二十二碳六烯酸治療糖尿病白內(nèi)障病變的MEK通路機(jī)制

陽(yáng)　輝　張新芳　冉瑞金

(湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北　恩施　445000)

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二十二碳六烯酸治療糖尿病白內(nèi)障病變的MEK通路機(jī)制

陽(yáng)輝張新芳1冉瑞金1

(湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探討二十二碳六烯酸(DHA)治療糖尿病(DM)白內(nèi)障病變的MEK通路機(jī)制。方法小劑量鏈脲佐菌素(STZ)合并高糖高脂飲食復(fù)制DM大鼠白內(nèi)障病理模型，對(duì)照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水，DHA組大鼠尾靜脈注射DHA。分析大鼠晶狀體狀態(tài)及胰島素抵抗系數(shù)(HOMA-IR)的變化，檢測(cè)大鼠晶狀體組織MEK信號(hào)通路Ras、Raf、MEK及ERK1/2蛋白的表達(dá)。結(jié)果DM白內(nèi)障大鼠組晶狀體渾濁，HOMA-IR升高(P<0.01)，Ras、Raf、MEK及ERK1/2明顯升高(P<0.01)，細(xì)胞凋亡分子Caspase3及Caspase9水平也明顯上升(P<0.01)，而DHA組大鼠上述指標(biāo)的異常得到明顯改善(P<0.01)。結(jié)論DHA能夠有效緩解DM白內(nèi)障大鼠癥狀，且其作用機(jī)制可能與抑制MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕糖尿病白內(nèi)障；二十二碳六烯酸；MEK信號(hào)通路；胰島素抵抗

白內(nèi)障是糖尿病(DM)的主要并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的視力，并可能導(dǎo)致失明〔1，2〕。但是，目前關(guān)于DM白內(nèi)障發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不明確。MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)并引起核轉(zhuǎn)錄因子激活的關(guān)鍵信號(hào)通路，參與了多種DM并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔3，4〕。本研究旨在探討抗氧化劑二十二碳六烯酸(DHA)治療DM白內(nèi)障病變的MEK通路機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重200～230 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司〔許可號(hào)SCXK(京)2014-0004〕?；A(chǔ)飼料和高糖高脂飼料均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。高糖高脂飼料配方：59.2%基礎(chǔ)飼料、膽固醇2.5%、蔗糖20.0%、膽酸鈉0.3%、豬油18.0%。

鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；血糖儀為羅氏Accu-Check Performa產(chǎn)品；葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自北京天根生物工程有限公司；熒光定量PCR儀ABI7700購(gòu)自美國(guó)ABI公司；引物由上海生工生物有限公司協(xié)助合成；MEK及ERK1/2單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；Ras及Raf單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；二抗及顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動(dòng)物分組50只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DM白內(nèi)障組、DHA低劑量組(1 μmol/L)、中劑量組(50 μmol/L)和高劑量組(100 μmol/L)，每組10只。小劑量STZ合并高糖高脂飲食復(fù)制DM白內(nèi)障模型，對(duì)照組和DM白內(nèi)障組大鼠給予生理鹽水治療，DHA組分別給予對(duì)應(yīng)劑量的DHA灌胃治療。12 w后頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，分離晶狀體于液氮中保存待用。

1.3熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)mRNA制備及cDNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量PCR 的反應(yīng)條件：95℃ 10 min；94℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，收集熒光，共 30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μl：cDNA 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，2.5×SYBR Green(TianGen)8 μl，超純水9 μl。引物序列：β-actin正義：5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，反義：5'-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3'；MEK正義：5'- GGAAAGTGGCACAGCTTGCT -3'，反義：5'-CTGGTCAGGCGCTCGATT -3'；Ras正義：5'-GGATTTGATGCCTTGGGAGTCAGAC-3'，反義：5'-ATTTTTTTCTTTGGAGTCAGTCCAT-3'；Raf正義：5'-AAGATGGTACAGTGGACGGC-3'，反義：5'-CCGTGTTCCTGGTGAAATCT-3'；ERK1正義：5'-TCCTTTGGATCTGGTCCTG-3'，反義：5'-CCCCAGCAAGTGAGAGAAG-3'；ERK2正義：5'-AAGAGGTTGTTCCAAATGC-3'，反義：5'-AGAGGCACCATTCACTGAC-3'。

