新疆豬毛菜總黃酮含量測(cè)定及其抗氧化活性研究

熱薩萊提·伊敏　熱娜古麗·阿不都熱合曼　木合塔爾·吐?tīng)柡?

1.新疆喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆　喀什　844000；2.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆　喀什　844000

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新疆豬毛菜總黃酮含量測(cè)定及其抗氧化活性研究

熱薩萊提·伊敏1,2熱娜古麗·阿不都熱合曼1,2木合塔爾·吐?tīng)柡?,2*

1.新疆喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆喀什844000；2.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什844000

【摘要】目的：以不同濃度的乙醇為溶劑提取豬毛菜中總黃酮，并考察提取物的抗氧化活性。方法：采用回流法提取豬毛菜中黃酮類化合物，用比色法測(cè)定不同濃度的乙醇提取物中總黃酮含量，測(cè)定各提取物的抗氧化活性。結(jié)果：豬毛菜中黃酮類化合物在25%、50%、75%的乙醇中黃酮提取率分別為24.7、50.6、48.7mg/g。各種提取物均有不同程度的抗氧化活性，且提取物的抗氧化活性與其濃度之間存在一定的量效關(guān)系，其中用50%乙醇提取的提取物清除各種自由基活性以及還原力均相對(duì)較高。結(jié)論：采用50%乙醇回流法提取的豬毛菜總黃酮含量最高，且黃酮類化合物具有較好的抗氧化活性，為豬毛菜野生資源利用和活性成分的開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】豬毛菜；總黃酮；抗氧化

豬毛菜是藜科豬毛菜屬植物豬毛菜(SalsolacollinaPall)的全草，是一種維吾爾民間藥用植物，其味淡，性涼，具有平肝潛陽(yáng)、潤(rùn)腸通便之功效。主要治高血壓病、頭痛、眩暈、失眠、腸燥便秘等病癥[1-2]。豬毛菜中含有生物堿、黃酮、糖類、有機(jī)酸、甾醇等多種成分。黃酮類化合物屬于植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于自然界各種植物中，具有清除自由基的生物活性[3]以及抗癌﹑防癌﹑消炎﹑清熱解毒﹑鎮(zhèn)靜﹑利尿等作用[4]，作為安全、無(wú)毒的天然產(chǎn)物，黃酮類化合物在醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)、美容保健等領(lǐng)域已備受關(guān)注并且已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用[5]。研究分別用25%，50%、75%的乙醇回流提取豬毛菜中的活性物質(zhì)，采用紫外分光光度法對(duì)各提取物中黃酮進(jìn)行了定性和定量分析，采用常用的幾種體外抗氧化體系對(duì)不同濃度乙醇提取物的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定分析，為豬毛菜野生資源利用及活性成分的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器TU-1990 雙光束紫外分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司)；TA1004N電子天平；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海恒科技有限公司)、SHZ-3水循環(huán)真空泵；RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；ZK-82B型真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇億通電子有限公司)；80-1型沉淀離心器(上海手術(shù)器械廠)。

1.2材料蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：0080-9705，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；豬毛菜2014年7月采集于新疆疏附縣鐵日木鄉(xiāng)，晾干，粉粹，過(guò)40目篩備用。所用試劑均為分析純。

2方法

2.1提取物的制備稱取25g豬毛菜粉末分別加入25%、50%、75%乙醇500ml，回流提取2h，抽濾，濾渣再分別加入25%、50%、75%乙醇375ml，混勻，再次回流提取1.5h，抽濾，濾渣第三次分別加入三種濃度乙醇250ml，混勻，再次回流提取1h，抽濾，合并三次濾液，65℃減壓蒸干，備用。

2.2總黃酮含量測(cè)定分別取不同提取液供試品1.00ml置25ml容量瓶中，稀釋成合適濃度，采用硝酸鋁比色法[6]測(cè)定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。得回歸方程Y=7.3961X+0.0376 (R2=0.9993)。再計(jì)算原材料豬毛菜中總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3不同提取液抗氧化活性比較準(zhǔn)確稱取0.1000g對(duì)照品Vc，溶于100ml 50%乙醇中，配制成濃度為1.000mg/ml溶液，并稀釋成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml。再準(zhǔn)確稱取豬毛菜25%、50%、75%乙醇提取物浸膏0.8000、0.6000、0.6000g，用50%乙醇定容至100ml，分別配置出1.0332、1.3062、1.2105mg/ml的溶液，分別稀釋為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml豬毛菜供試品溶液，供抗氧化活性測(cè)定用。

2.3.1對(duì)除DPPH自由基活性的測(cè)定準(zhǔn)確稱取39.4mg DPPH 試劑，用無(wú)水乙醇溶解，稀釋配制成2×10-4mol/L 的溶液。取5 支具塞試管依次向其中各加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml豬毛菜供試品溶液及DPPH溶液各2ml，搖勻[8]。反應(yīng)30min 后在最大吸收波長(zhǎng)517nm 處測(cè)定吸光度(Ai)，以乙醇替換DPPH其他步驟同上測(cè)其吸光度Aj，2mlDPPH和2ml乙醇加入同一個(gè)具塞試管其他步驟同上測(cè)其吸光度Ao，根據(jù)公式①計(jì)算豬毛菜黃酮類組分對(duì) DPPH 自由基的清除率，以Vc作為對(duì)照品。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組需平行操作 3 次，求其平均值[9]。

