鈣黏蛋白-13表達下調(diào)對膀胱癌細胞上皮間質(zhì)轉化的影響

林英立，李艷麗，戚景光，馬建國，李文平，孫　光

(徐州市腫瘤醫(yī)院：1.泌尿外科；2.科教科，江蘇徐州　221005；3.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院泌尿外科，河北石家莊 050051；4.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科，天津　300211)

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·基礎研究·

鈣黏蛋白-13表達下調(diào)對膀胱癌細胞上皮間質(zhì)轉化的影響

林英立1，李艷麗2，戚景光1，馬建國3，李文平3，孫光4

(徐州市腫瘤醫(yī)院：1.泌尿外科；2.科教科，江蘇徐州221005；3.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院泌尿外科，河北石家莊 050051；4.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科，天津300211)

摘要：目的研究CDH13表達下調(diào)對膀胱癌5637細胞上皮間質(zhì)轉化的影響。方法應用RNA干擾技術抑制膀胱癌5637細胞中CDH13的表達后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，Western blot檢測CDH13及上皮間質(zhì)轉化標志物E-鈣黏蛋白、 N-鈣黏蛋白和α-平滑肌動蛋白的表達。結果膀胱癌5637細胞中CDH13表達下調(diào)后細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞轉變，呈現(xiàn)長梭形， 細胞間緊密連接松散，大多數(shù)細胞出現(xiàn)細長的絲狀偽足；上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白表達減少(P<0.05)，間質(zhì)細胞標志物N-鈣黏蛋白和α-平滑肌動蛋白表達增加(P<0.05)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。結論膀胱癌細胞中CDH13表達下調(diào)促進腫瘤細胞向間質(zhì)細胞轉化。

關鍵詞：膀胱癌；CDH13；上皮間質(zhì)轉化

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，并且隨著暴露于危險因素的增加和人口的老齡化，其發(fā)病率呈上升趨勢[1-4]。膀胱癌生物學特征具有多樣性，即使分期、分級完全相同的腫瘤其結果也不完全相同，容易復發(fā)和進展是膀胱癌的重要特征[1-4]。鈣黏蛋白-13 (cadherin-13，CDH13)是鈣黏蛋白家族的一員。有研究表明CDH13是一個抑癌基因，它在細胞粘附、信號傳導及細胞生長調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用[5]。我們先前的研究表明CDH13在膀胱癌中表達減少，并與腫瘤的浸潤、轉移及不良預后密切相關；在體外實驗中應用RNA干擾技術抑制膀胱癌細胞中CDH13的表達后細胞增殖加快，遷移和侵襲能力增強[6-9]。近年來研究表明，上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的浸潤、轉移過程中發(fā)揮著重要作用[10-11]。本研究將在體外實驗中應用RNA干擾技術抑制CDH13在膀胱癌5637細胞中的表達，觀察CDH13表達下調(diào)后對膀胱癌細胞EMT的影響。

1材料與方法

1.1材料人膀胱癌5637細胞株購自中國科學院細胞庫， RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibeo公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程公司，兔抗人CDH13多克隆抗體、兔抗人E-cadherin (E-鈣黏蛋白)多克隆抗體、兔抗人N-cadherin (N-鈣黏蛋白) 多克隆抗體、兔抗人α-smooth muscle actin (α-平滑肌動蛋白，α-SMA) 多克隆抗體、CDH13 shRNA Plasmid、Control shRNA Plasmid、HRP標記的羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司， Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2細胞培養(yǎng)及轉染5637細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅火胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。本研究分為3組：A組為正常對照組(1×PBS)，B組為陰性對照組(Control shRNA Plasmid)，C組為實驗組(CDH13 shRNA Plasmid)。取對數(shù)生長期的5637細胞用胰酶消化并計數(shù)，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×105/mL，取500 μL接種于6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%時進行轉染，操作按照Lipofectamine 2000說明書進行，轉染后細胞板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染細胞傳代培養(yǎng)，應用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達 shRNA 的細胞，Western blot檢測CDH13基因的蛋白沉默效果[8- 9]。

