/M phase significantly increased(P<0.05);gastric cancer cells was treated by 10 mol/L sodium selenite for 0 h, 6 h, 12 h and 24 h,protein expression of β-catenin and cyclin D1 and Survivin in 6 h, 12 h and 24 h was significantly lower than that in 0 hour(P<0.01),and with the extension of time, protein expression gradually decreased; gastric cancer cells was treated by 10 mol/L sodium selenite could significantly decrease the phosphorylation of p-Akt in 6,12,24 h, while there was no significant difference of Akt among difference time points(P<0.01).ConclusionSodium selenite could induce apoptosis of gastric cancer cells, and the cells were arrested in S phase. The mechanism may be associated with beta-catenin/Akt signaling pathway.
sodium selenite;β-catenin/Akt; gastric cancer; apoptosis
山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金(BS2009SW010)
王海波,通信作者,男,碩士,副主任醫(yī)師,研究方向:胃癌,E-mail:wang13145356111@163.com。
R735.2
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