I%=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%

①

2.3.2羥基自由基活性的測(cè)定取5支具塞試管依次向其中各加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml豬毛菜供試品溶液及2×10-4mol/L FeSO4溶液、2×10-4mol/L H2O2、2×10-4mol/l水楊酸各2ml，于37℃水浴震蕩反應(yīng)30min，加熱完畢于510nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度Ai。蒸餾水代替H2O2其他步驟同上測(cè)其吸光度Aj，無(wú)水乙醇代替供試品其他步驟同上測(cè)其吸光度Ao。根據(jù)公式②計(jì)算豬毛菜黃酮類組分對(duì)羥基自由基的清除率，Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需重復(fù) 3 次，求其平均值[10]。

SA%=[ Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100%

②

2.3.3超氧陰離子自由基活性的測(cè)定精密量取4.5ml0.05 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，25℃水浴20min，分別加入不同濃度(0.1～0.9mg/ml)的三種供試品溶液各1.00ml,再分別加入0.40ml 25mmol /L 鄰苯三酚溶液，混和均勻，于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入10mmol/L 鹽酸溶液1.00ml終止反應(yīng)，于325nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算清除率[11]。

清除率%=[ 1-(Ai-Aj) /Ao]×100%

2.3.4還原能力的測(cè)定分別量取不同濃度(0.1～0.9mg/ml)的供試品溶液各2.50ml于5支具塞試管中，依次加入pH6.6磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.50ml，在50℃下恒溫反應(yīng)20min，再加10%三氯乙酸2.50ml后立刻以3000r/min離心10min，取上清液3ml依次加入2.5ml蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液0.50ml充分混合，靜置10min后，于700nm處測(cè)吸光度值[12]，吸光值來(lái)表明還原能力并且A值高的樣品表明其還原能力高。每個(gè)試樣作3次平行測(cè)定，取其平均值。

3結(jié)果與討論

3.1豬毛菜不同提取液總黃酮含量從表1中可以看出，豬毛菜不同濃度的乙醇提取物的得率存在差異，其中25%乙醇提取物浸膏得率為20.8%，50%乙醇提取物浸膏得率為24.2%，75%乙醇提取物浸膏得率為23.0%，通過(guò)蘆丁線性回歸方程Y=7.3961X+0.0376 (R2=0.9993)計(jì)算出來(lái)的黃酮含量分別為24.7、50.6、48.7mg/g。雖然25%乙醇提取物浸膏得率較高，但是，黃酮含量較低，可能在低濃度乙醇中黃酮以外的其他化學(xué)物質(zhì)溶解的多。

表1　豬毛菜不同濃度乙醇提取液中總黃酮含量

3.2豬毛菜不同提取液中黃酮的紫外光譜特性黃酮類化合物都共同C6-C3-C6的特殊結(jié)構(gòu)，紫外光譜在240～280nm范圍內(nèi)出現(xiàn)特征峰和在330～400nm范圍內(nèi)出現(xiàn)特征峰。這兩個(gè)特征峰分別由A-環(huán)苯酰系統(tǒng)和B-環(huán)肉桂酰系統(tǒng)生成的[13-14]。豬毛菜提取物的紫外吸收峰如圖1 所示，豬毛菜提取物的主要吸收峰為233nm、261nm、332nm。由261nm出現(xiàn)的特征峰可以看出豬毛菜提取物中有A-環(huán)苯酰系統(tǒng)，由332nm產(chǎn)生的吸收峰看出豬毛菜提取物有B-環(huán)肉桂酰系統(tǒng)，且豬毛菜提取物和標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的紫外光譜特征圖相似(圖2)。

3.3對(duì)DPPH 自由基清除活性的測(cè)定結(jié)果由圖3可知，以Vc 為對(duì)照，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(0.1～0.9mg/ml)，Vc清除DPPH自由基的能力隨著濃度的升高不怎么明顯，而三種不同乙醇提取液的清除率都呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，并且濃度在0.1～0.5mg/ml范圍內(nèi)，各供試品對(duì)DPPH自由基清除率上升較快，隨后趨于平滑。三種提取物清除率分別為:Vc>豬毛菜50%乙醇提取物>豬毛菜75%乙醇提取物>豬毛菜25%乙醇提取物。當(dāng)濃度為0.9mg/ml時(shí)豬毛菜50%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為88.2%，此結(jié)果跟Vc較接近，說(shuō)明野菜豬毛菜提取液有著較好的清除DPPH自由基的能力，可以作為天然抗氧化劑產(chǎn)品。