1.3Western blot檢測蛋白表達收集各組細胞，提取細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，用ECL發(fā)光劑檢測；各組以β-Actin內(nèi)參，將每個樣本的灰度值與內(nèi)參灰度值比較，得出的比值代表蛋白的含量。

1.4相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化各組分別取對數(shù)生長期細胞，消化細胞后制成1×105/mL濃度的細胞懸液，接種至六孔板培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

2結果

2.1RNA干擾抑制膀胱癌5637細胞CDH13蛋白的表達shRNA轉染后實驗組CDH13蛋白表達水平明顯低于正常對照組和陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 圖1)。

圖1 Western blot法檢測3組CDH13的表達及其柱狀圖

A：正常對照組；B：陰性對照組；C:實驗組。*與內(nèi)參灰度值比，P<0.05。

2.2相差顯微鏡觀察CDH13表達下調(diào)后細胞形態(tài)改變正常對照組和陰性對照組細胞呈現(xiàn)明顯的上皮樣形態(tài)，細胞間連接緊密，未見明顯間隙，幾乎看不到偽足。實驗組細胞呈現(xiàn)間充質(zhì)樣的長梭形， 細胞間緊密連接松散，大多數(shù)細胞出現(xiàn)細長的絲狀偽足(圖2)。

圖2　膀胱癌5637細胞形態(tài)改變(HE, ×200)

2.3EMT相關標志物表達的改變實驗組上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白表達明顯減少，間質(zhì)細胞標志物N-鈣黏蛋白和α-平滑肌動蛋白表達明顯增加，與正常對照和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖33組EMT相關標志物的表達比較及其柱狀圖

A：正常對照組；B：陰性對照組；C：實驗組。*與內(nèi)參灰度值比，P<0.05。

3討論

CDH13基因定位在人染色體16q24，在多種腫瘤中人染色體16q24經(jīng)常發(fā)生突變、缺失以及啟動子甲基化等，進而影響基因所編碼蛋白的表達。研究表明CDH13在多種腫瘤中表達減少或缺失，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著非常密切的關系。CDH13是鈣黏蛋白家族的一個特殊成員，它不僅是一個粘附分子，同時也是多種生物因子的受體，可調(diào)節(jié)細胞的多種生物學功能；在多種腫瘤中，CDH13表達減少與腫瘤的惡性生物學行為有關[5]。大量研究表明，CDH13表達減少與其參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有關，在多種腫瘤中重新恢復CDH13表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移，同時CDH13也可能參與腫瘤新生血管的形成以及細胞內(nèi)和細胞間的信號傳導過程，進而影響細胞的生物學行為[12]。

近年來，人們從結構和功能方面對CDH13做了大量的研究，研究發(fā)現(xiàn)CDH13參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)許多生物加工過程，包括鈣介導的細胞粘附、細胞極性和形態(tài)形成、細胞的聚集和遷移、細胞的識別和信號傳導機制以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等[5, 12]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中CDH13因其基因啟動子甲基化而表達減少，并與腫瘤的惡性生物學行為密切相關；在體外實驗中應用去甲基化試劑重新恢復CDH13表達后可抑制細胞遷移和侵襲能力[6-9]。侵襲是腫瘤細胞的特性，研究發(fā)現(xiàn)CDH13表達減少將增加腫瘤細胞的侵襲能力，然而CDH13表達減少是通過何種機制促進腫瘤發(fā)展的，目前尚不完全清楚。研究表明，EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，與多種上皮細胞來源腫瘤的侵襲及轉移密切相關。本研究在體外實驗中應用RNA干擾技術抑制CDH13表達后，探索CDH13表達下調(diào)后對膀胱癌細胞EMT的影響。

