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    甲強(qiáng)龍聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)兔股骨頭壞死模型的建立

    2016-08-06 12:21:34董維郭楊馬勇趙丹王培民
    中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志 2016年4期
    關(guān)鍵詞:小梁骨細(xì)胞股骨頭

    董維 郭楊* 馬勇, 趙丹 王培民

    1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所,骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科,南京 210029

    近年來(lái),隨著激素在臨床中的廣泛應(yīng)用,使得激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)病率逐年上升。盡管有各種各樣的理論,包括血液脂代謝紊亂學(xué)說(shuō)、激素直接感應(yīng)學(xué)說(shuō)、高粘滯狀態(tài)學(xué)說(shuō)、血管內(nèi)凝血學(xué)說(shuō),然而其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。由于早期診斷率較低且缺乏有效的治療方法,許多患者最終不得不進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換[2],故早期診斷和治療非常關(guān)鍵。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在建立一個(gè)能夠模擬人類(lèi)早期激素性股骨頭壞死的動(dòng)物模型,為進(jìn)一步研究該病的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供幫助。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    30只雄性新西蘭大白兔,體重2.5~4.0 kg,由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動(dòng)物在南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng),每日給予定量兔飼料和清潔飲用水。

    1.2 材料

    大腸桿菌內(nèi)毒素(Sigma公司,美國(guó));注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(甲強(qiáng)龍)(輝瑞制藥公司,美國(guó));MRI(西門(mén)子Magnetom Trio Tim 3.0T,德國(guó));光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司,日本)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,30只新西蘭大白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(20只)和對(duì)照組(10只)。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)耳緣靜脈注射10 μg/kg的脂多糖,24小時(shí)后右側(cè)臀部肌注甲強(qiáng)龍20 mg/kg,連續(xù)注射3天,每次間隔24小時(shí)。對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水,不注射脂多糖和甲強(qiáng)龍。所有動(dòng)物均肌注青霉素預(yù)防感染。

    1.4 觀察指標(biāo)

    6周后處死動(dòng)物,解剖右側(cè)股骨攝X 線(xiàn)片、MRI觀察股骨頭形態(tài)、骨質(zhì)密度、骨小梁變化、壞死信號(hào)等影像學(xué)變化情況。然后將上述股骨頭標(biāo)本以4%多聚甲醛固定2天,甲酸10 ml加入10%福爾馬林90 ml制成甲酸脫鈣液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫鈣,5天后石蠟包埋標(biāo)本股骨頭,切片后常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察股骨頭、骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔及脂肪細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化。

    2 結(jié)果

    兩組皆未出現(xiàn)白兔死亡,對(duì)照組無(wú)白兔出現(xiàn)股骨頭壞死,實(shí)驗(yàn)組白兔共計(jì)15只出現(xiàn)股骨頭壞死,發(fā)生率為75%。

    2.1 影像學(xué)觀察

    2.1.1X 線(xiàn):對(duì)照組雙側(cè)股骨頭骨皮質(zhì)完整,大小及形態(tài)正常,骨密度均勻,骨小梁清晰(圖1);模型組股骨頭骨質(zhì)疏松,頭內(nèi)密度不均,可見(jiàn)大小不一的囊狀透亮區(qū),部分骨小梁模糊不清,但股骨頭保持完整(圖2)。

    2.1.2MRI:T2-tse-tra序列:股骨頭見(jiàn)一類(lèi)圓形高信號(hào)影,邊界相對(duì)清晰;T2-tse-cor序列:股骨頭見(jiàn)一類(lèi)圓形稍高信號(hào)影,關(guān)節(jié)面清晰完整(圖3、4)。

    2.2 病理學(xué)觀察

    對(duì)照組股骨頭軟骨層較厚,骨小梁致密,排列規(guī)則,陷窩內(nèi)有數(shù)量很多的骨細(xì)胞;髓腔增生活躍,造血細(xì)胞豐富,脂肪細(xì)胞體積及數(shù)量正常。實(shí)驗(yàn)組股骨頭軟骨層較薄,骨小梁纖細(xì),部分骨小梁斷裂,陷窩內(nèi)骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,空骨陷窩數(shù)量明顯增多;髓腔增生減低,骨髓出現(xiàn)了明顯的壞死、溶解現(xiàn)象,造血細(xì)胞明顯減少,充滿(mǎn)大量肥大的脂肪細(xì)胞,有的融合成泡狀(圖5、6)。

    圖1 對(duì)照組雙側(cè)股骨頭骨皮質(zhì)完整,大小及形態(tài)正常,骨密度均勻,骨小梁清晰Fig.1 The X-ray of the femoral head in control group shows that the cortical bone is complete, the size and shape are normal, the density is even, and the trabecular bone is clear in the bilateral femoral heads.

    圖2 實(shí)驗(yàn)組X線(xiàn)示股骨頭密度減低,骨小梁模糊不清,可見(jiàn)一囊狀透亮區(qū),股骨頭保持完整Fig.2 The X-ray of the femoral head in model group shows that the reduced bone mineral density, blurred trabecular bone with cystic zone, and intact femoral head.

    圖3 實(shí)驗(yàn)組MRIT2-tse-tra序列:股骨頭見(jiàn)一類(lèi)圓形高信號(hào)影,邊界相對(duì)清晰Fig.3 MRI T2-tse-tra sequence of the model group shows a circular high signal in the femoral head with a relatively clear boundary.

