響應面試驗優(yōu)化果膠酶輔助提取鎖陽原花青素工藝

崔 瑋，張 勇，2，高海寧，2，焦 楊，李彩霞，2，*（.河西學院農業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

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響應面試驗優(yōu)化果膠酶輔助提取鎖陽原花青素工藝

崔 瑋1，張 勇1，2，高海寧1，2，焦 楊1，李彩霞1，2，*
（1.河西學院農業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

利用單因素試驗和響應面法優(yōu)化果膠酶輔助乙醇提取鎖陽原花青素工藝。通過單因素試驗篩選出酶解時間、pH值、酶解溫度、乙醇體積分數(shù)作為影響因素，以鎖陽原花青素提取得率為響應值進行Box-Behnken試驗設計，建立鎖陽原花青素提取得率的二次回歸方程，得到最優(yōu)提取條件。響應面法分析結果表明鎖陽原花青素的最佳提取工藝參數(shù)為：在果膠酶質量分數(shù)為1%時，酶解時間34 min、pH 4.8、酶解溫度52 ℃、用體積分數(shù)70%乙醇溶液浸提1.5 h。該條件下，鎖陽原花青素提取率達14.30%。

鎖陽；果膠酶；原花青素；響應面法

鎖陽（Cynomorium songaricum Rupr.）為鎖陽科鎖陽屬多年生肉質寄生草本植物，分布于我國西北沙漠地帶，主要產地在內蒙古、甘肅、寧夏等［1］。鎖陽又名地毛球、鎖嚴子、銹鐵棒等，具有補腎壯陽、潤腸通便、益精補血等功能［2］。鎖陽含有單寧、固醇類、三萜、黃酮、生物堿、沒食子酸、原花青素等多種生物活性成分［3］。

原花青素是一類多酚類化合物，植物中廣泛存在，具有清除自由基、抗氧化，抗突變、抗癌、抗輻射、預防血栓形成，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、保健品等領域［4-7］。原花青素的提取方法主要有溶劑萃取法［8］、超聲輔助提取法［9-10］、酶法提取法［11］等。

生物酶法（主要是纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等及其復合酶類）是利用酶對植物細胞壁進行降解和破壞，使有效成分充分暴露出來，從而提高有效成分的提取率的技術，該技術是一種新型、高效的綠色提取技術，反應條件溫和、雜質易除、節(jié)約能耗、高效、減少熱敏成分的降解，廣泛地應用于藥品、食品及動植物細胞有效成分的提取［12-15］。禹華娟等［16］用纖維素酶和果膠酶對蓮房原花青素酶解提取，與乙醇提取相比原花青素提高48%；汪志慧等［11］研究雙酶法提取蓮房原花青素，提取率比單一乙醇提取顯著提高；薛昆鵬等［17］研究超聲微波酶解協(xié)同提取油茶殼中原花青素，其結果均高于微波、超聲及超聲-微波協(xié)同提取。

響應面分析法是利用合理的試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數(shù)，能以用較少的試驗數(shù)量和時間對試驗進行全面研究，對因素及其交互作用的影響也可以進行評價，可以有效快速地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件［18］。響應面法雖然廣泛用于眾多過程優(yōu)化控制等領域［19-21］，但關于鎖陽原花青素果膠酶法提取工藝條件的優(yōu)化鮮見報道。本研究以鎖陽為材料，運用響應面法優(yōu)化酶法提取鎖陽中原花青素的工藝，以期為鎖陽的資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖陽2011年4月采于張掖紅沙窩，由河西學院農業(yè)與生物技術學院張勇教授鑒定為鎖陽科植物鎖陽的肉質莖。

果膠酶制劑（多聚半乳糖醛酸酶82%、果膠酯酶16%、果膠裂解酶2%） 上海杰兔工貿有限公司；（+）-兒茶素 上海友思生物技術有限公司；香草醛、甲醇、濃鹽酸、乙醇均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DKB-501數(shù)顯超級恒溫水浴鍋 揚州市三發(fā)電子有限公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；pH510酸度計 安萊立斯儀器科技（上海）有限公司；SHZ-2000循環(huán)水式真空泵 河南省鞏義市英峪予華儀器廠；MiLLROCK冷凍干燥機 美國Commillrock公司；BT125D電子天平 德國Sarstorius公司。

