鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的提取及脂肪酸組成分析

宋玉昆，李翼岑，祁立波，辛丘巖，夏永濤，宋 亮，*（.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 604；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 604；.杭州千島湖鱘龍科技開(kāi)發(fā)有限公司，浙江 杭州 700）

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鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的提取及脂肪酸組成分析

宋玉昆1，2，李翼岑1，祁立波1，2，辛丘巖1，2，夏永濤3，宋 亮1，2，*
（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.杭州千島湖鱘龍科技開(kāi)發(fā)有限公司，浙江 杭州 311700）

以西伯利亞鱘魚(yú)卵為原料，比較不同提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率、脂肪酸及脂質(zhì)組成的影響。采用索氏提取、酶輔助有機(jī)溶劑和超臨界CO2三種不同的方法提取鱘魚(yú)卵中的脂質(zhì)，并分析鱘魚(yú)卵脂肪酸組成及脂質(zhì)組成。結(jié)果顯示，不同提取方法對(duì)所得到的鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的提取率和脂肪酸的相對(duì)含量有顯著的影響（P＜0.05），對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的脂肪酸種類和脂質(zhì)組成沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。索氏提取法的提取率為（23.71±1.82）%，中性蛋白酶酶解輔助有機(jī)溶劑法的提取率為（15.47±1.21）%，超臨界CO2萃取法的提取率為（10.43±2.16）%。鱘魚(yú)卵脂質(zhì)中含有17 種脂肪酸，包括6 種飽和脂肪酸，4 種單不飽和脂肪酸，7 種多不飽和脂肪酸，其中總不飽和脂肪酸含量達(dá)到70%以上，多不飽和脂肪酸含量達(dá)到17%以上。不同提取方法提取鱘魚(yú)卵脂質(zhì)中均含有甘油三酯、膽固醇、極性脂質(zhì)，其中甘油三酯相對(duì)含量達(dá)到89%以上。

鱘魚(yú)卵；脂質(zhì)提??；脂肪酸組成

鱘魚(yú)（Acipenseridae sturgeon）是世界上現(xiàn)有魚(yú)類中體形大、壽命長(zhǎng)、最古老的輻鰭魚(yú)類，已有2億多年的歷史，被譽(yù)為“水中活化石”［1］。中國(guó)是世界鱘魚(yú)品種最多、分布最廣、資源最為豐富的國(guó)家之一。由于鱘魚(yú)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益好，伴隨鱘魚(yú)人工繁殖技術(shù)的日益成熟，我國(guó)鱘魚(yú)養(yǎng)殖總量不斷增長(zhǎng)［2］，因此受到廣泛關(guān)注。

經(jīng)鱘魚(yú)卵加工而成的魚(yú)籽醬是馳名中外的高檔營(yíng)養(yǎng)食品，有“黑色黃金”之稱，與鵝肝、松露稱為“世界三大美食”，素有“黑色黃金”之稱［3］。鱘魚(yú)卵作為魚(yú)籽醬的加工原料，其脂質(zhì)是評(píng)估鱘魚(yú)卵營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與可利用價(jià)值的重要組成部分，對(duì)開(kāi)發(fā)具有特殊營(yíng)養(yǎng)功能產(chǎn)品具有重要的指導(dǎo)意義與理論價(jià)值。目前，有關(guān)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)研究較少，大多集中于對(duì)不同品種鱘魚(yú)魚(yú)籽醬脂肪酸的比較［4］、野生和養(yǎng)殖鱘魚(yú)籽醬的脂肪酸比較［5］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析俄羅斯鱘魚(yú)不同部位脂肪酸組成［6］、酶法提取鱘魚(yú)油工藝的研究［7］等，但不同提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的組成及脂肪酸的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以西伯利亞鱘魚(yú)卵為原料，采用索氏提取法、酶輔助有機(jī)溶劑法以及超臨界CO2萃取法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)進(jìn)行提取，并對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的脂肪酸組成以及脂質(zhì)組成進(jìn)行分析，以期為研究鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)功能及更好地綜合開(kāi)發(fā)和利用鱘魚(yú)卵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