3.4對(duì)羥基自由基清除活性的測(cè)定結(jié)果從圖4可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(0.1～0.9mg/ml)，隨著濃度的增大，以及豬毛菜不同濃度乙醇提取物對(duì)羥自由基的清除率都有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而Vc的清除率增長(zhǎng)得較快。當(dāng)濃度在0.15mg/ml左右時(shí)，豬毛菜50%、75%乙醇提取物的清除率比Vc高；豬毛菜50%乙醇提取物和Vc的濃度為0.25mg/ml時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率分別達(dá)到54.6%、57.3%，隨著試驗(yàn)樣品濃度繼續(xù)升高，清除羥自由基能力大小分別為：Vc>豬毛菜50%乙醇提取物>豬毛菜75%乙醇提取物>豬毛菜25%乙醇提取物。當(dāng)濃度達(dá)到0.9mg/ml時(shí)，豬毛菜50%、75%乙醇提取物對(duì)羥自由基的也具有較好的清除能力，清除率分別為80.9%、76.3%。

3.5對(duì)超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定結(jié)果從圖5可知，在試驗(yàn)所測(cè)定濃度范圍內(nèi)，三種供試品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率都較低且達(dá)不到Vc的清除率。清除率大小順序?yàn)椋篤c>豬毛菜50%乙醇提取物>豬毛菜75%乙醇提取物> 豬毛菜25%乙醇提取物。其中Vc 在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，上升趨勢(shì)較快，并且在濃度達(dá)到0.9mg/ml時(shí)，Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除率已經(jīng)達(dá)到93.8%；三種不同濃度乙醇提取液中，50%乙醇提取液的抑制率稍微高些，但是只有39.9%，因此豬毛菜對(duì)超氧陰離子自由基雖有一定的清除作用，但都較弱。

3.6還原力測(cè)定從圖6可知，供試品在給定濃度范圍內(nèi)的還原能力大小順序?yàn)椋篤c>豬毛菜50%乙醇提取物>豬毛菜25%乙醇提取物>豬毛菜75%乙醇提取物。Vc還原力隨著濃度的增加而明顯增大，在濃度為0.5mg/ml時(shí)，其還原能力達(dá)到1.75；豬毛菜不同濃度乙醇提取物的還原力與濃度存在量效關(guān)系，但還原能力一般，在濃度為0.9mg/ml時(shí)，豬毛菜的25%、50%、75%的乙醇提取物的還原力分別為0.521、0.278、0.217。

4結(jié)論

豬毛菜不同濃度的乙醇提取物的得率存在差異，其中25%乙醇提取物浸膏得率為20.8%，50%乙醇提取物浸膏得率為24.2%，75%乙醇提取物浸膏得率為23.0%，黃酮含量分別為24.7、50.6、48.7mg/g。供試品含有總黃酮含量與其抗氧化活性與之間存在一定的關(guān)系。研究對(duì)量與效率之間的定量關(guān)系沒(méi)進(jìn)行系統(tǒng)性研究，但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，豬毛菜不同濃度的乙醇提取物的抗氧化活性與黃酮類化合物的總含量有著較密切的關(guān)系，黃酮類化合物含量越高的提取物抗氧化活性也就越強(qiáng)。其中用50%乙醇提取的提取物清除以上三種自由基活性以及還原力都較高，豬毛菜總黃酮的提取及抗氧化活性的研究為提高豬毛菜野生資源利用和活性成分的開(kāi)發(fā)提供一定的依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃青年教師科研啟動(dòng)基金(XJEDU2014S055)。

作者簡(jiǎn)介：熱薩萊提·伊敏(1985-)，女，新疆喀什人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物分析。 通信作者：木合塔爾·吐?tīng)柡?，男，新疆喀什人，教授，主要從事天然產(chǎn)物有效成分分析。E-mail:tumut@sohu.com

【中圖分類號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)12-0014-03

(收稿日期：2016.04.21)

Contents of total flavonoids and antioxidant activity ofSalsolacollina

Resalat EMIN1,2Renagul ABDURAHMAN1,2Mheta′er Tu′erhong1,2*

1. Chemistry and Environmental Science College, Kashgar University,Kashgar 844007,China；2. Laboratory of Xinjiang Native Medicinal and Edible Plant Resources Chemistry, Kashgar 844007 , China

Abstract:With different concentrations of ethanol as extraction agent, the total flavonoid compounds in Salsola were extracted by refluxing method,and the content of total flavonoids in the ethanol extract with different concentration were determined by colorimetry，and the antioxidant activity were tested. The results showed that, the flavonoids in Salsola in 25%, 50%, 75% ethanol extraction rate were 24.7mg/g,50.6mg/g,48.7mg/g respectively. And 50% ethanol extracts exhibited the highest activity in removing DPPH free radicals hydroxyl free radicals and superoxide anion as well as the highest reducing capacity. Studying on extraction and antioxidant activity of total flavonoids of Salsola can improve the development of China′s wildlife resources and utilization of active ingredients.

Key words:Salsola collina；total flavonoids；antioxidant activity