PI3K-Akt-mTOR通路及其小分子抑制劑的研究進(jìn)展

何俏軍，董曉武，朱虹，胡永洲，楊波

(浙江大學(xué)藥理毒理研究所，藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)研究所，浙江省抗腫瘤藥物臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058)

PI3K-Akt-mTOR通路及其小分子抑制劑的研究進(jìn)展

何俏軍Δ，董曉武，朱虹，胡永洲，楊波

(浙江大學(xué)藥理毒理研究所，藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)研究所，浙江省抗腫瘤藥物臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058)

磷脂肌醇(PI3K)-蛋白激酶B(PKB，Akt)-雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)通路在細(xì)胞的存活、增殖和分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的異常激活和人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，許多靶向該通路的小分子抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)中。本文將對(duì)近年來PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系及PI3K-Akt-mTOR抑制劑抗腫瘤作用研究進(jìn)展，并結(jié)合本課題組的相關(guān)研究成果進(jìn)行綜述。

PI3K-Akt-mTOR通路；小分子抑制劑；惡性腫瘤

磷脂肌醇(PI3K)-蛋白激酶B(PKB，Akt)-雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)通路廣泛存在于細(xì)胞中，在維持蛋白合成、存活、生長、轉(zhuǎn)移、凋亡等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，該通路的相關(guān)基因突變或過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和子宮內(nèi)膜癌等。已成為腫瘤治療研究的重要靶點(diǎn)之一，目前，已有數(shù)十個(gè)靶向該通路的候選藥物進(jìn)入臨床研究。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)PI3K和PTEN在腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、DNA修復(fù)、自噬和衰老中發(fā)揮作用[1]。本文就PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路及其關(guān)鍵蛋白與腫瘤的關(guān)系，臨床PI3K-Akt-mTOR抑制劑的研究進(jìn)展，以及本課題組在靶向PI3K-Akt-mTOR通路抑制劑研究領(lǐng)域的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行綜述。

1 PI3K-Akt-mTOR通路與腫瘤

PI3K-Akt-mTOR的致癌潛力主要體現(xiàn)以下2個(gè)方面：①該通路的異常激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和形成腫瘤[2-4]；②該通路的激活通常伴隨著下游通路關(guān)鍵分子的改變，如PIK3CA，Akt1，PTEN的基因突變；PIK3CA，Akt1，Akt2的基因擴(kuò)增；腫瘤抑制基因PTEN的缺失等[5](見表1)。該通路的上游通路主要包括各類受體酪氨酸激酶，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER2)，肝細(xì)胞生長因子受體(MET)和成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)等，這類受體的突變、擴(kuò)增往往導(dǎo)致PI3K-Akt-mTOR信號(hào)軸的失調(diào)，最終引起腫瘤惡性進(jìn)展；而另一類以抑癌基因?yàn)橹鞯纳嫌畏肿觿t扮演著負(fù)性調(diào)控PI3K-Akt-mTOR通路的作用，如VHL(Von Hippel-Lindau disease tumour suppressor)，結(jié)節(jié)性硬化癥基因(Tuberous sclerosis genes TSC1和TSC2)，蘇氨酸-絲氨酸蛋白激酶LKB1，神經(jīng)纖維瘤蛋白(Neurofibromin，NF1)等。

表1 PI3K信號(hào)通路異常和相關(guān)腫瘤類型Tab.1 Relationship between abnormal PI3K signaling pathway and tumor types

1.1 PI3K PI3K是PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白[6-7]，可通過磷酸化包括磷脂酰-4,5-二磷酸脂(phosphatidylinositol-3,4,5-bisphosphate，PIP2)在內(nèi)的磷脂酰肌醇環(huán)上3位的羥基產(chǎn)生磷脂酰肌磷酸脂，如磷脂酰-3,4,5-三磷酸脂(phosphatidylinositol-3,4,5-bisphosphate，PIP3)，作為重要的第二信使作用下游的效應(yīng)子來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多種生命活動(dòng)[8-9]，包括細(xì)胞存活、生長、增殖和代謝。根據(jù)活化機(jī)制、結(jié)構(gòu)特征以及對(duì)脂類底物選擇型的不同，PI3K分為I、II和III型，其中I型又分為IA和IB型，且IA型與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)度最高[1]，包括頭頸部癌癥、肺癌、甲狀腺癌、子宮癌等[10-12]。PI3K的IA型包含PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ 3個(gè)亞型，IB類PI3K僅PI3Kγ一個(gè)亞型。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，PI3Kα的激活和PTEN的功能缺失往往同時(shí)存在。與PI3Kα在整個(gè)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的持續(xù)激活相比，PTEN的功能缺失往往存在于腫瘤惡性發(fā)展的后期甚至是腫瘤轉(zhuǎn)移之后的階段[13-14]。PI3Kβ和具有致癌性的Ras基因以及酪氨酸激酶在介導(dǎo)PTEN缺失的腫瘤形成過程中起關(guān)鍵作用[15]，PI3Kδ可能作為一些特定類型的腫瘤治療靶點(diǎn)[16]。