西伯利亞鱘魚(yú)卵，浙江省衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技有限公司提供。將新鮮鱘魚(yú)卵經(jīng)冷凍干燥，研磨粉碎得到凍干粉，鱘魚(yú)卵凍干粉置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

中性蛋白酶 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；正己烷、甲醇、H2SO4、氫氧化鉀、乙醚、無(wú)水硫酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

粗脂肪測(cè)定儀 上海新嘉電子有限公司；pH計(jì)德國(guó)Satorius公司；棒狀薄層色譜-火焰離子化檢測(cè)儀日本Mitsubishi Kagaku Latron公司；超臨界萃取裝置江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解度的測(cè)定

采用pH-Stat法［8］進(jìn)行酶解度的測(cè)定，以滴定所消耗的濃度標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液（1 mol/L）體積計(jì)算酶解度。其計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中：B為保持pH值不變所消耗的堿（NaOH）的體積/mL；Nb為堿（NaOH）的當(dāng)量濃度/（mol/L）；Mp為底物中蛋白總量/g；htot為物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)/（mmol/g），本研究中htot以7.5 mmol/g計(jì)；α為酶解過(guò)程中α-氨基的解離度，計(jì)算見(jiàn)公式（2）：

式中：pH值為pK進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解時(shí)的值。

1.3.2 鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率

鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率和脂質(zhì)回收率的計(jì)算見(jiàn)公式（3）、（4）：

1.3.3 索氏提取法提取鱘魚(yú)卵脂質(zhì)

采用索氏提取法提取總脂質(zhì)，使用濾紙將2 g鱘魚(yú)卵干粉末包好后置于索氏提取器中，以無(wú)水乙醚作為提取溶劑，回流提取10 h。將溶有鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的乙醚在35 ℃條件下氮吹至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量后存于-20 ℃?zhèn)溆茫?］。

1.3.4 酶輔助有機(jī)溶劑法提取鱘魚(yú)卵脂質(zhì)

準(zhǔn)確稱取50 g的鱘魚(yú)卵凍干粉，加入200 mL去離子水，采用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，在50 ℃恒溫水浴中加熱并進(jìn)行磁力攪拌，向其中加入0.3 g（217 000 U/g）的中性蛋白酶進(jìn)行酶解。加酶的時(shí)間記為時(shí)間點(diǎn)0，分別在5、10、20、30、40、60、120、180、240 min時(shí)記錄耗堿量，每次收集3 mL酶解液，酶解液煮沸10 min滅酶。冷卻后向其中加入5 mL正己烷搖勻，在5 000×g條件下離心10 min，吸出上清液，再重復(fù)此提取過(guò)程，合并上清液，35 ℃條件下氮吹至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量后保存于-20 ℃?zhèn)溆茫?0］。

脂肪的回收率用公式（5）計(jì)算：

1.3.5 超臨界CO2萃取法提取鱘魚(yú)卵脂質(zhì)

稱取30 g鱘魚(yú)卵干粉置于萃取釜中，升壓升溫后進(jìn)行萃取，其萃取條件為：分離壓力8～10 MPa、分離溫度54 ℃、萃取壓力28 MPa、萃取溫度50 ℃、CO2流速20 L/h、萃取時(shí)間90 min。萃取完成后，將所收集脂質(zhì)稱質(zhì)量，存于-20 ℃?zhèn)溆茫?1］。

1.3.6 鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的脂肪酸組成分析

1.3.6.1 樣品的甲酯化

取0.1 g鱘魚(yú)卵脂質(zhì)加入2 mL 0.5 mol/L KOH-CH3OH溶液，混勻后置于四氟乙烯墊片旋蓋小瓶中，充氮密封后于60 ℃加熱皂化2 h，直至澄清透明油滴消失為止。皂化混合液冷卻至室溫后滴加6 mol/L HCl溶液pH 1.0以下，再用正己烷萃取可皂化物，每次加入2 mL，萃取5次，35 ℃條件下氮吹至恒質(zhì)量?？稍砘镏屑尤?.5 mL正己烷溶解后，加入2 mL甲基化試劑（含1%硫酸的色譜級(jí)甲醇溶液），70 ℃水浴加熱1 h，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，加入1 mL去離子水，吸取含有脂肪酸甲酯的正己烷層，加入適量無(wú)水硫酸鈉吸收多余水分，過(guò)夜備用［12］。1.3.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析

