組蛋白去甲基化酶JMJD2在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥表達(dá)分析

唐宏宇 郭承 董路玨 周馳 霍少川 陳建發(fā) 劉勇 王海彬

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科中心，廣州 510405 廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)骨科實(shí)驗(yàn)室，廣州 510405

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一，是絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降等原因?qū)е碌囊环N全身代謝性疾病，患者主要是圍絕經(jīng)期到70歲的婦女[1]，其給中老年婦女帶來的肉體和精神上的痛苦，以及家庭和社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)隨著人口老齡化日趨嚴(yán)重。近幾十年來從遺傳因素，生活方式和營(yíng)養(yǎng)狀況，激素水平以及細(xì)胞分子水平對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究[2]，但確切機(jī)制仍未統(tǒng)一。

組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，組蛋白甲基化是組蛋白修飾的一種方式，主要發(fā)生在組蛋白H3或H4的賴氨酸(lysine, K)和精氨酸(arginine, R)殘基上，又以H3的賴氨酸甲基化最常見。組蛋白修飾與基因的失活、X染色體失活、基因印記等基因沉默現(xiàn)象以及DNA修復(fù)有關(guān)[3]。由于存在去甲基化酶，甲基化修飾也是一種可逆的過程。隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)認(rèn)識(shí)的不斷深入，近年來表觀遺傳學(xué)在腫瘤性疾病、心血管疾病以及免疫性疾病的預(yù)防、診斷和治療中得到了廣泛研究。關(guān)于表觀遺傳如何實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松的調(diào)控，目前國(guó)內(nèi)外研究不多，但已有從成骨分化著手的相關(guān)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本研究期望通過比較絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者與非骨質(zhì)疏松骨骼標(biāo)本，探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者組蛋白去甲基化酶JMJD家族(JMJD2A、JMJD2B)、組蛋白甲基化(H3K9me3、H3K36me3)表達(dá)水平的差異，以期從表觀遺傳機(jī)制找到骨質(zhì)疏松癥新的調(diào)控靶點(diǎn)，為下一步從表觀遺傳機(jī)制干預(yù)骨質(zhì)疏松提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014年10月至2014年12月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科因髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎住院行髖關(guān)節(jié)置換的絕經(jīng)后女性病人，年齡為50-70歲。清晨空腹采取靜脈血行血常規(guī)、生化、肝腎功能等檢查，檢測(cè)血清25-(OH)VitD水平，雙能X線骨密度儀檢測(cè)正位腰椎(L2-4)骨密度。根據(jù)受試者骨密度測(cè)量結(jié)果及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，分為骨質(zhì)疏松組(實(shí)驗(yàn)組)和正常組(對(duì)照組)。所有入組人員均簽署知情同意書，本研究所取標(biāo)本為手術(shù)截下之股骨頭，不牽涉?zhèn)惱韱栴}。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡50～70歲②女性自然絕經(jīng)(停經(jīng)1年以上)③符合原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)及中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)[4,5]④BMD≤-2.0 SD。

對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡50～70歲②女性自然絕經(jīng)(停經(jīng)1年以上)③不符合骨質(zhì)疏松癥的診斷。

1.1.2共同排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡小于50歲或大于70歲②患精神病或老年癡呆者③合并心腦血管等系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾病者④肝腎功能不全患者者⑤有導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥相關(guān)疾病病史，如甲狀旁腺功能亢進(jìn)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等⑥糖皮質(zhì)類激素應(yīng)用史⑦患者半年內(nèi)服用可能影響骨代謝的藥物者。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑 H3K9me3、H3K36me3一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，JMJD2A、JMJD2B一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，免疫組化聚合物檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒(包括通用二抗、H2O2工作液、蛋白阻斷劑、DAB顯色劑、DAB顯色增強(qiáng)劑、蘇木素染色劑)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，Simple Western 試劑套裝(內(nèi)含分離膠母液、濃縮膠母、抗體稀釋液、抗兔和抗鼠的二抗過氧化物酶結(jié)合試劑、1M DTT、熒光標(biāo)準(zhǔn)品和生物素標(biāo)記的Ladder、Matrix Removal buffer、Wash buffer、Running Buffer)購(gòu)自ProteinSimple公司，RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2.2主要儀器：雙能X射線骨密度儀(法國(guó)MEDILINK公司)，自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，Simon全自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.3 骨密度測(cè)定方法