1.4免疫印跡法各組大鼠晶狀體組織分離后在冰水浴中充分勻漿，進(jìn)行總蛋白定量后以等量總蛋白進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳，至溴酚藍(lán)移動(dòng)到凝膠底部時(shí)停止電泳，采用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至PVDF膜上后5%BSA在室溫條件下封閉2 h。然后與一抗(稀釋比1∶200)4℃溫孵雜交，然后用無(wú)菌PBS漂洗3次，與二抗室溫雜交2 h。硝酸纖維素膜用PBS漂洗后進(jìn)行顯影、定影。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行蛋白表達(dá)定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK或Dunnett法檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1DM白內(nèi)障大鼠空腹胰島素(FINS)及DHA干預(yù)作用分析DM白內(nèi)障大鼠FINS及胰島素抵抗系數(shù)(HOMA-IR)明顯升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)；而DHA組大鼠的FINS及HOMA-IR明顯降低，且具有劑量依從性(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1　DM白內(nèi)障大鼠FINS及藥物干預(yù)作用

與對(duì)照組相比：1)P<0.01；與DM白內(nèi)障組相比:2)P<0.05，3)P<0.01；下表、圖同

2.2DM白內(nèi)障大鼠MEK、ERK1/2、Ras和Raf mRNA表達(dá)分析DM白內(nèi)障大鼠晶狀體組織中MEK、ERK1/2、Ras和Raf mRNA表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，而DHA組大鼠上述蛋白的異常表達(dá)得到明顯改善(P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.3DM白內(nèi)障大鼠Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Caspas 3、Caspase 9蛋白表達(dá)變化及DHA作用分析DM白內(nèi)障大鼠晶狀體組織中Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Caspase 3、Caspase 9蛋白表達(dá)明顯升高，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，而DHA組大鼠上述蛋白的異常表達(dá)得到明顯的改善(P<0.01)，見(jiàn)圖1～圖3。

表2　MEK、ERK1/2、Ras和Raf在不同組大鼠中mRNA表達(dá)的差異

圖1　免疫印跡法分析Ras、Raf蛋白在不同組大鼠中表達(dá)的差異性及DHA的干預(yù)作用

圖2　免疫印跡法分析MEK和ERK1/2蛋白在不同組大鼠中表達(dá)的差異性及DHA的干預(yù)作用

圖3　免疫印跡法分析Caspase3及Caspase9蛋白在不同組大鼠中表達(dá)的差異性及DHA的干預(yù)作用

3討論

CM及其并發(fā)癥的發(fā)生率及死亡率逐年升高，嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量和生存狀態(tài)。本研究提示DHA能夠有效緩解DM白內(nèi)障大鼠癥狀，且其作用機(jī)制可能與抑制MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活相關(guān)。

MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)最常見(jiàn)的信號(hào)通路之一，參與了DM多種并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。在研究燈盞花素對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和DM大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)影響的研究中發(fā)現(xiàn)DM大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF及ERK通路蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且VEGF可能是由ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)的〔5〕。以往研究也發(fā)現(xiàn)DM大鼠白內(nèi)障發(fā)病過(guò)程中表現(xiàn)為ERK信號(hào)通路的激活，且MEK抑制劑PD98059可以通過(guò)抑制該通路發(fā)揮作用〔6〕。郝祥俊等〔7〕也發(fā)現(xiàn)，DM大鼠腎臟損傷模型中ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)明顯升高，而絲膠能夠通過(guò)抑制ERK通路發(fā)揮治療糖尿病腎病的作用。在對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路與2型DM大鼠局灶性腦缺血早期作用的研究中也發(fā)現(xiàn)DM大鼠腦缺血早期過(guò)程中存在ERK通路的激活，且是該病理過(guò)程的主要機(jī)制〔8〕。林永廉等〔9〕也發(fā)現(xiàn)大蒜素能通過(guò)抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮對(duì)DM大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。本研究也表明MEK通路的激活參與了

DM白內(nèi)障的發(fā)病過(guò)程，且DHA可以通過(guò)抑制該通路發(fā)揮改善DM白內(nèi)障并發(fā)癥的作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序化死亡過(guò)程，DM視網(wǎng)膜病變組織中存在明顯的細(xì)胞凋亡過(guò)程〔10〕。以往的研究也發(fā)現(xiàn)DM腎病組織〔11〕及DM心肌缺血再灌注大鼠模型〔12〕中都存在明顯的細(xì)胞凋亡過(guò)程。本研究也表明細(xì)胞凋亡抑制也可能是DHA改善DM白內(nèi)障并發(fā)癥的作用機(jī)制之一。因此，DHA能夠有效緩解DM白內(nèi)障大鼠癥狀，且其作用機(jī)制可能與抑制MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活相關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-10-12修回〕

(編輯李相軍)

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳中青年人才項(xiàng)目(No.Q20151901)

通訊作者：張新芳(1969-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事白內(nèi)障、眼底病研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R587.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2864-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.017

1湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院眼科

第一作者：陽(yáng)輝(1971-)，男，講師，主要從事臨床藥理研究。