1.2 Akt Akt也被稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種分子量約為60kDa的絲/蘇氨酸蛋白激酶，由分別受基因PKBα，PKBβ，和PKBγ編碼的Akt1，Akt2及Akt3三種亞型組成[3]。雖然這3種亞型定位的染色體不同(Akt l/2/3分別為14q32.32、19q13.1-19q13.2和lq44)，但亞型之間有著很高的序列同源性(大于80%)。3個(gè)亞型具有相似的結(jié)構(gòu)組成：氨基末端的PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homologous domain，PH)、中部的激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain，KD)和羧基末端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(regulatory domain)。Akt作為PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白一直備受關(guān)注。首先，Akt可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存[17-19]。主要表現(xiàn)在：①能夠直接磷酸化促凋亡蛋白Bad上Ser136位點(diǎn)，從而阻斷了Bad傳導(dǎo)的凋亡信號(hào)；②激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，通過對(duì)NF-κB和P53的間接作用影響細(xì)胞存活，并且Akt能通過磷酸化P53結(jié)合蛋白MDM2，而影響P53的活性，通過增加P53蛋白的降解而促進(jìn)細(xì)胞存活；③抑制Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子的活性，下調(diào)Fas/FasL誘導(dǎo)的凋亡；④抑制線粒體釋放凋亡因子及細(xì)胞色素C，并磷酸化Caspase-9的Ser 196位點(diǎn)使其失活，阻斷其促凋亡通路。其次，Akt可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期運(yùn)行，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖[19-21]。主要表現(xiàn)在：①抑制GSK3β的激酶活性，從而阻止細(xì)胞周期Cyclin D1的降解，由于Cyclin D1的水平對(duì)細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，而GSK3β通過磷酸化作用可促進(jìn)泛素介導(dǎo)的Cyclin D1的降解；②干預(yù)p21Cip1的磷酸化和與PCNA結(jié)合而下調(diào)p21Cip1的活性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖；③直接磷酸化p27Kip1的Thr157位點(diǎn)，導(dǎo)致p27Kip1在細(xì)胞質(zhì)中滯留；④抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄后阻遏物4E-BP-1，促進(jìn)mRNA的轉(zhuǎn)錄。此外，Akt還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng)和轉(zhuǎn)移。Akt直接磷酸化并激活內(nèi)皮型NO合酶(eNOS)，從而刺激血管舒張、新血管形成以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的細(xì)胞遷移；另外，可通過mTOR1上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)，促使血管內(nèi)皮生長因子和其他血管生成因子的表達(dá)和分泌，通過自分泌和旁分泌的信號(hào)通路促進(jìn)血管生成[22]。

1.3 mTOR 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK)超家族成員。mTOR同樣是PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵位點(diǎn)，其調(diào)節(jié)異常可見于多種惡性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等[23-24]。該蛋白在細(xì)胞內(nèi)以2種不同的復(fù)合物形式存在，即mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)[25]。其中，mTORC1位于Akt激酶的下游，直接通過磷酸化S6K1和4E-BP1調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、mRNA剪接以及蛋白質(zhì)合成；mTORC2則位于Akt激酶的上游，通過磷酸化Akt及AGC家族激酶調(diào)控細(xì)胞的生長、存活和遷移[26-27]。

2 PI3K-Akt-mTOR抑制劑

在過去的十多年時(shí)間里，靶向PI3K-Akt-mTOR的抑制劑的研究取得了重要進(jìn)展，有大量不同結(jié)構(gòu)類型、作用機(jī)制的活性化合物被發(fā)現(xiàn)，并有數(shù)十個(gè)候選藥物進(jìn)入了臨床研究，根據(jù)其作用靶點(diǎn)和選擇性可大體上可以分為5類(見表2)：①泛PI3K抑制劑；②PI3K/mTOR抑制劑；③PI3K亞型選擇性抑制劑；④Akt抑制劑；⑤mTOR選擇性抑制劑。其中，泛PI3K和Akt抑制劑的臨床研究占比最高，均達(dá)到了27%，PI3K-mTOR雙重抑制劑的臨床研究數(shù)緊隨其后，達(dá)到了19%(見圖1)。此外，唯一上市用于腫瘤治療的mTOR抑制劑(替西莫司和依維莫司等雷帕霉素衍生物)是結(jié)合于mTOR的FRB區(qū)域(FKBP12-rapamycin binding domain)，進(jìn)而通過誘導(dǎo)該蛋白的變構(gòu)發(fā)揮抑制作用[28]，僅能抑制mTORC1活性而無法抑制mTORC2[29-30]，因而，雷帕霉素衍生物在單獨(dú)用藥時(shí)只在一些惡性腫瘤上起作用，如腎細(xì)胞癌(依維莫司和西羅莫西)，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(依維莫司)[31]和套細(xì)胞淋巴瘤(西羅莫西)[29]。

