地塞米松對呼吸道合胞病毒感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞分化的影響

黃茜，汪理，李曉南

(1.湖北省體育科學(xué)研究所，湖北 武漢 430205；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢 430022；3.華中科技大學(xué)醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430074)

地塞米松對呼吸道合胞病毒感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞分化的影響

黃茜1，汪理2，李曉南3Δ

(1.湖北省體育科學(xué)研究所，湖北 武漢 430205；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢 430022；3.華中科技大學(xué)醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430074)

目的 觀察地塞米松(dexamethasone,DEX)對小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(respiratory syncytial virus,BMDM)及呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠的肺泡巨噬細(xì)胞分化的影響。方法 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)M1型BMDM，鑒定其表型，觀察DEX對巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子表達(dá)的影響；以RSV感染小鼠，同時(shí)給予DEX，觀察DEX對小鼠肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子表達(dá)的影響。結(jié)果 DEX能抑制M1型BMDM及RSV感染小鼠的肺泡巨噬細(xì)胞中IL-6、IL-12、iNOS和IRF5的表達(dá)，并促進(jìn)IL-10、Arginase-1和IRF4的表達(dá)，使M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。結(jié)論 DEX可在體內(nèi)外將M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)，這可能是DEX治療RSV感染的作用機(jī)制之一。

地塞米松；呼吸道合胞病毒；巨噬細(xì)胞

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)為副黏病毒科肺炎病毒屬有包膜非節(jié)段性的單負(fù)鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要和常見的病毒病原體，可引起急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥，并能導(dǎo)致嬰幼兒哮喘的發(fā)生[1]。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可遞呈抗原啟動(dòng)免疫應(yīng)答，還可分泌多種炎癥因子，參與免疫調(diào)節(jié)。根據(jù)活化狀態(tài)和發(fā)揮功能的不同，巨噬細(xì)胞可分為M1型即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞即替代活化的巨噬細(xì)胞[2]。 M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α及iNOS等[3]，高表達(dá)IRF5、IRF8等轉(zhuǎn)錄因子[4-5]，具有較強(qiáng)的抗原提呈能力，參與正向免疫應(yīng)答；M2型巨噬細(xì)胞可表達(dá)精氨酸酶1(Arginase-1)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD206)等[6-7]，高表達(dá)IRF4等轉(zhuǎn)錄因子[8]，抗原提呈能力較弱，還可分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等下調(diào)免疫應(yīng)答，促進(jìn)組織修復(fù)和抗炎癥[9]。

肺臟是RSV感染時(shí)的主要受累器官，而肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)是引起肺部炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究表明，RSV感染可激活A(yù)M，釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子如IL-12、IL-6、TNF-a等[10-11]，促使白細(xì)胞粘附和支氣管痙攣；活化的巨噬細(xì)胞還能釋放氧自由基，加重氣道損傷[12]。

糖皮質(zhì)激素可抑制免疫反應(yīng)，減輕氣道炎癥反應(yīng)，而地塞米松(dexamethasone，DEX)是臨床上最為常用的糖皮質(zhì)激素類免疫抑制劑之一。臨床工作中DEX已被應(yīng)用于RSV感染后的毛細(xì)支氣管炎，但其作用機(jī)制尚不明確。巨噬細(xì)胞是DEX作用的主要效應(yīng)細(xì)胞，本研究通過觀察地塞米松對小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)及呼吸道合胞病毒感染小鼠的肺泡巨噬細(xì)胞分化的影響，探討地塞米松用于RSV感染治療的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒株：50只雌性SPF級BALB/C小鼠購自湖北省疫病預(yù)防與控制中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號No.42000600011887)；呼吸道合胞病毒A2株購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑：Trizol 購自Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒和SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司；兔抗小鼠IRF4和IRF5多克隆抗體購自San Cruz 公司。ECL顯色試劑盒購自Pierce公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器：流式細(xì)胞儀(Accuri C6，美國BD)；定量PCR儀(StepOne Plus，美國ABI)；化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(ES3 Imaging System，美國UVP)。

1.2 方法

1.2.1 M1型小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)的誘導(dǎo)及DEX刺激：處死小鼠，用新潔爾滅浸泡5 min消毒，無菌剝?nèi)∶劰呛凸晒?，剪去骨兩端，用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，用200目無菌尼龍網(wǎng)過濾得到骨髓細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液4 mL裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌2次，將得到的骨髓細(xì)胞用含10%FBS的DMEM制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入10 cm2的培養(yǎng)皿中，加入粒單核細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，使其終濃度為50 ng/mL，37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，第4天更換一次含GM-CSF的培養(yǎng)液。將收獲的巨噬細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，加入6孔板中，同時(shí)加入地塞米松(10-8mol/mL)處理8 h，收獲細(xì)胞備用。

1.2.2 M1型BMDM表型的鑒定：收集培養(yǎng)的M1型巨噬細(xì)胞，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，分別加入APC-F4/80、FITC-MHC-II及同型對照抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測F4/80和MHC-II的表達(dá)。