依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 2004年發(fā)布的骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)制定的《中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)(第三稿·2014版)》[5]，采用法國(guó)MEDILINK公司雙能X射線骨密度儀檢測(cè)患者腰椎(L2-L4)正位骨密度，骨密度≤-2.0 SD為骨質(zhì)疏松，骨密度>-1.0s為正常。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.4.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)松質(zhì)骨標(biāo)本JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達(dá)。

標(biāo)本收集及處理：髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中，無菌骨刀鑿取股骨頭內(nèi)松質(zhì)骨顆粒，大小約1×1×0.5 cm，立即放入10%甲醛溶液，常溫下固定24 h。再置于PLANK脫鈣液脫鈣2-3 d，期間換脫鈣液1次，隔段時(shí)間用注射器針頭針刺骨標(biāo)本以檢查脫鈣效果，至針頭能輕松扎入骨組織而沒有明顯阻力即脫鈣完成。脫鈣完成后自來水流水沖洗12 h。系列酒精脫水、TO透明劑透明、浸蠟，石蠟包埋。Leica病理切片機(jī)切成厚度4 μm的蠟片，將蠟片展于標(biāo)記的防脫載玻片上，60℃烤箱烤片2 h使標(biāo)本貼片牢固。

實(shí)驗(yàn)步驟：經(jīng)脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

結(jié)果判定：通過顯微鏡觀察顯示JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3均定位于細(xì)胞核，顯微鏡下每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)200倍視野，觀察核染色程度(0、1、2、3分分別為陰性著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色)和陽性范圍評(píng)分(1、2、3、4分分別為0-10%、11-50%、51-80%、>80%)，兩分?jǐn)?shù)相乘:0分為陰性，1-4分為弱陽性，>4分為強(qiáng)陽性，本實(shí)驗(yàn)采取分值高低比較陽性率水平。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基本情況差異比較直方圖與對(duì)照組比較,**P<0.05.Fig.1 Comparison of basic information between the 2 groups (n=10,

1.4.2免疫印跡法檢測(cè)松質(zhì)骨標(biāo)本JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達(dá)。

標(biāo)本收集及處理：上髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中，無菌骨刀鑿取股骨頭內(nèi)松質(zhì)骨顆粒，立即裝入1.5 ml無菌凍存管，放入液氮中，轉(zhuǎn)運(yùn)至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用碧云天全蛋白提取試劑盒提取骨組織總蛋白樣品，BCA法測(cè)定蛋白濃度，分裝置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)步驟：蛋白檢測(cè)使用美國(guó)Simon全自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)分析系統(tǒng)，按照Simple Western試劑套裝操作指南，將一抗及內(nèi)標(biāo)β-Action按照1∶50稀釋，蛋白樣品濃度按照1.5 mg/ml稀釋，小心將各樣品依次加入微孔板，避免產(chǎn)生氣泡，上樣完成后，按照軟件操作指南上機(jī)點(diǎn)擊運(yùn)行，機(jī)器自動(dòng)完成樣品跑膠、抗體孵育及染色成像。約5 h后，機(jī)器運(yùn)行結(jié)束，生成結(jié)果。結(jié)果判定根據(jù)Graph view下面的Peaks表格中目的蛋白“峰面積”數(shù)值來計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

10例骨質(zhì)疏松癥患者(實(shí)驗(yàn)組)和10例非骨質(zhì)疏松癥患者 (對(duì)照組)比較,平均年齡、身高、體重、BMI之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組BMD、外周血血清25-(OH)VitD低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；举Y料見表1，直方圖見圖1。