表2 PI3K和Akt抑制劑的臨床進(jìn)展Tab.2 Clinical progress of PI3K and Akt inhibitors

續(xù)表

圖1 靶向PI3K-Akt-mTOR抑制劑以及相應(yīng)的臨床研究Fig.1 Inhibitors targeting PI3K-Akt-mTOR and its related clinical application

2.1 PI3K抑制劑 自1980年P(guān)I3K被發(fā)現(xiàn)以來，其生物學(xué)功能和作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)的前景逐漸為研究人員所認(rèn)識(shí)。從最早出現(xiàn)的泛PI3K抑制劑(Wortmannin和LY294002)，到后來出現(xiàn)的第2代亞型選擇性PI3K抑制劑。截止目前，已經(jīng)有多個(gè)不同結(jié)構(gòu)類型、不同作用機(jī)制的PI3K抑制劑進(jìn)入了各種臨床研究，包括泛PI3K抑制劑(BAY80-6946、GDC0941等)、PI3K特異性的抑制劑(BKM-120、CAL101等)、PI3K/mTOR雙重抑制劑(BEZ-235、GSK-2126458、PF-04691502等)，充分證實(shí)了PI3K作為惡性腫瘤治療靶點(diǎn)的應(yīng)用前景。

本課題組以泛PI3K抑制劑XL-765和XL-147的喹喔啉結(jié)構(gòu)為基本骨架，基于其與PI3K活性口袋的作用模式，開展了一系列的合理藥物設(shè)計(jì)、合成和抗腫瘤活性評(píng)價(jià)工作，簡述如下：

① N-芳基喹喔啉胺類衍生物：通過在喹喔啉環(huán)的2位引入不同的芳胺片段以及并在3位引入不同的芳磺酰基片段，獲得了一系列結(jié)構(gòu)全新的N-芳基喹喔啉胺類衍生物1(見圖2)[32]。活性測試結(jié)果表明，大部分化合物表現(xiàn)出強(qiáng)效的細(xì)胞增殖抑制活性(PC3，A549，HCT116，HL60和KB細(xì)胞)，其中2-芳胺基芳環(huán)上引入甲氧基、氨基、羥基等取代基對(duì)其抗腫瘤活性有利。N-苯基喹喔啉胺類化合物1a活性最優(yōu)，其PI3Kα抑制活性(IC50)為0.07μM，對(duì)受試細(xì)胞株(PC3，A549，HCT116和HL 60)增殖抑制的IC50分別達(dá)到了0.14 μM、0.07 μM、0.95 μM和0.05 μM，其活性明顯優(yōu)于陽性對(duì)照LY294002。

圖2 N-芳基喹喔啉胺類PI3K抑制劑的發(fā)現(xiàn)Fig.2 Substituted amine derivatives of N-aryquinoxaline as PI3K inhibitors

② N-脂肪環(huán)喹喔啉胺類衍生物：以文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)多樣的PI3K抑制劑為基礎(chǔ)，采用Catalyst軟件包構(gòu)建PI3Kα的藥效團(tuán)模型Hypo1，并對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選。經(jīng)活性測試和構(gòu)效關(guān)系分析，最終發(fā)現(xiàn)了活性中等，但結(jié)構(gòu)新穎的N-嗎啉喹喔啉胺類化合物2[33]，其對(duì)PI3Kα的抑制活性(IC50)達(dá)到了0.44μM。在此基礎(chǔ)上，課題組結(jié)合生物電子等排和類似物設(shè)計(jì)等方法，進(jìn)一步設(shè)計(jì)、合成了一系列N-脂肪環(huán)喹喔啉胺類衍生物[34-35]。PI3Kα抑制實(shí)驗(yàn)表明，N-羥基哌啶喹喔啉胺類化合物3活性最優(yōu)，如化合物3a對(duì)PI3Kα的抑制活性(IC50)達(dá)到了0.025μM，此外，該化合物能明顯抑制磷酸化Akt蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)其抗腫瘤活性是通過作用于PI3K信號(hào)通路而起效的。(見圖3)。

圖3 N-脂肪環(huán)喹喔啉胺類PI3K抑制劑的發(fā)現(xiàn)Fig.3 The discovery of substituted amine derivatives of N-aliphatic ring-quinoxaline as PI3K inhibitors