利用7 8 9 0 A-5 9 7 5 C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行脂肪酸甲酯分析。色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），氦氣為載氣。脂肪酸甲酯分析條件：初始溫度50 ℃，保持1 min；以50 ℃/min速率升至170 ℃；再以4 ℃/min的速率升至300 ℃，然后以40 ℃/min升到320 ℃，保持3.6 min。質(zhì)譜分析采用電子電離源（70 eV），選取Scan模式，掃描范圍為m/z 50～550，溶劑延遲4 min。在脂肪酸的分析中，根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜中各組分保留時(shí)間以及質(zhì)譜圖，通過(guò)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和NIST 08庫(kù)檢索進(jìn)行鑒定，采用峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的組成［13］。

1.3.7 棒狀薄層色譜-氫火焰離子化法測(cè)定鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的組成分析

取10 mg鱘魚(yú)卵脂質(zhì)，加入1 mL的三氯甲烷，將1 μL試樣溶液點(diǎn)在色譜棒（Chromia-rod-SⅢ型硅膠棒）原點(diǎn)上，展開(kāi)液為正庚烷-乙醚-甲酸（42∶28∶0.3，V/V），展開(kāi)之后，將色譜棒放入色譜棒干燥器，在60 ℃條件下干燥5 min去除展開(kāi)劑，展開(kāi)劑完全被清除后，將色譜棒架放入掃描架中進(jìn)行掃描。氫氣作載氣，流量：160 mL/min；空氣流量：2 000 mL/min；掃速率：30 s/掃描（分析測(cè)試），掃描結(jié)果采用配套分析軟件（i-Chormstar 6.3）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理［14］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶解度對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率的影響

正己烷是工業(yè)中普遍用有機(jī)溶劑，常用作脂質(zhì)的提取溶劑，而水酶法提取脂質(zhì)的方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于沙丁魚(yú)頭和內(nèi)臟［15］、墨魚(yú)內(nèi)臟［16］、虹鱒魚(yú)魚(yú)籽［17］等脂質(zhì)的提取。本研究采用中性蛋白酶酶解鱘魚(yú)卵后，結(jié)合正己烷提取脂質(zhì)，以期達(dá)到最大的鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率。據(jù)報(bào)道［18］在水酶法提取脂質(zhì)過(guò)程中，底物的酶解度是影響脂肪提取率的關(guān)鍵因素，酶解度和游離脂質(zhì)得率之間的關(guān)系非常復(fù)雜，盡管高酶解度意味著更多的“游離脂質(zhì)”被釋放出來(lái)，但也會(huì)釋放更多起表面活性劑作用的蛋白和肽鏈，這就使得游離脂質(zhì)很難被分離，從而影響整體得率。因此，為了考察酶解度和脂肪產(chǎn)量的相關(guān)性，利用正己烷對(duì)不同酶解程度的樣品中的脂質(zhì)進(jìn)行提取。

圖1 酶解度對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of degree of hydrolysis on lipid yield from sturgeon eggs

由圖1可看出，脂質(zhì)回收率隨著酶解度的增加而逐漸升高，在酶解進(jìn)行至120 min后達(dá)到最大值并達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)鱘魚(yú)卵的酶解度為25.96%，其脂質(zhì)回收率達(dá)到的64.19%。這表明了底物的酶解度在酶解輔助有機(jī)溶劑提取中影響脂肪提取率的關(guān)鍵因素。主要是因?yàn)橹行缘鞍酌笇|(zhì)的蛋白質(zhì)酶解，將脂質(zhì)釋放出來(lái)［19］。

2.2 不同提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率的影響

圖2 不同提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction methods on lipid yield from eggs