    圖4 實(shí)驗(yàn)組MRI T2-tse-cor序列:股骨股骨頭見(jiàn)一類(lèi)圓形稍高信號(hào)影,關(guān)節(jié)面清晰完整Fig.4 MRI T2-tse-cor sequence of the model group shows a round slightly high signal in the femoral head and clear and complete joint surface.

    圖5 對(duì)照組HE示軟骨細(xì)胞排列整齊,骨小梁完整,排列規(guī)則,骨小梁中的骨細(xì)胞清晰可見(jiàn),空骨陷窩少見(jiàn),骨髓中造血細(xì)胞豐富,脂肪細(xì)胞大小一致,形態(tài)正常Fig.5 In control group HE staining shows that the cartilage cells arranges neatly, trabecular bone is intact and regularly arranged, trabecular bone cells are visible, empty bone lacunae are rare, hematopoietic cells in bone marrow are rich, and the size and morphology of adipocytes are normal.

    圖6 實(shí)驗(yàn)組HE示骨小梁纖細(xì),部分骨小梁斷裂,髓腔內(nèi)造血細(xì)胞減少,脂肪細(xì)胞體積增大,有的融合成泡狀 Fig.6 In the model group HE staining shows that the trabecular bone is thin and broken in some part, the hematopoietic cells in the medullary cavity are reduced, and the volume of adipocytes increases and some fuse into a bubble.

    3 討論

    激素性股骨頭壞死多發(fā)生于20~50歲之間[3],其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,早期診斷較困難,晚期往往造成嚴(yán)重的后果。在股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制的研究過(guò)程中,建立與股骨頭壞死病程相似的動(dòng)物模型非常重要,現(xiàn)行建立模型的方法主要有血清加激素模型[3]、單純激素模型[4]、無(wú)水乙醇模型骨內(nèi)注射模型[5]以及液氮冷凍模型[6]等,給藥途徑與給藥劑量都不盡相同。

    有國(guó)外學(xué)者單純應(yīng)用激素誘導(dǎo)股骨頭壞死模型,結(jié)果很難產(chǎn)生典型的股骨頭壞死變化[7]。血清加激素模型因所用血清多為異種血清,容易致使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物休克死亡。股骨頭鉆孔注入無(wú)水乙醇以及液氮的造模方法需要在透視機(jī)下進(jìn)行穿刺,定位要求較高,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員傷害較大且對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)要求較高。

    仔細(xì)研究不難發(fā)現(xiàn)這些疾病具有共同特點(diǎn)是:均可造成機(jī)體血管內(nèi)皮的損傷從而使機(jī)體處于高凝狀態(tài)[8]。由此可見(jiàn)在造模過(guò)程應(yīng)用激素之前,適當(dāng)加用一些藥物使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于高凝狀態(tài)后再應(yīng)用激素,這樣建立的股骨頭壞死動(dòng)物模型就更接近臨床,更有利于臨床治療及預(yù)防的研究。

    內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的組成成分之一,它可以引發(fā)一系列病理變化如:局部炎性反應(yīng)、脂代謝異常以及機(jī)體凝血-纖溶系統(tǒng)的功能紊亂而造成機(jī)體高凝狀態(tài)等[9-11],這些病理變化與臨床上使用激素治療的基礎(chǔ)病的病理過(guò)程相近。所以?xún)?nèi)毒素加激素來(lái)誘導(dǎo)股骨頭壞死更加接近人類(lèi)激素性股骨頭壞死的特點(diǎn)。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組X線(xiàn)片示股骨頭密度減低,骨小梁模糊不清,可見(jiàn)一囊狀透亮區(qū),但股骨頭保持完整無(wú)塌陷,按Ficat分期屬于早期壞死模型(Ⅰ~Ⅱ期);MRI對(duì)股骨頭壞死早期診斷有較高的敏感性,能早期準(zhǔn)確描述骨壞死的形態(tài)、部位及炎性反應(yīng)過(guò)程,本實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒MMRI示在T2-tse-tra序列股骨頭可見(jiàn)一類(lèi)圓形高信號(hào)影,邊界相對(duì)清晰,T2-tse-cor序列股骨頭可見(jiàn)一類(lèi)圓形稍高信號(hào)影,關(guān)節(jié)面清晰完整,與同期組織學(xué)檢查結(jié)果相一致,從而印證其在股骨頭壞死早期診斷的高度靈敏和特異性。組織學(xué)切片觀察則是一種最常規(guī)觀察病理改變的檢測(cè)手段之一,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組骨陷窩中骨細(xì)胞明顯減少,而伴有不同程度的脂肪細(xì)胞肥大、增生,可能與激素促使骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。股骨頭髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞肥大、增生,使得正常的紅骨髓受壓并逐漸被脂肪取代,加上股骨頭髓腔為一半封閉的腔隙,肥大增生的脂肪細(xì)胞引起骨髓腔內(nèi)壓力增高,骨內(nèi)壓升高使髓內(nèi)血管受壓變細(xì),靜脈瘀滯, 微循環(huán)障礙造成缺氧又促使髓內(nèi)組織滲出,腫脹,進(jìn)一步加重髓內(nèi)高壓而形成惡性循環(huán)[4]。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組骨髓腔內(nèi)大量的脂肪細(xì)胞填塞,部分融合為泡狀,其可能是股骨頭早期壞死的直接原因。

    綜上所述,甲強(qiáng)龍聯(lián)合脂多糖能夠誘導(dǎo)兔早期股骨頭缺血性壞死模型,且方法簡(jiǎn)單、快速,成功率高,更加接近人早期股骨頭缺血壞死,值得在股骨頭壞死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中推廣應(yīng)用。

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