組別Group實(shí)驗(yàn)組Experimental group對(duì)照組Control groupt值t-valueP值P-value例數(shù)Case(number)1010--年齡(歲)Age(year)59.40±5.8360.70±4.73-0.5470.591身高(cm)High(cm)157.4±5.68155.0±4.131.080.294體重(kg)Weight(kg)59.80±1.5457.80±5.201.1650.259體重指數(shù)(kg/m2)BMI(kg/m2)24.19±1.3823.76±2.550.3020.76625-羥基維生素D25-(OH)VitD(ng/mL)18.51±4.2325.56±3.21-5.150.000骨密度(g/cm2)BMD(g/cm2)-3.6±0.63-0.62±1.35-6.0310.000

注：經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組患者年齡、身高、體重、BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.005)， BMD、25-(OH)VitD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)。
Through Student’s test，there was no significant difference between the two group，when comparing their age,hight,weight,BMI(P>0.005), When cames to BMD, 25-(OH)VitD,there was significant difference(P<0.005).

2.2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達(dá)水平差異。

兩組JMJD2A表達(dá)均為弱陽性(低表達(dá))，組間差別具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組JMJD2B表達(dá)水平低于對(duì)照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組H3K9me3、H3K36me3表達(dá)水平高于對(duì)照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)(免疫組化結(jié)果見圖2、統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2、圖3；WB結(jié)果見圖4，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3、圖5)。

圖2 免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達(dá)，表達(dá)部位均位于細(xì)胞核，陽性表達(dá)為核黃染。(400×視野)Fig.2 Comparison of expression of immunohistochemical staining of JMJD2A, JMJD2B, H3K9me3, and H3K36me3 between the 2 groups.The nucleus positive expression was in yellow.(400×).

指標(biāo)Index實(shí)驗(yàn)組Experimental group對(duì)照組Control groupt值t-valueP值P-valueJMJD2A2.00±1.153.5±0.67-3.5460.002JMJD2B3.2±0.566.06±0.58-11.2820.000H3K9me38.76±0.665.59±1.277.010.000H3K36me37.64±0.834.82±0.877.4030.000

注：經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組患者JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)
Through Student’s test，there was significant difference between the two group，when comparing their JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3(P<0.005)

圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組免疫組化結(jié)果差異比較直方圖與對(duì)照組比較,**P<0.05.Fig.3 Comparison of immunohistochemical staining between the 2 groups (n=10,

圖4 WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組JMJD2A、JMJD2B(上)和H3K9me3、H3K36me3(下)表達(dá)Fig.4 Comparison of the expression of JMJD2A and JMJD2B WB (upper) and H3K9me3 and H3K36me3 (below) between the 2 groups (n=10,

指標(biāo)Index實(shí)驗(yàn)組Experimental group對(duì)照組Control groupt值t-valueP值P-valueJMJD2A286.5±41.98363.8±29.52-4.7630.000JMJD2B365.5±32.99643.8±140.43-6.1010.000H3K9me31150.6±205.90634.7±194.545.7590.000H3K36me31037.6±158.57595.1±175.645.9140.000

注：經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組患者JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)
Through Student’s test，there was significant difference between the two group，when comparing their JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3(P<0.005)

圖5 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組WB結(jié)果差異比較直方圖與對(duì)照組比較,**P<0.05Fig.5 Comparison of WB results between the 2 groups

3 討論

絕經(jīng)后婦女伴隨卵巢功能衰退、雌激素缺乏，骨質(zhì)疏松癥多發(fā)，在目前全球約2億的骨質(zhì)疏松癥患者中，每年約有150萬發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折，在絕經(jīng)后婦女，與骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)的死亡率已超過乳腺癌、宮體癌和宮頸癌總和[6]。骨質(zhì)疏松癥在威脅患者生命的同時(shí)，給家庭、整個(gè)社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著人均壽命的延長(zhǎng)和人口結(jié)構(gòu)的改變，預(yù)計(jì)到2050年，因質(zhì)疏松癥誘發(fā)的骨折將增加1倍，與之相伴的是醫(yī)療費(fèi)用的驚人的增長(zhǎng)速度[7]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指在沒有發(fā)生基因DNA序列改變的情況下，基因功能發(fā)生的遺傳信息變化，并最終導(dǎo)致可遺傳的表型變化。其主要內(nèi)容包括DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾以及非編碼RNA調(diào)控。表觀遺傳學(xué)以其獨(dú)特的研究視角，把遺傳特性和環(huán)境因素結(jié)合起來，認(rèn)為復(fù)雜的基因組生物學(xué)系統(tǒng)不僅具有強(qiáng)大的穩(wěn)定性，并且具有精確的反應(yīng)性和強(qiáng)大的適應(yīng)性。組蛋白甲基化是一種組蛋白修飾方式，主要發(fā)生在組蛋白H3或H4的賴氨酸(lysine, K)和精氨酸(arginine, R)殘基上，又以H3的賴氨酸甲基化最常見，如4位(H3K4)、9位(H3K9)、27位(H3K27)、36位(H3K36)、79位(H3K79)等，且這些位置的賴氨酸殘基不僅存在有單甲基化修飾，甚至還有二甲基化和三甲基化修飾[8]。之前認(rèn)為甲基化是一種穩(wěn)定的修飾，近年來由于去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)，說明甲基化修飾也是一種可逆的過程。