如圖2所示，不同的提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的提取率有顯著影響（P＜0.05）。索氏提取法的提取率為（23.71±1.82）%，酶輔助有機(jī)溶劑法的提取率為（15.47±1.21）%，而超臨界CO2萃取法提取脂肪的提取率為（10.43±2.16）%。Zhou Dayong等［20］關(guān)于扇貝性腺脂質(zhì)的研究中，采用超臨界CO2萃取法的脂質(zhì)提取率高于酶輔助有機(jī)溶劑的脂質(zhì)提取率，這與本研究的結(jié)果不一致，推測(cè)可能是由于提取脂質(zhì)的原料不同以及提取工藝條件不同所造成，有待于進(jìn)一步研究。

在本研究中，索式提取法提取的鱘魚(yú)卵脂質(zhì)含量最高，但操作相對(duì)繁瑣，提取溫度較高，時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致鱘魚(yú)脂質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)損失。超臨界CO2萃取法是一種安全、無(wú)污染的提取方法［21］，但其運(yùn)行和維護(hù)成本較高，且此方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的提取效率較低。采用酶輔助溶劑法提取率相對(duì)較高，不需要特殊設(shè)備，且操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、提取溫度低，是一種比較適合提取鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的方法。

2.3 鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的脂肪酸組成分析

表1 鱘魚(yú)卵脂質(zhì)脂肪酸分析Table 1 Fatty acid compositi on of s turge on egg lipids

由表1所示，不同的提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)脂肪酸相對(duì)含量有顯著的影響（P＜0.05），對(duì)脂肪酸種類沒(méi)有影響，Spiric等［22］也發(fā)現(xiàn)不同提取方法會(huì)明顯影響鯉魚(yú)脂質(zhì)中脂肪酸相對(duì)含量，可能主要因?yàn)樗魇咸崛￠L(zhǎng)時(shí)間回流提取且溫度較高，導(dǎo)致不飽和脂肪酸雙鍵斷裂。正己烷和CO2的極性不同，提取的脂質(zhì)中各個(gè)組分比例有所差異［23］，最終導(dǎo)致脂肪酸的相對(duì)含量有所不同。

鱘魚(yú)卵脂質(zhì)中含有1 7 種常見(jiàn)脂肪酸，其中SFA 6 種、MUFA 4 種、PUFA 7 種。SFA相對(duì)含量在24%～26%之間，MUFA占53%～56%，而PUFA占了17%～21%，其中相對(duì)含量最多的是油酸，占總含量的45%左右，其次是棕櫚酸（19%～21%）和DHA （9%～12%）。黃艷青等［24］研究的養(yǎng)殖鱘魚(yú)魚(yú)籽醬營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析及比較中，西伯利亞鱘魚(yú)中油酸含量在33.19%，與本研究差別較大，可能主要原因是生長(zhǎng)環(huán)境喂養(yǎng)飼料以及季節(jié)不同，導(dǎo)致脂肪酸含量有差別。

2.4 棒狀薄層色譜-氫火焰離子化法測(cè)定鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的組成

如圖3所示，棒狀薄層色譜-氫火焰離子化法分析樣品中出現(xiàn)了3 個(gè)峰，表明鱘魚(yú)卵脂質(zhì)中主要有3種物質(zhì)，分別為甘油三酯、膽固醇和極性脂質(zhì)，這與Yin Fawen等［25］檢測(cè)到南極磷蝦脂質(zhì)組成的結(jié)果相一致。其中甘油三酯相對(duì)含量較高達(dá)到90%左右，其次是極性脂質(zhì)相對(duì)含量為8%左右，而膽固醇相對(duì)含量最少占1%左右。同時(shí)表2列出了不同方法提取的鱘魚(yú)卵脂質(zhì)中的脂質(zhì)組成，可以看出，不同提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)組成沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

圖3 棒狀薄層色譜-氫火焰離子化分析圖Fig.3 Thin-layer stick chromatogram of sturgeon egg lipids detected with hydrogen flame ionization detector

表2 鱘魚(yú) 卵脂 質(zhì)的 組成 分析Table 2 Lipid compositi on analysis of sturge on eggsw ithdifferent ex tra cti on m etho ds