1.2.3 小鼠呼吸道合胞病毒感染模型建立[13]：戊巴比妥鈉0.06 mg/g腹腔注射麻醉小鼠，伸直其頸部，小鼠鼻內(nèi)滴入106PFU病毒液100 μL，DEX組小鼠在RSV感染第3天腹腔注射DEX 0.2 mg/kg，感染第7天處死小鼠，無菌取小鼠肺泡巨噬細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的純化：處死小鼠，用新潔爾滅浸泡5 min消毒，沿正中線剪開頸部皮膚，分離氣管，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，將得到的灌洗液300 g/min離心5 min，棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，所得細(xì)胞用含10%FBS的DMEM制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，加入6孔板培養(yǎng)過夜，換液清除未貼壁的懸浮細(xì)胞。

1.2.5 定量PCR檢測小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)及肺泡巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)：Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)依據(jù)SYBR Green Supermix說明書進(jìn)行。參考Genebank序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：

IRF-4 上游：5’-CTGCAAGTGTTTGCTCACCA-3’,

下游：5’-GAGTGGTAACGTGTTCAGGT-3’ ；

IL-10 上游：5’-AGTGGAGCAGGTGAAGAGTG-3’，

下游：5’-TTCGGAGAGAGGTACAAACG-3’；

Arginase-1 上游：5’-CAGAAGAATGGAAGAGTCGA-3’，

下游：5’-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3’；

IL-6 上游：5’-TCCCCTCCAGGAGCCCAGCTA-3’，

下游：5’-CAGGGCTGAGATGCCGTCGAG-3’；

IL-12 P35 上游：5’-CAGAATCACAACCATCAGCAG-3’，

下游：5’-CACCCTGTTGATGGTCACGAC-3’；

iNOS 上游：5’-AATAGAGGAACATCTGGCCAGG-3’，

下游：5’-ATGGCCGACCTGATGTTGC-3’；

GAPDH 上游：5’-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3’，

下游：5’-GCCTGCTTCACCACCTTC-3’

1.2.6 Western blot檢測BMDM及肺泡巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子IRF4和IRF5的表達(dá)：細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，經(jīng)5%濃縮膠，12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗小鼠IRF-4或IRF-5抗體室溫反應(yīng)1 h，TBST洗膜4次，每次15 min，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)1 h，TBST洗膜4次，每次15 min，用ECL底物液顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，定量PCR結(jié)果由ABI step one PCR擴(kuò)增儀收集，PCR結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，檢測PCR反應(yīng)的特異性。使用相對定量方法對擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行分析，根據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct值，以2-ΔΔCT進(jìn)行組間相對分析，采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M1型BMDM表型鑒定 小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化的M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)F4/80，且高表達(dá)MHC-II類分子，證明在體外利用GM-CSF成功誘導(dǎo)得到M1巨噬細(xì)胞。

圖1 M1型BMDM表型的鑒定Fig.1 Phenotype identification of M1 BMDM

2.2 DEX對BMDM表達(dá)IL-10、IL-12等炎癥因子的影響 與對照組相比，加入DEX刺激M1型BMDM后，IL-10、Arginase-1等免疫抑制因子明顯上升，M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子IRF4表達(dá)也明顯升高，而IL-12、IL-6、iNOS等促炎因子明顯降低。表明DEX能促進(jìn)M1型BMDM表達(dá)IL-10等抑炎因子，抑制其表達(dá)IL-12等炎癥因子。

圖2 DEX對BMDM分泌細(xì)胞因子的影響*P<0.05Fig.2 Effects of DEX on cytokine secretion of M1 BMDM*P<0.05

2.3 DEX對BMDM表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子IRF4和IRF5的影響 Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，DEX能明顯抑制BMDM中M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子IRF5的表達(dá)，并能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子IRF4的表達(dá)，表明，DEX能促進(jìn)BMDM由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。

圖3 DEX對BMDM轉(zhuǎn)錄因子的影響*P<0.05Fig.3 Effects of DEX on transcriptional factors of M1 BMDM*P<0.05

2.4 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中IL-12、IL-10等抑炎因子表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：給RSV感染小鼠注射DEX能促進(jìn)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中IL-10、Arginase-1等免疫抑制因子的表達(dá)，M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子IRF4表達(dá)也明顯升高，而注射DEX后肺泡巨噬細(xì)胞中內(nèi)IL-12、IL-6、iNOS等促炎因子明顯降低。表明DEX能抑制RSV感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中IL-12等炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)IL-10等抑炎因子的表達(dá)。

圖4 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響*P<0.05Fig.4 Effects of DEX on cytokine secretion of alveolar macrophages in RSV infection mice*P<0.05