2.2 PI3K/mTOR雙重抑制劑 基于PI3K和mTOR的催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似性，聯(lián)合使用PI3K/mTOR抑制劑使得同時(shí)靶向2條通路成為可能(mTORC1、mTORC2以及PI3K)。ATP競爭性的PI3K/mTOR小分子抑制劑(尤其是PI3Kα/mTOR雙重抑制劑)不僅能同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2，還能防止激活S6K-PI3K等負(fù)反饋通路，從而避免再次活化PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，發(fā)揮其抗腫瘤作用。目前已有多個(gè)PI3K/mTOR雙重抑制劑處于不同的臨床研究階段，如GSK2126458、XL-765、BEZ235、NVP-BGT226、GDC-0980和PKI-587等。

本課題組以PI3K/mTOR雙重抑制劑GSK2126458為先導(dǎo)化合物，分析其與PI3Kγ共晶結(jié)構(gòu)和分子對(duì)接結(jié)果(GSK2126458與PI3Kα的結(jié)合模式)，發(fā)現(xiàn)無論P(yáng)I3Kγ(Lys802、Ala885、Lys890)還是PI3Kα(Arg770、Ser854、Gln859)的溶劑區(qū)均以親水性氨基酸殘基為主，因此，在GSK2126458的喹啉環(huán)的4位引入合適的取代基與PI3Kα溶劑區(qū)中的Arg770、Ser854或Gln859發(fā)生氫鍵作用，可進(jìn)一步增強(qiáng)其與PI3K的相互作用，同時(shí)還能改善其物理化學(xué)性質(zhì)(見圖4)[36]。研究還發(fā)現(xiàn)，喹啉環(huán)4位以炔基為連接鏈的衍生物4的活性最優(yōu)，部分化合物顯示了與GSK2126458相當(dāng)?shù)腜I3K抑制活性，對(duì)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116均表現(xiàn)出中等到強(qiáng)的增殖抑制活性。其中，化合物4a活性最優(yōu)，PI3Kα抑制活性(IC50)為1.63 nM，對(duì)受試細(xì)胞株(PC3、HCT116)增殖抑制的IC50分別達(dá)到了0.37、2.47 μM，其活性優(yōu)于陽性對(duì)照BEZ-235。激酶選擇性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，化合物4a為泛PI3K/mTOR雙重抑制劑，其對(duì)PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ及mTOR的抑制作用(IC50)分別為6.91、0.38、2.14、3.26 nM。Western blot實(shí)驗(yàn)證明化合物4a確實(shí)可明顯抑制底物蛋白pAkt(Ser473)的磷酸化。

圖4 4-炔基喹啉類PI3K/mTOR雙重抑制劑Fig.4 The discovery of 4-alkyne-quinoxaline derivatives as PI3K/mTOR dual inhibitors

2.3 Akt抑制劑 Akt處于PI3K-Akt-mTOR通路的核心位置，與腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因的調(diào)控密切相關(guān)。隨著Akt結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制的不斷闡明，小分子Akt抑制劑在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用受到越來越廣泛的關(guān)注，目前已有大量不同結(jié)構(gòu)類型的小分子Akt抑制劑被報(bào)道[37-38]。根據(jù)這些抑制劑與Akt的作用方式主要可分為三大類：①磷脂酰肌醇(PIP)類似物抑制劑；②變構(gòu)抑制劑；③ATP競爭性抑制劑。自2000年以來，先后有10多個(gè)Akt抑制劑進(jìn)入臨床研究階段，其中研究最深入的當(dāng)屬磷脂酰肌醇(PIP)類似物抑制劑Perifosine，它在早期的臨床階段對(duì)多種腫瘤顯示出較好的治療作用，盡管在治療多發(fā)性骨髓瘤和頑固性結(jié)直腸癌III期臨床試驗(yàn)中最后以失敗告終，然而其作為首例Akt候選藥物對(duì)該領(lǐng)域的新藥研發(fā)有著關(guān)鍵的指導(dǎo)意義。第2個(gè)基于ATP競爭機(jī)制的GSK690693是唯一通過靜注給藥進(jìn)入臨床研究的小分子Akt抑制劑，由于在I期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出高血糖副作用而中止；處于II期臨床試驗(yàn)階段的還有2個(gè)高活性的Akt抑制劑Uprosertib(GSK2141795)和Afuresertib(GKS2110183)[39-40]，主要以聯(lián)合用藥方式開展藥效評(píng)估。Akt變構(gòu)抑制劑MK2206[41-42]臨床進(jìn)展迅速，目前已啟動(dòng)了多項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)，用于多種實(shí)體瘤的治療。Akt變構(gòu)抑制劑ARQ092用作實(shí)體瘤治療藥物已進(jìn)入Ib階段。GDC-0068是唯一實(shí)現(xiàn)PKA選擇性的ATP競爭性抑制劑[43]，I期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示其與一般化療藥聯(lián)合使用對(duì)多種實(shí)體瘤有明顯治療作用，且毒性可控，現(xiàn)也已進(jìn)入II期臨床階段。AZD5363也是一個(gè)很有潛力的ATP競爭性Akt抑制劑[44]，與PARP抑制劑奧拉帕尼(Olaparib)聯(lián)用取得了可喜的臨床I期數(shù)據(jù)，目前關(guān)于AZD5363組合物的II期臨床試驗(yàn)正在開展。

