慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞絲裂原活化蛋白激酶p38的表達

劉力興　賈欽堯　陳紹平　劉敬霞

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川　南充　637000)

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慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞絲裂原活化蛋白激酶p38的表達

劉力興賈欽堯陳紹平劉敬霞1

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川南充637000)

〔摘要〕目的研究絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血單個核細胞中的表達情況及其與氣流受限的相關(guān)性。方法選擇確診的急性加重期COPD(AECOPD)患者50例作為實驗組，根據(jù)肺功能檢測，分為重-極重度組(A組)26例和輕-中度組(B組)24例。選擇同期門診健康受試者25例為對照組，采集各組受試者外周血，運用PCR熒光檢測法測定P38 MAPK mRNA的表達，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測外周血白細胞介素(IL)-6和IL-8含量。結(jié)果實驗組患者外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK mRNA表達和血清IL-6、IL-8含量均高于對照組(P<0.05)；A組患者外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK mRNA的表達和血清IL-6、IL-8含量顯著高于B組(P<0.05)；AECOPD患者外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK mRNA表達隨1 s用力呼氣容積(FEV1)占預(yù)計值升高而下降(r=-0.91，P<0.05)。結(jié)論p38 MAPK、IL-6、IL-8參與了COPD的炎癥反應(yīng)，且同COPD患者的氣流受限程度呈正相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕p38 MAPK；慢性阻塞性肺疾?。话准毎樗?6；白細胞介素-8

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病機制復(fù)雜，與炎性細胞、炎性介質(zhì)等參與密切相關(guān)，以不完全可逆的氣流受限為基本特征，病情呈進行性發(fā)展〔1〕。絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)是細胞內(nèi)重要信號傳遞者MAPKs家族一員，參與炎性細胞因子和應(yīng)激信號的傳導(dǎo)，在COPD的發(fā)病及病情變化中起到重要作用。本研究通過評價不同肺功能患者外周血單個核細胞p38 MAPK及白細胞介素(IL)-6、IL-8表達情況，分析三者之間的相關(guān)性，進一步探討其在COPD發(fā)病機制的作用。

1資料與方法

1.1一般資料采集2014年3月至2015年2月我院呼吸內(nèi)科住院及門診急性加重期COPD(AECOPD)患者50例，根據(jù)肺功能檢測，實驗組分為重-極重度(A組)26例，年齡47～75〔平均(63.4±9.9)〕歲，平均病程(7.1±4.7)年；輕-中度(B組)24例，年齡46～76〔平均(63.9±10.6)〕歲，平均病程(7.2±5.1)年。在門診隨機挑選健康體檢者25例作為對照組，男13例，女12例；年齡45～77〔平均(61.7±11.2)〕歲。三組年齡、性別等一般情況無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。所有參與實驗的病例均符合倫理學(xué)規(guī)定，簽有知情同意書。AECOPD診斷及分組標準〔1〕：近期有咳嗽、咳痰、氣短加重且1 s用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%可確診。FEV1占預(yù)計值≥50%為輕-中度；<50%為重-極重度。

1.2主要試劑及儀器人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司，中國)，熒光檢測試劑:GoTaq?PCR(Promega公司，美國)，p38 MAPK及內(nèi)參照GAPDH使用的引物(Biosail公司，加拿大)，低溫高速離心機5417R(Eppendorf公司，美國)，7900 RT-PCR儀(ABI公司，美國)，肺功能檢測儀(HP Deskjet 3748，德國)；IL-6/IL-8試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，中國)；酶標儀(Benchmark，德國)。