1.3 方法

1.3.1 鎖陽原花青素提取工藝流程

新鮮鎖陽→清洗泥土→切片→冷凍干燥→粉碎過60 目篩→準確稱取鎖陽粉1 g→根據(jù)預設條件添加果膠酶處理→調整乙醇體積分數(shù)為70%浸提一定時間→減壓過濾→上清液定容50 mL→鎖陽原花青素提取液

1.3.2 鎖陽原花青素提取率測定

1.3.2.1 兒茶素標準曲線的繪制

采用香草醛-鹽酸法［22-23］測定鎖陽提取物中原花青素的含量。將兒茶素標準品溶解于甲醇中，配制成0.2 mg/mL的兒茶素標準溶液，分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于試管中，用甲醇補充至0.5 mL，依次加入3.0 mL質量濃度4.0 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸，加塞搖勻，在避光條件下反應15 min后，于500 nm波長處測其吸光度。以兒茶素含量（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制兒茶素標準曲線，得到回歸方程：Y=5.662 9X+0.011 5，相關系數(shù)R2=0.998 3。

1.3.2.2 原花青素提取率的計算

將鎖陽原花青素提取液稀釋20 倍，準確吸取0.5 mL 按1.3.2.1節(jié)的方法操作，于500 nm波長處測定其吸光度，重復3 次，取平均值。按以下公式計算原花青素提取率。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 果膠酶質量分數(shù)對鎖陽原花青素提取率的影響

準確稱取1 g鎖陽粉末5 份，分別加入質量分數(shù)為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的果膠酶10.0 mL （pH值為5的檸檬酸-磷酸緩沖液配制），在50 ℃保溫30 min，冷卻，加入無水乙醇，使其體積分數(shù)為70%，在50 ℃恒溫浸提1 h，減壓過濾，計算原花青素提取率，從中選擇果膠酶最適質量分數(shù)。

1.3.3.2 酶解時間對鎖陽原花青素提取的影響

準確稱取1 g鎖陽粉末5 份，分別加入pH 5質量分數(shù)為1%（根據(jù)1.3.3.1節(jié)的結果取值）果膠酶10 mL，在50 ℃保溫20、30、40、50、60 min，其余條件同1.3.3.1節(jié)，計算提取率?？疾烀附鈺r間對鎖陽原花青素提取的影響。

1.3.3.3 pH值對鎖陽原花青素提取率的影響

準確稱取1 g鎖陽粉末6 份，分別加入pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的質量分數(shù)1%果膠酶10.0 mL，在50℃保溫30 min（根據(jù)1.3.3.2節(jié)的結果取值），其余條件同1.3.3.1節(jié)，計算提取率。考察pH值對原花青素提取的影響。

1.3.3.4 酶解溫度對鎖陽原花青素提取率的影響

準確稱取1 g鎖陽粉末5 份，均加入pH 5（根據(jù)1.3.3.3節(jié)的結果取值）、質量分數(shù)為1%果膠酶10 mL，分別置于溫度為30、40、50、60、70 ℃水浴中保溫30 min，其余條件同1.3.3.1節(jié)，計算提取率。從中選擇最適酶解溫度。

1.3.3.5 乙醇體積分數(shù)對鎖陽原花青素提取率的影響

準確稱取1 g鎖陽粉末5 份，均加入pH 5質量分數(shù)為1%果膠酶10 mL，置于50 ℃（根據(jù)1.3.3.4節(jié)結果取值）保溫30 min，冷卻，加入無水乙醇使其體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%，在50 ℃恒溫浸提1 h，減壓過濾，計算提取率?？疾煲掖俭w積分數(shù)對原花青素提取的影響。

1.3.3.6 浸提時間對鎖陽原花青素提取率的影響

準確稱取1 g鎖陽粉末5 份，加入pH 5質量分數(shù)為1%果膠酶10 mL，置于50 ℃保溫30 min，冷卻，加入無水乙醇使其體積分數(shù)為70%（根據(jù)1.3.3.5節(jié)結果取值），在50 ℃恒溫浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，減壓過濾，計算提取率。