本課題組在尋找結(jié)構(gòu)新穎的Akt抑制劑方面目前已取得了一些進(jìn)展，獲得了多個(gè)具有進(jìn)一步發(fā)展前景的候選藥物分子，表述如下：

① 黃酮類衍生物：針對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的24個(gè)結(jié)構(gòu)多樣的ATP競爭性Akt1抑制劑進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系，采用Catalyst軟件包構(gòu)建了Akt1的藥效團(tuán)模型，并進(jìn)行虛擬篩選，同時(shí)結(jié)合SYBYL/FlexiDock程序的評(píng)價(jià)結(jié)果，優(yōu)選了9個(gè)化合物進(jìn)行Akt1活性測試，發(fā)現(xiàn)了Akt1抑制活性中等(IC50：5.4μM)但結(jié)構(gòu)新穎的Akt抑制劑異戊烯基黃酮類化合物5[45]，Western blot證明該化合物能明顯抑制底物蛋白pGSK3β的磷酸化。此外，藥效團(tuán)模型和分子對(duì)接模型均指出，該化合物的異戊烯基片段與Akt1活性口袋的甘氨酸富集區(qū)Phe161存在疏水作用，為活性所必須。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，采用末端含疏水基團(tuán)的Mannich堿替代異戊烯基以簡化該類化合物的合成方法(以天然黃酮類化合物經(jīng)一步Mannich化即可獲得目標(biāo)化合物)[46]，結(jié)果表明，N-甲基芐胺取代的槲皮素Mannich化產(chǎn)物6c的活性與異戊烯基黃酮類化合物5相當(dāng)，其Akt1抑制活性(IC50)為5.28 μM，對(duì)HL-60、OVCAR-8、PC-3、HepG2腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性(IC50)分別達(dá)到了7.56、16.69、15.45、7.20 μM(見圖5)。與此同時(shí)，基于所構(gòu)建的藥效團(tuán)模型，發(fā)現(xiàn)了異補(bǔ)骨脂黃酮(IBC，一類異戊烯基查耳酮類衍生物)[47]可通過ATP競爭性的方式可逆的抑制Akt的催化磷酸化活性，表明IBC可直接作用于Akt激酶并抑制其活性，IC50值為32.90 μM。研究還發(fā)現(xiàn)，IBC作用后，OVCAR-8和PC3細(xì)胞中Akt在Ser-473位點(diǎn)的磷酸化迅速下降，而且IBC還可抑制OVCAR-8和PC3細(xì)胞中Akt下游GSK3β及其他底物的磷酸化。Akt的活化須先后經(jīng)歷2個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，分別是Thr-308和Ser-473位點(diǎn)。IBC引起的Akt活化的減少主要是由于Ser-473位點(diǎn)磷酸化的下降引起的，而Thr-308位點(diǎn)的磷酸化水平基本不受IBC調(diào)控，表明IBC并不影響PI3K和PDK1依賴的Thr-308位點(diǎn)的磷酸化。

圖5 黃酮類Akt抑制劑的發(fā)現(xiàn)Fig.5 The discovery of flavonoid derivatives as Akt inhibitors

② 二苯甲胺類衍生物：以臨床I期候選藥物AT13148為先導(dǎo)化合物，在藥效團(tuán)模型和分子對(duì)接模型的指導(dǎo)下，通過在二苯甲胺的氨基上引入不同的側(cè)鏈基團(tuán)，考察二級(jí)胺取代類型的衍生物對(duì)Akt抑制活性和激酶選擇性等的影響，同時(shí)采用生物電子等排原理，用3-取代吡啶、4-取代對(duì)位吡啶、4-取代吡唑等基團(tuán)來代替先導(dǎo)物結(jié)構(gòu)中的嘌呤環(huán)，獲得了一系列二苯甲胺類衍生物7(見圖6)[48]。體外抗腫瘤活性研究表明，所合成的化合物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株(OVCAR-8、HL60、HCT116)均顯示了中等到強(qiáng)的抑制活性，其中位阻性基團(tuán)叔丁基取代在二苯甲胺上時(shí)Akt1活性最優(yōu)(IC50=38 nM)，化合物7d對(duì)所有細(xì)胞株(OVCAR-8、HL60和HCT116)均具有明顯的抑制作用，IC50值在5.3～8.9 μM之間。同時(shí)，化合物7d表現(xiàn)出良好的激酶選擇性，對(duì)PKC的選擇性達(dá)到了85倍，而對(duì)Aurora A、Drak、IKKb、GSK3b、SYK和JAK2等激酶不存在明顯抑制。表明在二苯甲胺的氨基上引入大位阻基團(tuán)仍可以保持其強(qiáng)效的Akt抑制活性，同時(shí)能提高其對(duì)PKC等激酶的選擇性，該結(jié)果為選擇性Akt抑制劑的研究提供了一種新的策略。