2.5 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中IRF4、IRF5表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示：與體外實(shí)驗(yàn)相似，DEX能明顯抑制RSV感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子IRF5的表達(dá)，并能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子IRF4的表達(dá)。表明DEX也能在RSV感染小鼠體內(nèi)促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。

圖5 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的影響*P<0.05Fig.5 Effects of DEX on transcriptional factors of alveolar macrophages in RSV infection mice*P<0.05

3 討論

RSV是嬰幼兒下呼吸道感染的常見病因，嬰幼兒急性RSV下呼吸道感染后常發(fā)生反應(yīng)性氣道疾病，在急性期過后可出現(xiàn)反復(fù)喘息癥狀，部分患兒可遷延發(fā)展為持續(xù)性哮喘。目前臨床上對RSV感染以對癥支持治療為主，主要藥物有糖皮質(zhì)激素，支氣管擴(kuò)張劑等。DEX是一種長效糖皮質(zhì)激素，在急性呼吸窘迫綜合癥、嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài)及慢性炎癥性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和支氣管哮喘)中，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

肺泡巨噬細(xì)胞廣泛分布于肺泡內(nèi)及支氣管表面，是肺組織接觸抗原最早、機(jī)會(huì)最多的免疫細(xì)胞，組成肺部防御病原微生物和肺損傷的第一道防線[14]，在病原體入侵時(shí)，可釋放大量細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)介導(dǎo)急性肺損傷。而巨噬細(xì)胞是一種具有可塑性和多能性的細(xì)胞群體，在體內(nèi)外不同的微環(huán)境影響下，表現(xiàn)出明顯的功能差異。根據(jù)巨噬細(xì)胞的表型，通常將其分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，不同極化表型的巨噬細(xì)胞在宿主抵抗病原微生物、腫瘤免疫、炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)等過程中發(fā)揮著不同的功能和作用。M1型巨噬細(xì)胞表面表達(dá)MHC-II、CD11b、CD11c等分子，且高表達(dá)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)，產(chǎn)生大量一氧化氮(NO)[15]，可殺滅病原微生物，人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)能上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子IRF5的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌和殺滅腫瘤細(xì)胞，調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1型極化[16]；M2型巨噬細(xì)胞表面表達(dá)CD163、CD206、Dectin-1等分子[17]，不產(chǎn)生NO，但高表達(dá)精氨酸酶-1(Arginase-1)，Arginase-1代謝生成的鳥氨酸、脯氨酸可以促進(jìn)膠原合成和組織重構(gòu)[18]，降低炎癥反應(yīng)。

本研究利用GM-CSF成功誘導(dǎo)得到高表達(dá)MHC-II類分子的M1型BMDM，并用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DEX能促進(jìn)M1型BMDM向M2型分化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：RSV感染小鼠7 d后，其肺泡巨噬細(xì)胞主要表達(dá)IL-12、IL-6和iNOS，并高表達(dá)IRF5轉(zhuǎn)錄因子，主要向M1型分化；而注射DEX的小鼠，其肺泡巨噬細(xì)胞主要表達(dá)IL-10、Arginase-1等，并高表達(dá)IRF4轉(zhuǎn)錄因子，主要向M2型分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RSV感染后，小鼠肺泡巨噬細(xì)胞向M1型分化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，應(yīng)用DEX可將M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)，這可能是DEX治療RSV感染的作用機(jī)制之一，本研究為RSV感染的治療提供了新的思路和啟示。

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(編校：吳茜)

Influence of dexamethasone on alveolar macrophage differentiation in respiratory syncytial virus infected mice

HUANG Qian1, WANG Li2, LI Xiao-nan3Δ

(1.Hubei Research Institute of Sports Science, Wuhan 430205, China; 2.Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China;3.Department of Respiratory Medicine, Hospital of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430074, China)

ObjectiveTo observe the influence of dexamethasone on M1 BMDM and alveolar macrophage differentiation in respiratory syncytial virus (RSV) infected mice. MethodsCulture M1 BMDM and identify its phenotype, observe the effect of DEX on its transcription factors and cytokines; In RSV infected mice, observe the influence of DEX on the transcription factors and cytokines of alveolar macrophage. ResultsDEX can inhibit IL-6, IL-12, iNOS and IRF5 expression, but promote IL-10, Arginase-1 and IRF4 expression in M1 BMDM and alveolar macrophages of RSV infected mice, made M1 macrophages transform to M2 macrophages. ConclusionDEX can transform M1 macrophages to M2 macrophages in vivo and in vitro, and inhibit inflammation, this may be one of the mechanism of DEX in the treatment of RSV infection.

dexamethasone; respiratory syncytial virus; macrophage

湖北省自然科學(xué)基金(2015CFB621)

黃茜，女，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：大眾健康，E-mail：huangqian9816@163.com；李曉南，通信作者，女，醫(yī)學(xué)學(xué)士，副主任醫(yī)師，研究方向：呼吸內(nèi)科感染性疾病的治療，E-mail：19761073@qq.com。

R392.5

A