1.3.4 響應面試驗

響應面法試驗設計［18］采用Box-Behnken模型，以酶解時間、pH值、酶解溫度以及乙醇體積分數(shù)為考察因素，分別用X1、X2、X3、X4表示，并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，因素編碼及各自變量水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table1 Factors and l evels used for Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2003和Design-Expert 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 果膠酶質量分數(shù)對鎖陽原花青素提取效果的影響

圖1 果膠酶質量分數(shù)對原花青素提取率的影響Fig.1 Effect of pectinase dosage on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由圖1可知，隨著果膠酶質量分數(shù)的增加，原花青素提取率不斷上升，當果膠酶質量分數(shù)高于1%時，繼續(xù)增加質量分數(shù)，原花青素提取率反而有下降，主要原因是在低質量分數(shù)條件下，底物和酶可較充分地結合，使細胞壁和細胞間的果膠物質充分水解，進而使有效成分溶出。繼續(xù)增加果膠酶質量分數(shù)，底物質量濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制，從而使原花青素的提取率降低。因此，果膠酶質量分數(shù)為1%時，原花青素提取效果最好。

2.1.2 酶解時間對鎖陽原花青素提取效果的影響

圖2 酶解時間對原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由圖2可知，隨著酶解時間的延長，原花青素的提取率不斷增大，當酶解時間達到30 min時，原花青素提取率達到最大，說明酶解反應基本進行徹底；繼續(xù)延長酶解時間，提取率反而有下降。其原因原花青素是酚類成分，隨著酶解時間繼續(xù)延長，原花青素的穩(wěn)定性降低使得氧化程度增高，導致提取率降低，因此，從節(jié)能省時方面綜合分析，酶解時間應以30 min為宜。

2.1.3 pH值對鎖陽原花青素提取效果的影響

圖3 pH值對原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of pH values on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由圖3可知，當pH值在3～5范圍內，隨pH值的升高，原花青素提取率逐漸增大；當pH值大于5.0時，隨pH值的升高，原花青素提取率逐漸降低。說明該酶的最適pH值為5左右，在此條件下，鎖陽的細胞壁降解和破壞程度最大，從而使更多的有效成分釋放到溶劑中，因此酶解液pH值應選擇4～6范圍。

2.1.4 酶解溫度對鎖陽原花青素提取效果的影響

圖4 酶解溫度對原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction efficiency of proanthocyanidins

如圖4所示，當溫度低于50 ℃時，隨著溫度的升高，原花青素的提取率不斷增加；當溫度高于50 ℃時，隨溫度的升高，原花青素的提取率呈現(xiàn)下降的趨勢。這主要是由于溫度對酶促反應的雙重影響：在未達到酶的最適溫度前，升高溫度增加酶和底物分子在內的溶液體系的熱能既可使細胞內活性物質分子運動速率加快，又能提供酶促反應所需的能量，使酶解反應加強，因此原花青素提取率不斷增加；然而溫度繼續(xù)升高會導致維系酶空間結構的非共價鍵斷裂，從而使生物酶變性，酶促反應受到抑制，得率降低［21］。另外溫度影響原花青素的穩(wěn)定性，所以酶解溫度應選擇50 ℃為宜。

2.1.5 乙醇體積分數(shù)對鎖陽原花青素提取效果的影響

圖5 乙醇體積分數(shù)對原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of proanthocyanidins

如圖5所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，原花青素提取率增大，當達到70%時，原花青素提取率最高，而后，乙醇體積分數(shù)再增加，原花青素提取率降低，這是因為一些醇溶性雜質溶出量增加，它們與原花青素競爭和乙醇-水分子結合，從而導致原花青素提取率降低。