圖6 二苯甲胺類衍Akt抑制劑的發(fā)現(xiàn)Fig.6 The discovery of diphenylamine derivatives as Akt inhibitors

③ 4-氨基嘧啶類衍生物：為提高Akt激酶分子對(duì)接模型的預(yù)測準(zhǔn)確度和可靠性，采用Discovery Studio軟件，獲得打分函數(shù)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，整合配體分子與關(guān)鍵氨基酸殘基(Glu228，Ala230，Glu234，Glu292和Phe163)的相互作用力和分子描述符(ClogP、tPSA)等參數(shù)，并采用人工智能技術(shù)(支持向量機(jī)，SVM)建立了非線性的定量構(gòu)效關(guān)系(MD-QSAR)模型，極大地提高了分子對(duì)接模型的預(yù)測能力，其對(duì)訓(xùn)練集、測試集以及交叉驗(yàn)證數(shù)據(jù)集的預(yù)測準(zhǔn)確度(R2)分別達(dá)到了0.948、0.907、0.794[49]。隨后將該模型用于指導(dǎo)4-氨基嘧啶類衍生物的設(shè)計(jì)，并合成了2個(gè)系列目標(biāo)化合物8和9用于對(duì)模型的反驗(yàn)證工作(見圖7)?；钚詼y試結(jié)果表明，所獲得的化合物表現(xiàn)出中等到強(qiáng)的Akt抑制活性和腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，其中化合物9c活性最優(yōu)(IC50=7.7 nM)，對(duì)腫瘤細(xì)胞株(OVCAR-8，HCT116)均有明顯的抑制作用，IC50值分別為22.67、5.15 μM。結(jié)果表明整合了分子對(duì)接和人工智能技術(shù)的新型QSAR模型將有助于開展針對(duì)某一個(gè)特定結(jié)構(gòu)類型抑制劑的理性藥物設(shè)計(jì)工作。

圖7 4-氨基嘧啶類Akt抑制劑Fig.7 The discovery of 4-aminopyrimidine derivatives as Akt inhibitors

④ 吡唑-呋喃甲酰胺類衍生物：構(gòu)象限制策略是一種經(jīng)典的藥物設(shè)計(jì)方法，可降低分子的柔性、改善分子與靶標(biāo)的結(jié)合力同時(shí)也改善藥代動(dòng)力學(xué)行為，并產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)骨架[50-51]。本課題組以GSK2141795和AT-7867作為先導(dǎo)，采用構(gòu)象限制、駢合原理等理性藥物設(shè)計(jì)方法，考察不同的連接鏈對(duì)活性的影響，成功設(shè)計(jì)、合成了一系列構(gòu)象相對(duì)穩(wěn)定的吡唑-呋喃甲酰胺類衍生物[52](見圖8)。大部分目標(biāo)分子呈現(xiàn)出中等到強(qiáng)的Akt1抑制活性，化合物10 d是該類結(jié)構(gòu)骨架中與先導(dǎo)分子GSK2141795最相近的分子，其亦被證實(shí)為該系列活性最優(yōu)化合物，IC50=61 nM，對(duì)腫瘤細(xì)胞(HCT116、OVCAR-8)均具有明顯的抑制作用，IC50值分別為9.76、7.76 μM。在激酶選擇性方面，化合物10d對(duì)AGC家族的激酶均表現(xiàn)出強(qiáng)效的抑制作用，包括對(duì)Akt2、Akt3、ROCK1、MSK1、PRKG1、PSK1、P70S6K和PKA，在0.5 μM濃度下，抑制率均超過了80%。而對(duì)非AGC家族的激酶該化合物又表現(xiàn)出非常高的選擇性，即使在10 μM濃度下，對(duì)ABL、JAK2、BRAF、CHK1、PI3K、mTOR、CDK2、GSK3β、AuroraA等激酶不存在明顯抑制。此外，Western blot實(shí)驗(yàn)證明化合物10d能明顯抑制Akt底物蛋白pGSK3β的磷酸化(PC-3細(xì)胞)，進(jìn)一步ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物10d對(duì)于LNCaP細(xì)胞中Akt底物蛋白PRAS40的磷酸化抑制活性高達(dá)30.4 nM。

圖8 吡唑-呋喃甲酰胺類Akt抑制劑的發(fā)現(xiàn)Fig.8 The discovery of pyrazole-furoylamide derivatives as Akt inhibitors