目前已發(fā)現(xiàn)兩類組蛋白去甲基化酶：賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine specific demeth- ylase, LSD)和含Jumonji家族結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶(Jumonji domain- containning histone demethylase,JMJD)。它們都可催化組蛋白單或雙甲基化賴氨酸去甲基化，而后者還可催化三甲基化賴氨酸去甲基化[9]。JMJD家族目前已鑒定多個(gè)成員，JMJD2A和JMJD2B是其成員之一。研究表明，JMJD2能夠同時(shí)移去H3K9me3和H3K36me3上的甲基[10]。

隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)認(rèn)識(shí)的深入，近年來表觀遺傳學(xué)在腫瘤性疾病、心血管疾病以及免疫性疾病的預(yù)防、診斷和治療中得到了廣泛研究。關(guān)于表觀遺傳如何實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松的調(diào)控，目前國(guó)內(nèi)外研究不多，但已有從成骨分化著手的相關(guān)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本研究以人松質(zhì)骨標(biāo)本為研究對(duì)象，期望以組蛋白去甲基化酶JMJD2家族為切入點(diǎn)，找到甲基化與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，兩組患者JMJD2A表達(dá)均為弱陽性，而JMJD2B表達(dá)陽性到強(qiáng)陽性不等，骨質(zhì)疏松組JMJD2A、JMJD2B均低于非骨質(zhì)疏松組；與之相應(yīng)的H3K9me3、 H3K36me3表達(dá)陽性程度不等，骨質(zhì)疏松組H3K9me3、H3K36me3均高于非骨質(zhì)疏松組。關(guān)于組蛋白去甲基化酶及組蛋白甲基化與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)系，本研究初步認(rèn)為，JMJD2A、JMJD2B可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)測(cè)指標(biāo)，其表達(dá)水平和H3K9me3、H3K36me3相反相成，JMJD2A、JMJD2B越低，患者骨密度越低，患骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)越高。其機(jī)制可能是JMJD2A、JMJD2B降低導(dǎo)致部分抗骨質(zhì)疏松的相關(guān)基因失活，因第9位賴氨酸的甲基化與基因的失活有關(guān)[11]，而JMJD2A、JMJD2B催化組蛋白H3三甲基化的第9位點(diǎn)賴氨酸去甲基化；同時(shí)JMJD2A降低導(dǎo)致了部分促骨質(zhì)疏松的相關(guān)基因激活，因第36位賴氨酸的甲基化與基因的激活相關(guān)[11]，而JMJD2A催化組蛋白H3三甲基化的第36位點(diǎn)賴氨酸去甲基化。關(guān)于JMJD2A、JMJD2B對(duì)H3K9me3、H3K36me3的脫甲基作用及其脫甲基催化強(qiáng)度，本課題未能從分子機(jī)制深入探討。

總之，本研究證實(shí)了絕經(jīng)后女性組蛋白去甲基化酶JMJD2與骨密度的正相關(guān)性，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者JMJD2水平降低，為從表觀遺傳學(xué)角度診治骨質(zhì)疏松提供新的思路。然本研究存在一定局限，沒能從分子層面深入探討其具體作用方式，下一步需要在此基礎(chǔ)之上開展更深層次、多方位的研究。