EMT是指上皮細胞從形態(tài)和功能上轉變?yōu)殚g充質(zhì)細胞，細胞由立方形轉變?yōu)殚L梭形，細胞上皮標志物表達減少，而間充質(zhì)標志物表達增加，細胞獲得更強的遷移、侵襲和增殖能力[13-14]。EMT 以上皮細胞極性的喪失及其間質(zhì)特性的獲得為主要特征，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、組織重建及腫瘤轉移等過程中發(fā)揮著重要作用。E-鈣黏蛋白幾乎存在于所有上皮細胞的表面，是上皮組織分泌的典型鈣黏蛋白，是細胞-細胞粘附分子的主要類型，在EMT研究中作為主要的上皮性標志物[15]。N-鈣黏蛋白是由間質(zhì)細胞分泌的典型鈣黏蛋白，其在上皮組織中的異位表達可以影響上皮細胞的形態(tài)和行為，誘導其向間質(zhì)細胞轉化，是目前在EMT研究中主要的間質(zhì)性標志物[16]。α-平滑肌動蛋白主要表達于平滑肌細胞和肌性上皮細胞中，在多種腫瘤中與EMT密切相關，也是一種主要的間質(zhì)細胞標志物[17]。在本研究中，我們應用RNA干擾抑制CDH13在膀胱癌5637細胞中表達后，細胞由上皮樣形態(tài)轉變?yōu)殚g充質(zhì)細胞的長梭形，細胞間連接松散，大多數(shù)細胞出現(xiàn)細長的絲狀偽足；同時，細胞中E-鈣黏蛋白表達減少，N-鈣黏蛋白和α-平滑肌動蛋白表達增加。研究結果表明CDH13表達下調(diào)后膀胱癌細胞向間質(zhì)細胞轉化。

綜述所述，膀胱癌細胞中CDH13表達下調(diào)后，膀胱癌5637細胞向間質(zhì)細胞形態(tài)轉變，上皮細胞性標志物表達減少，間質(zhì)細胞性標志物表達增加，這表明CDH13表達下調(diào)促進了膀胱癌細胞向間質(zhì)細胞轉化。

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(編輯何宏靈)

收稿日期：2015-12-25修回日期：2016-01-22

基金項目：徐州市醫(yī)學青年后備人才項目(No：2014007)；徐州市科技計劃項目(No：KC14SH015)；江蘇大學臨床科技發(fā)展基金項目(No：JLY20140109)；江蘇省“六大人才高峰”資助項目(2014-WSW-066);江蘇省衛(wèi)計委青年科研課題項目No：(Q201514)。

作者簡介:林英立(1980-)，男(漢族)，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士.主要從事泌尿系腫瘤的臨床及基礎研究.E-mail: lylxz2012@126.com

中圖分類號:R737.14

文獻標志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.05.016

The effect of CDH13 down-regulation on the epithelial mesenchymal transition of bladder cancer cells

LIN Ying-li1, LI Yan-li2, QI Jing-guang1, MA Jian-guo3, LI Wen-ping3, SUN Guang4

(1.Department of Urology,Xuzhou Cancer Hospital, Xuzhou 221005; 2.Department of Science and Education, Xuzhou Cancer Hospital, Xuzhou 221005; 3.Department of Urology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051;4.Department of Urology, the Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of CDH13 down-regulation on the epithelial mesenchymal transition of bladder cancer cells. MethodsAfter CDH13 expression in 5637 cells was inhibited with RNA interference, the changes of cell morphology were observed using inverted phase contrast microscope. The expression of CDH13, E-cadherin, N-cadherin and α-smooth muscle actin were examined using Western blot. ResultsAfter the down-regulation of CDH13 expression in bladder cancer 5637 cells, the cells transited to fusiform mesenchymal-like cells, the tight intercellular connection became loose, and most cells showed slender filopodia. The expression of epithelial cell marker E-cadherin decreased (P<0.05), while the expression of N-cadherin and α-smooth muscle actin increased (P<0.05), and the differences were statistically significant compared with the control. ConclusionDown-regulation of CDH13 expression promotes the process of epithelial mesenchymal transition of bladder cancer cells.

KEY WORDS:bladder cancer; CDH13; epithelial mesenchymal transition