2.4 mTOR抑制劑 雷帕霉素類mTOR變構(gòu)抑制劑已在臨床用于抗腫瘤治療，但它只能選擇性抑制mTORC1，對(duì)mTORC2無抑制作用，因而其在臨床上適用的腫瘤譜很窄。有研究表明可通過發(fā)展ATP-競爭性mTOR的抑制劑(同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2)來增強(qiáng)其抗腫瘤作用，因?yàn)檫@類抑制劑可顯著抑制mTORC1，通過下調(diào)4E-BP1的磷酸化水平進(jìn)而有效地干預(yù)腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物合成[53-54]，同時(shí)，抑制mTORC2，降低Akt的磷酸化水平，可有效避免S6K/IRS1/PI3K負(fù)反饋通路釋放導(dǎo)致的Akt磷酸化水平升高。因而，ATP-競爭性mTOR的抑制劑不僅有望提高治療效果，還能拓寬mTORC1抑制劑的抗瘤譜，使患者在更大程度上獲益。目前，處于臨床研究的小分子mTOR激酶抑制劑主要包括PI3K/mTOR雙重抑制劑和mTOR選擇性抑制劑，前者已在前文表述，后者的代表性化合物主要有AZD-2014、MLN-0128和CC-223等。

本課題組在咪唑酮并喹啉類PI3K/mTOR雙重抑制劑BEZ-235的結(jié)構(gòu)上采用破環(huán)策略，發(fā)現(xiàn)了高活性的mTOR選擇性抑制劑，簡述如下：

3,4-二取代氨基喹啉類：在Torin2和BEZ-235化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，一方面保留了Torin2和BEZ-235結(jié)合鉸鏈區(qū)所必需的喹啉部分，采用開環(huán)策略并結(jié)合分子內(nèi)氫鍵來維系其空間構(gòu)象，另一方面考察喹啉母核C-3位不同取代基團(tuán)(如氨基、乙酰胺基、甲磺酰胺基、三氟乙酰胺基和特戊酰胺基等)以及C-4位不同取代苯胺片段、C-6為不同雜環(huán)片段對(duì)活性的影響，獲得了2個(gè)系列3,4-二取代氨基喹啉衍生物11和12[55-56](見圖9)?；钚詼y試結(jié)果表明，絕大多數(shù)4-取代氨基喹啉衍生物呈現(xiàn)出中等到強(qiáng)的mTOR抑制活性，近半數(shù)化合物抑酶活性突出，與陽性對(duì)照PI-103相當(dāng)。構(gòu)效關(guān)系研究表明，喹啉C-6位為喹啉或2-氨基吡啶取代的化合物活性明顯較優(yōu)，C-3位隨著取代基團(tuán)的增大其mTOR抑制活性的顯著降低，喹啉C-4位不同的取代苯胺片段對(duì)活性影響不明顯。以針對(duì)Torin2開環(huán)修飾所得的化合物11e為例，其mTOR抑制活性達(dá)到了31nM，而且對(duì)HCT-116、PC-3和MCF-7均具有顯著的增殖抑制活性，IC50分別為1.29、3.90、0.44 μM。11e對(duì)4種ClassI PI3Ks的抑制效果均不明顯(PI3Kα：2427 nM,PI3Kβ>5000nM，PI3Kγ：939nM，PI3Kδ>5000 nM)，顯示了很高的選擇性?；衔?1e在MCF-7細(xì)胞株中對(duì)pS6(Ser235)和pAkt(Ser473)的下調(diào)作用。pS6(Ser235)和pAkt(Ser473)在本研究中可作為mTORC1和mTORC2的生物標(biāo)志物，pAkt(Ser473)水平的升高提示S6K/IRS1/PI3K負(fù)反饋通路的釋放。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，11e和BEZ-235在0.5 μM濃度下均可顯著下調(diào)pS6(Ser235)、pAkt(Ser473)水平，提示11e可同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2。相比之下，相同濃度的雷帕霉素在下調(diào)pS6(Ser235)水平的同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致pAkt(Ser473)水平的上調(diào)，從而提示S6K/IRS1/PI3K負(fù)反饋通路的釋放。因而，11e可通過mTORC1、mTORC2的雙重抑制，有效避免雷帕霉素選擇性抑制mTORC1時(shí)負(fù)反饋通路釋放導(dǎo)致的pAkt(Ser473)水平升高。

圖9 3,4-二取代氨基喹啉類mTOR抑制劑Fig.9 The discovery of 3,4-disubsituted amino-quinoline derivatives as mTOR inhibitors