1.3方法

1.3.1引物的設(shè)計p38 MAPK及內(nèi)參GAPDH的引物由加拿大的Biosail公司設(shè)計并合成，p38 MAPK上游：5'-AAGTTCCTGTCCACATTGCC-3'，下游：5'-TGGATTCAGTGTCAAGCTGC-3'，產(chǎn)物長度398 bp；GAPDH上游：5'-TCAACAGCGACACCCACTCC-3'，下游：5'-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3'，產(chǎn)物長度126 bp。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測采集就診時未經(jīng)任何醫(yī)學(xué)處理的空腹COPD患者外周血3～5 ml，肝素鈉抗凝處理，分離出外周血單個核細胞。常規(guī)用Trizol提取各組外周血單個核細胞總RNA，按說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用 GoTaq?qPCR進行熒光檢測，整個PCR反應(yīng)體系如下：2倍的GoTaq?qPCR Master Mix、樣本cDNA 0.2 μg、雙蒸水，建立總體積40 μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：96℃ 2 min，96℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s，連續(xù)40個循環(huán)?！癈t值倒數(shù)” 法計算樣本cDNA相對含量，即p38 MAPK cDNA相對含量= p38 MAPK Ct值倒數(shù)/GAPDH Ct值倒數(shù)。

1.3.3外周血IL-6、IL-8檢測采集患者外周靜脈血，運用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢查，步驟參照試劑使用說明。

1.3.4肺功能檢測對所有病例在采集靜脈血之前，用肺功能檢測儀進行肺功能檢測，測定FEV1占預(yù)計值及FEV1/FVC，并仔細記錄數(shù)據(jù)，方便后來的數(shù)據(jù)比較。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、Spearman相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1各組p38 MAPK mRNA、IL-6、IL-8水平比較實驗組患者外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK水平和血清IL-6、IL-8含量均高于對照組(P<0.05)。A組的外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK水平和血清IL-6、IL-8含量明顯高于B組和對照組(P<0.05),B組的外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK水平和血清IL-6、IL-8含量明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2p38 MAPK mRNA與IL-6、IL-8及肺功能的相關(guān)性p38 MAPK mRNA表達量和IL-6、IL-8呈正相關(guān)(r= 0.76、0.82，P<0.05)；血清IL-6濃度和IL-8的濃度呈正相關(guān)(r=0.84，P<0.05)。AECOPD患者外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK mRNA表達隨FEV1占預(yù)計值升高而下降，與肺功能呈負相關(guān)(r=-0.91，P<0.05)，即與氣道氣流受限程度呈正相關(guān)。

表1　各組p38 MAPK mRNA表達與IL-6、IL-8含量比較

與對照組比較:1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

3討論

COPD是可預(yù)防、可治療的常見病，持續(xù)存在氣流受限，且呈進行性發(fā)展，伴氣道及肺泡對有害顆?；驓怏w導(dǎo)致的慢性炎癥的增加，COPD在全球40歲以上人群中發(fā)病率大約是9%～10%,其在全世界主要死因中排列第四位，預(yù)計到2020年，全球COPD 病死率將上升至第三位〔2〕。

MAPKs是胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要通路，是多個信號傳遞的交點和共同通路，細胞質(zhì)內(nèi)分布廣泛，將細胞外刺激信號傳遞至細胞核內(nèi)，影響著細胞增殖、分化和應(yīng)激調(diào)控〔3〕。三級激酶級聯(lián)傳遞信號，即MKKK、MKK、MAPK，是該家族信號傳導(dǎo)的共同特點。p38是MAPKs家族中重要一員，具有α，β，δ和γ四個亞型，其中p38α與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。近些年，p38對COPD發(fā)病影響的研究較為廣泛，研究顯示其具有細胞免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要作用，在生物學(xué)刺激下經(jīng)過磷酸化等激活，在細胞核等重要部位發(fā)揮作用〔4〕。IL-6抑制Th1細胞分化導(dǎo)致Th1和Th2間不平衡，Rincon等〔5〕發(fā)現(xiàn)，在AECOPD痰液中的IL-8水平升高，提示IL-8作為中性粒細胞趨化因子，參與和擴大了COPD炎性反應(yīng)，IL-6、IL-8均可導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)加重，陸兆雙等〔6〕研究證明p38 MAPK通過介導(dǎo)IL-6和IL-8的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)細胞因子合成。