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中，采用索氏提取法、酶輔助有機(jī)溶劑法、超臨界CO2萃取3 種方法提取鱘魚(yú)卵脂質(zhì)。結(jié)果表明，不同提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)提取率有顯著影響，索氏提取法脂質(zhì)提取率最高為（23.71±1.82）%，其次是酶輔助有機(jī)溶劑提取法，提取率為（15.47±1.21）%，超臨界CO2萃取法提取得率最低為（10.43±2.16）%。

鱘魚(yú)卵脂質(zhì)通過(guò)利用氣相色譜-質(zhì)譜分析法進(jìn)行脂肪酸分析。結(jié)果表明，不同提取方法對(duì)鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的脂肪酸組成（相對(duì)含量）具有顯著影響，但對(duì)脂質(zhì)的組成沒(méi)有顯著影響。在3 種不同方法提取的鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的脂肪酸分析中，鱘魚(yú)卵脂質(zhì)中含有17 種脂肪酸，包括6 種SFA、4 種MUFA、7 種PUFA，其中不飽和脂肪酸含量達(dá)70%以上，多PUFA含量達(dá)17%以上。3 種不同方法提取的鱘魚(yú)卵脂質(zhì)組成相同，鱘魚(yú)卵脂質(zhì)中含有89%～90%甘油三酯、8%～9%極性脂質(zhì)、1%左右膽固醇。

本研究提供了可用于提取鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的索氏提取法、酶輔助有機(jī)溶劑提取法和超臨界CO2萃取法。但酶輔助有機(jī)溶劑提取法和超臨界CO2萃取法的脂質(zhì)提取率相對(duì)較低，有待于進(jìn)一步研究出優(yōu)化提取方案。

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Extraction and Fatty Acid Composition of Lipid from Sturgeon Eggs

SONG Yukun1，2， LI Yicen1， QI Libo1，2， XIN Qiuyan1，2， XIA Yongtao3， SONG Liang1，2，*
（1.School of Food Science and Technology， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China；2.National Engineering Research Center of Seafood， Dalian 116034， China；3.Hangzhou Qiandaohu Xunlong Technology Development Co.Ltd.， Hangzhou 311700， China）

The effects of different extraction methods on lipid yield， fatty acid composition and lipid composition of sturgeon （Acipenser baerii） eggs were investigated in this study.Lipid was extracted from fish eggs by using the Soxhlet method， the enzyme-assisted solvent method and the supercritical carbon dioxide （SC-CO2） method， respectively.The results showed that the different extraction methods had obvious effects on the lipid yield.The fatty acid compositions of lipids extracted by different methods were slightly different， but the lipid composition of eggs was not significantly affected.Soxhlet extraction with ethyl ether produced a lipid yield of （23.71 ± 1.82）% （on a dry matter basis）.The lipid yield with enzyme-assisted solvent extraction was （15.47 ± 1.21）% from the samples treated with neutral protease， whereas a lipid yield of （10.43 ± 2.16）% was achieved by SC-CO2extraction.A total of 17 fatty acids were found in lipid from eggs， including 6 saturated fatty acids， 4 monounsaturated fatty acids and 7 polyunsaturated fatty acids.The relative contents of unsaturated and polyunsaturated fatty acids were more than 70% and 17%， respectively.There were three dominant lipid components extracted from sturgeon eggs including triglycerides， cholesterol and polar lipids， irrespective of extraction methods.Triglycerides accounted for more than 89% of the total lipids in sturgeon eggs.

sturgeon eggs； lipid extraction； fatty acid composition

10.7506/spkx1002-6630-201614016

Q956

A

1002-6630（2016）14-0092-05

宋玉昆， 李翼岑， 祁立波， 等.鱘魚(yú)卵脂質(zhì)的提取及脂肪酸組成分析［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 92-96.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201614016. http://www.spkx.net.cn

SONG Yukun， LI Yicen， QI Libo， et al.Extraction and fatty acid composition of lipid from sturgeon eggs［J］.Food Science，2016， 37（14）: 92-96.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614016. http://www.spkx.net.cn

2015-09-18

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD04B09）

宋玉昆（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：songyukun@126.com

*通信作者：宋亮（1980—），男，講師，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘钚晕镔|(zhì)開(kāi)發(fā)利用。E-mail：ryo.song@foxmail.com