3 結(jié)語

PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，該信號(hào)通路的多個(gè)關(guān)鍵蛋白也是熱門的藥物作用靶點(diǎn)，與此相關(guān)的小分子抑制劑的研發(fā)已經(jīng)獲得了良好進(jìn)展，和化療藥物及其他靶點(diǎn)藥物聯(lián)合用藥能發(fā)揮強(qiáng)效的協(xié)同抗腫瘤活性。因此以PI3K-Akt-mTOR通路為靶點(diǎn)開發(fā)抗腫瘤小分子抑制劑將具有很好的前景。針對(duì)該通路不同關(guān)鍵蛋白，目前已有數(shù)十個(gè)候選藥物進(jìn)入了臨床研究，包括泛PI3K抑制劑、亞型選擇性PI3K抑制劑、PI3K/mTOR雙重抑制劑、Akt抑制劑、mTOR選擇性抑制劑。近年來，本課題組針對(duì)該通路的PI3K、Akt、mTOR蛋白，開展了一系列的合理藥物設(shè)計(jì)、合成和抗腫瘤活性評(píng)價(jià)工作，并發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物，為靶向PI3K-Akt-mTOR通路的小分子抑制劑的研究提供了新的思路和構(gòu)效關(guān)系研究的數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)，還優(yōu)選了一些活性高效的小分子抑制劑(PI3K/mTOR雙重抑制劑、Akt抑制劑)，目前正在開展體內(nèi)藥效、作用機(jī)制和成藥性研究。

值得注意的是，不同類型的PI3K-Akt-mTOR通路靶向抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)略有不同，靶向該通路抑制劑與受體酪氨酸激酶抑制劑、靶向下游蛋白的抑制劑或者旁路蛋白的抑制劑聯(lián)合用藥在臨床前的研究中表現(xiàn)突出，目前已經(jīng)在臨床上來考察是否具有能發(fā)揮最大的抗腫瘤效應(yīng)，然而其臨床療效受多方面因素的影響，因此，極有可能需要根據(jù)不同的腫瘤類型來確定抑制劑的組合類型和使用方法。同時(shí)，還需要去發(fā)現(xiàn)一些新的生物標(biāo)志物，盡可能避免使用一些在過去的靶向治療研究中采取的不確定的或者偶然成功的方法。

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(編校：吳茜)

作 者 簡 介

何俏軍，博士，2005年畢業(yè)于浙江大學(xué)，目前為浙江大學(xué)藥學(xué)院教授，博導(dǎo)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才，任浙江大學(xué)藥理毒理研究所所長和浙江大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心主任。

何俏軍教授研究領(lǐng)域主要包括：關(guān)鍵蛋白的翻譯后調(diào)控模式在腫瘤分化及藥物毒性過程中發(fā)揮的作用及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并基于此發(fā)現(xiàn)調(diào)控分化和藥物毒性防治的新靶點(diǎn)和新型小分子藥物。主持國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目和重大研究計(jì)劃項(xiàng)目、國家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)等國家級(jí)科研項(xiàng)目9項(xiàng)，在Oncogene,FASEBJ,CancerResearch,MolecularCancerTherapeutics等國際知名刊物發(fā)表SCI論文135余篇，獲授權(quán)發(fā)明專利19項(xiàng)。獲教育部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、浙江省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、中國專利優(yōu)勝獎(jiǎng)等獎(jiǎng)項(xiàng)。并獲得浙江省自然科學(xué)基金杰青團(tuán)隊(duì)、浙江省“新世紀(jì)151人才工程”一層次、浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才等人才項(xiàng)目的支持，浙江省青年科技獎(jiǎng)獲得者。任中國毒理學(xué)會(huì)毒理學(xué)替代法與轉(zhuǎn)化毒理學(xué)專業(yè)委員會(huì)常務(wù)委員、中國抗癌協(xié)會(huì)抗癌藥物專業(yè)委員會(huì)委員、中國藥理學(xué)會(huì)腫瘤藥理與化療專業(yè)委員會(huì)委員、中國藥學(xué)會(huì)毒理學(xué)藥物毒理與安全性評(píng)價(jià)專業(yè)委員會(huì)委員、浙江省藥學(xué)會(huì)藥物毒理學(xué)專業(yè)委員會(huì)主任委員。

Research progress of small molecule inhibitors targeting PI3K-Akt-mTOR pathway

HE Qiao-junΔ, DONG Xiao-wu, ZHU Hong, HU Yong-zhou, YANG Bo

(Institute of Pharmacology and Toxicology,Institute of Drug Discovery and Design, Zhejiang Province Key Laboratory of Anti-Cancer Drug Research,College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Aberrant activation of the phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)- protein kinase B(PKB,Akt)- mammalian target of rapamycin(mTOR)pathway is commonly observed in human cancer and is critical for cell survival,proliferation and differentiation.A variety of small molecule inhibitors targeting PI3K-Akt-mTOR pathway are under clinical studies.This review will summarize the recent studies in terms of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway and cancer,research progress of the antitumor activity possessed by PI3K-Akt-mTOR inhibitors,as well as the recent research in the related field conducted by our group.

PI3K-Akt-mTOR pathway;small molecular inhibitor;cancer

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.002

何俏軍，通信作者，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤分子藥理學(xué)，E-mail：qiaojunhe@zju.edu.cn。

R732

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