2.1.6 浸提時間對鎖陽原花青素提取效果的影響

由圖6可知，隨著浸提時間的延長，原花青素的提取率略有增加，當浸提時間為1.5 h時，提取率達到最大，繼續(xù)延長時間，原花青素提取率又有所降低，這可能是因為隨著浸提時間的延長，原花青素氧化從而使提取率降低。由圖6可以看出，乙醇浸提時間影響不大，因此優(yōu)化浸提時間為1.5 h。

圖6 浸提時間對原花青素的提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the extraction efficiency of proanthocyanidins

2.2 響應面法試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果分析

因為浸提時間和酶質量分數(shù)對鎖陽原花青素提取率的影響不顯著，所以在進行響應面設計時，固定酶質量分數(shù)1%、浸提時間1.5 h；以影響提取效果較大的因素酶解時間（X1）、pH值（X2）、酶解溫度（X3）以及乙醇體積分數(shù)（X4）作為自變量，以鎖陽原花青素提取率為響應值（Y），共29個試驗點，其中24 個為析因點，5 個為中心點，中心點重復的目的是估計整個試驗的純試驗誤差。鎖陽原花青素提取的響應面試驗設計方案與結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experiment design and result for resp on se surface analysis

2.2.2 模型的建立與顯著性分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到鎖陽原花青素提取的二次多元回歸方程：

表3 回歸 模型 方差 分析Table 3 Analysis of variance of regressi on model

從表3可以看出，模型極顯著（P＜0.01），說明回歸方程可以很好地描述各因素與響應值之間的真實關系，失擬項P=0.068 4＞0.05不顯著，表明試驗結果與數(shù)學模型擬合程度良好，可用該模型來分析和預測鎖陽原花青素的提取工藝條件，相關系數(shù)R2=0.892 2，說明該模型擬合程度良好，預測值與實測值之間有較好的相關性［24］?；貧w方程中各變量對響應值影響的顯著性，由F檢驗法判定，概率P值越小，則相應變量的顯著性程度越高。

從表3回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，一次項酶解時間（X1）、酶解溫度（X3），二次項酶解時間（X）、pH值（X）、酶解溫度（X）和乙醇體積分數(shù)（X）對原花青素提取率影響極顯著（P＜0.01），一次項pH值（X2）、酶解時間和pH值的交互項（X1X2）對原花青素的提取率影響顯著（P＜0.05），其他項影響不顯著。因此，各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，簡單的分析方法難以解析，而響應面法能較好地描述它們之間的關系，并能較好地優(yōu)化鎖陽原花青素的提取工藝。

2.2.3 響應面交互作用分析

圖7 各因素間交互作用對鎖陽原花青素提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots showing the effect of interactions among different factors on the extraction yield of proanthocyanidins from Cynomorium songaricum Rupr.

根據(jù)回歸方程所繪制出各因素交互作用的響應面圖，其投影面為等高線圖，等高線的形狀可反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反，響應面的陡峭程度也可反映交互作用的強弱［25］。由圖7a可以看出，酶解時間和pH值的交互作用顯著，酶解時間軸向等高線密集且變化趨勢陡峭，pH值軸向等高線稀疏，變化平緩，表明酶解時間比pH值對鎖陽原花青素提取率的影響較大；而由圖7b～f可以看出，酶解時間與酶解溫度、pH值和酶解溫度、酶解時間與乙醇體積分數(shù)、pH值與乙醇體積分數(shù)、酶解溫度與乙醇體積分數(shù)的交互作用不顯著，但從曲面的變化趨勢來看酶解溫度、pH值對鎖陽原花青素的提取影響較大，乙醇體積分數(shù)的影響較小。

2.2.4 最優(yōu)工藝條件及驗證實驗

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗模型進行分析，以獲得鎖陽原花青素提取率的最優(yōu)提取工藝條件為酶解時間34.15 min、pH 4.75、酶解溫度52.47 ℃、乙醇體積分數(shù)69.58%，模型預測的鎖陽原花青素提取率極大值為14.25%?？紤]到實際操作的便利，將各因素的參數(shù)修正為酶解時間34 min、pH 4.8、酶解溫度52 ℃、乙醇體積分數(shù)70%，在此條件下進行5 次重復驗證實驗，鎖陽原花青素平均提取率為14.30%，與理論預測值接近。因此，采用響應面分析法優(yōu)化得到的工藝優(yōu)化條件可行，參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