本研究提示p38 MAPK及IL-6、IL-8不僅參與氣道炎性反應(yīng)的發(fā)生，而且對氣道炎癥的發(fā)展和病情起促進作用。本研究還發(fā)現(xiàn)AECOPD患者外周血單個核細胞核內(nèi)p38 MAPK mRNA表達與氣道氣流受限程度呈正相關(guān)，說明其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)損壞了肺功能，且同肺功能的損壞程度呈正相關(guān)，Banerjee等〔7〕認為p38的活性與肺功能損害及肺泡壁炎癥程度相關(guān)。龍仕居等〔8〕證實了COPD患者的血清及痰液中IL-6、IL-8的升高隨病情加重一致，這均與本研究結(jié)果一致。本研究中，p38 MAPK及IL-6、IL-8三者之間互為正相關(guān)，國外研究認為〔9,10〕p38 MAPK信號通路參與IL-6,IL-8基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，與p38 MAPK通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制參與炎癥因子的合成和分泌的理論一致，Armstrong等〔11〕認為p38 MAPK抑制劑可抑制IL-6、IL-8等炎性介質(zhì)的分泌和釋放，因此，結(jié)合本研究結(jié)果，考慮p38 MAPK同IL-6、IL-8之間可能存在共同傳導(dǎo)通路，其具體機制需要更多的研究來證實。

綜上所述，p38 MAPK可能在AECOPD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且參與了其肺功能的損害，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活I(lǐng)L-6、IL-8等炎癥因子的釋放,進一步加重COPD患者炎癥反應(yīng)。繼續(xù)深入研究p38 MAPK在COPD中的作用和機制，探索通過阻斷p38 MAPK信號通路，抑制IL的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，可能為COPD炎癥反應(yīng)發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)和治療靶點。

4參考文獻

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〔2015-12-31修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(No.81260569)；四川省教育廳基金項目(No.13ZA0216)

通訊作者：陳紹平(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事呼吸內(nèi)科疾病的診斷與治療研究。

〔中圖分類號〕R563.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2966-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.067

Expression of P38 MAPK in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic obstructive pulmonary diseasesLIU Li-Xing,JIA Qin-Yao,CHEN Shao-Ping,et al.

Department of Internal Medicine,Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College，Nanchong 637000,Sichuan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between expression of p38 MAPK in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic obstructive pulmonary diseases(COPD)and airflow obstruction.Methods50 patients diagnosed as acute exacerbation of COPD(AECOPD)were involved as experimental group.Based on pulmonary function tests,they were divided into Group A(severe to extremely severe)and Group B(mild to moderate).26 and 24 patients were assigned to Group A and Group B respectively.25 healthy subjects were selected from the outpatient service.Peripheral blood from subjects in each group was collected.The expression of mRNA of p38 MAPK was determined by PCR fluorescence detection while the concentrations of IL-6 and IL-8 in peripheral blood were measured via ELISA.ResultsThe expression of p38 MAPK mRNA in nuclei of peripheral blood mononuclear cells and the concentrations of IL-6 and IL-8 in serum were higher in patients from the experimental group than the control group(P<0.05).The expression of p38 MAPK mRNA in nuclei of peripheral blood mononuclear cells and the concentrations of IL-6 and IL-8 in serum of Group A were significantly higher than those of Group B(P<0.05).The expression of nuclear mRNA P38 MAPK in peripheral blood mononuclear cells in patients with AECOPD decreased as FEV1% pred increased and the correlation coefficient(r=-0.91,P<0.05).Conclusionsp38 MAPK,IL-6 and IL-8 are involved in the inflammatory response of COPD and are positively correlated with airflow obstruction in COPD patients.

【Key words】P38MAPK；Chronic obstructive pulmonary diseases；IL-6；IL-8

1寧夏醫(yī)科大學(xué)

第一作者：劉力興(1970-)，男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸內(nèi)科疾病的診斷與治療研究。