2.2.5 酶法與乙醇提取法對鎖陽原花青素提取率的比較

酶法與乙醇提取法（料液比1∶10，在70 ℃條件下，用體積分數(shù)70%乙醇溶液回流提取2 h），鎖陽原花青素的提取率分別為14.30%和10.47%，相比較，酶法提取率明顯提高。

3 結 論

本研究利用響應面法優(yōu)化果膠酶提取鎖陽原花青素工藝參數(shù)，在果膠酶質量分數(shù)為1%時，鎖陽原花青素提取的最優(yōu)工藝條件為pH 4.8、酶解溫度52 ℃、酶解時間34 min、以體積分數(shù)為70%乙醇溶液提取1.5 h，鎖陽原花青素提取率達到14.30%，對比乙醇提取法（10.47%）增加了3.83%，且高于文獻［26］所報道的甘肅酒泉所產鎖陽的提取率（11.50%），說明酶法提取鎖陽原花青素可行；還說明同一省不同產地的鎖陽中同一有效成分含量有差異；采用不同的提取方法提取率有較大差異。

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［25］ 歐陽健， 金家宏， 王洪倫.響應面法優(yōu)化纖維素酶協(xié)同提取沙棘籽粕原花青素的工藝研究［J］.天然產物研究與開發(fā)， 2015（9）: 1589-1594.

［26］ 李振華， 郭靜霞， 崔占虎， 等.鎖陽的研究進展與資源保護［J］.中國現(xiàn)代中藥， 2014， 16（10）: 861-869.DOI:10.13313/ j.issn.1673-4890.2014.10.019.

Optimization of Pectinase-Assisted Extraction of Proanthocyanidin from Cynomorium songaricum Rupr.Using Response Surface Methodology

CUI Wei1， ZHANG Yong1，2， GAO Haining1，2， JIAO Yang1， LI Caixia1，2，*
（1.College of Agriculture and Biotechnology， Hexi University， Zhangye 734000， China；2.Key Laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Universities， Zhangye 734000， China）

Purpose: To optimize the pectinase-assisted extraction of proanthocyanidins （PC） from the stems of Cynomorium songaricum Rupr..Methods: Pectinase was introduced into the process for improving the extraction efficiency.The extraction conditions were optimized by using response surface methodology （RSM）.Five key factors including enzyme dosage， hydrolysis duration， pH value， temperature and ethanol concentration were selected by one-factor-at-a-time experiments.The extraction yield of PC was used as the response.Results: A quadric regression equation for predicting the extraction yield of PC was established using Box-Behnken design and the extraction conditions were optimized as follows: hydrolysis for 34 min with 1% pectinase at 52 ℃ and initial pH 4.8 followed by extraction for 1.5 h with 70% ethanol as the extraction solvent.Under these optimized conditions， the extraction yield of PC reached 14.30%.Conclusion: The optimized pectinase-assisted extraction method can enhance the extraction efficiency of PC from Cynomorium songaricum Rupr..

Cynomorium songaricum Rupr.； pectinase； proanthocyanidins； response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201614004

TQ461

A

1002-6630（2016）14-0018-06

崔瑋， 張勇， 高海寧， 等.響應面試驗優(yōu)化果膠酶輔助提取鎖陽原花青素工藝［J］.食品科學， 2016， 37（14）: 18-23.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614004. http://www.spkx.net.cn

CUI Wei， ZHANG Yong， GAO Haining， et al.Optimization of pectinase-assisted extraction of proanthocyanidin from Cynomorium songaricum Rupr.using response surface methodology［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 18-23.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614004. http://www.spkx.net.cn

2015-12-14

國家中醫(yī)藥管理局2012年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項（201207002）

崔瑋（1969—），男，副教授，碩士，研究方向為動物生理和藥理。E-mail：zhangyecw@163.com

*通信作者：李彩霞（1967—），女，高級實驗師，學士，研究方向為天然產物開發(fā)與利用。E-mail：pengli131@163.com