大孔樹脂富集川芎中洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的工藝優(yōu)選

凌運妮 金露薇 魏元鋒 錢帥 高緣 張建軍

摘要：目的 優(yōu)選大孔樹脂富集川芎中的苯酞類活性成分洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（Senkyunolide Ⅰ，SⅠ）的工藝條件。方法 綜合靜態(tài)和動態(tài)吸附及解吸試驗，篩選合適的大孔樹脂；以產(chǎn)物回收率、純度等為指標(biāo)，優(yōu)化樹脂對SⅠ富集的工藝參數(shù)。結(jié)果 篩選的6種大孔樹脂中，HPD100樹脂對SⅠ有較好富集作用。具體工藝參數(shù)為：上樣濃度1 g原藥材/mL，上樣量3 mL/g濕樹脂，靜態(tài)吸附時間2 h，樹脂床徑高比1∶6，以水洗脫至洗脫液近無色后，進(jìn)而用6倍樹脂床體積的40%乙醇（V/V）進(jìn)行解吸附，洗脫流速為2～4倍樹脂床體積/h，收集洗脫液。在優(yōu)選的工藝條件下，所得產(chǎn)物中SⅠ含量可達(dá)8.0%，比處理前提高了13.3倍，回收率為72%。結(jié)論 本研究建立的大孔樹脂法對SⅠ有較理想的富集效果，為其進(jìn)一步分離、制備奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大孔樹脂；川芎；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ；富集

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.024

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0090-05

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong hort.的干燥根莖，有活血行氣、祛風(fēng)止痛等功效，主要用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、胸脅刺痛、跌仆腫痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛等病癥的治療[1]。川芎中含多類化學(xué)成分，如苯酞類、萜烯類、有機(jī)酸及其酯、生物堿、多糖等[2]。其中苯酞類成分的抗驚厥、抗血栓形成、降低血液黏稠度、調(diào)節(jié)心臟功能、防止腦缺血、鎮(zhèn)靜和催眠等功效均已得到證實，其功效與川芎的活血行氣、祛風(fēng)止痛功效密切相關(guān)，故其為川芎的主要活性成分[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（Senkyunolide Ⅰ，SⅠ）為川芎中重要的苯酞類活性化合物，該成分具有較強(qiáng)的抗氧化、抗凋亡、抗大鼠腦缺血再灌注損傷等作用[4]。我們的前期研究也表明，該成分具有優(yōu)良的體外穩(wěn)定性及體內(nèi)藥動學(xué)特征，口服既可吸收入血又可入腦，具備較好的開發(fā)價值[5]。但由于該成分在川芎中的含量相對較低，從植物中提取、制備時有必要首先對其進(jìn)行富集，因此，本研究探索一種有效的大孔吸附樹脂富集SⅠ方法，為該類成分進(jìn)一步開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100（上海愛明儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SHIMADZU高效液相色譜儀（LC-2010C HT），配備DAD二極管陣列檢測器、四元泵、自動進(jìn)樣器、LC-solution色譜工作站。

川芎藥材購于上海泰坤堂中醫(yī)院（產(chǎn)地云南，批號20121028），經(jīng)中國藥科大學(xué)天然藥物實驗中心王龍老師鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖；SⅠ對照品（批號140226，純度HPLC≥98%），成都克洛瑪生物科技有限公司；AB-8、HPD300、X-5、DM130大孔樹脂，安徽三星科技有限公司；D101大孔樹脂，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；HPD100大孔樹脂，鄭州勤實科技有限公司；甲醇為色譜純，水為自制minipore超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樹脂預(yù)處理

將市售新樹脂按說明書預(yù)處理，最后保存于蒸餾水中備用（用時抽濾，并用濾紙吸干樹脂顆粒表面水分）。

2.2 上樣液的制備

川芎根莖粗粉800 g，用10倍量50%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，過濾，減壓回收溶劑至干，得川芎干浸膏。稱取干浸膏適量，加蒸餾水溶解，稀釋成每1 mL含所需原藥材含量的溶液。

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：甲醇（A）-1%醋酸（B），梯度洗脫（0～35 min，5%～35%A；35～50 min，35%～80%A；50～60 min，80%A；60～65 min，80%～5%A）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：20 ?L。

2.3.2 對照品貯備液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的SⅠ對照品55.5 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制備得到1.11 mg/mL對照品貯備液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取上述對照品貯備液適量至容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為333、111、55.5、22.2、5.55、2.22、0.555 ?g /mL的對照品溶液，按上述色譜條件測定。以對照品濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程Y=62 545X-16 101（r=0.999 9），結(jié)果表明SⅠ在0.555～333 ?g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系良好。

2.3.4 測定法 在上述色譜條件下，方法的精密度、穩(wěn)定性、回收率等良好。精密吸取待測液適量，用50%乙醇適當(dāng)稀釋，0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算SⅠ含量。

2.4 樹脂篩選

2.4.1 靜態(tài)吸附-解吸試驗 稱取按“2.1”項下方法處理并抽濾至干（不滴水）的AB-8、HPD300、DM130、X-5、HPD100、D101大孔樹脂各2.00 g，分別加入上樣液30 mL（原藥材含量為150 mg/mL，SⅠ含量為226.73 ?g/mL），靜態(tài)吸附4 h后過濾，濾液用50%乙醇適當(dāng)稀釋，進(jìn)樣檢測，計算吸附率[（吸附前樣品液中SⅠ總量-吸附后殘液中SⅠ總量）÷吸附前樣品液中SⅠ總量×100%]。上述靜態(tài)吸附試驗后的樹脂，分別加50%乙醇50 mL，振蕩解吸6 h，取樣測定，計算解吸率（解吸液體積×解吸液SⅠ濃度÷吸附在樹脂上的SⅠ總量×100%）。結(jié)果見表1。可見，6種大孔樹脂對SⅠ的吸附與解吸性能有明顯差別。吸附能力由大到小依次為HPD100>HPD300>X-5>DM130>D101>AB-8，解吸能力由大到小依次為HPD300>D101>HPD100>X-5>DM130>AB-8，其中HPD300、HPD100大孔樹脂對SⅠ的吸附率和解吸率均較高。

2.4.2 動態(tài)吸附-解吸試驗 根據(jù)靜態(tài)試驗結(jié)果對初步篩選出的2種樹脂HPD300和HPD100采用動態(tài)解析試驗進(jìn)一步優(yōu)選。分別取上述2種樹脂各5.00 g，濕法裝柱（1.2 cm×40 cm），各量取上樣液（1 g原藥材/mL）8 mL，上樣吸附4 h。用4倍樹脂床體積（BV）蒸餾水洗脫（流速2 BV/h），收集洗脫液，液相檢測，計算吸附率。再以6 BV 50%乙醇洗脫（流速1 BV/h），每1 BV收集1次，進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1?？梢姡琀PD100和HPD300大孔樹脂對SⅠ的吸附率相似，均達(dá)98%。在同等操作條件下，HPD100對SⅠ的解吸性能略優(yōu)于HPD300樹脂，且目標(biāo)成分SⅠ主要集中在前4 BV，故選用HPD100樹脂。

2.5 富集工藝參數(shù)考察

2.5.1 上樣濃度 吸取上樣液（2 g原藥材/mL）各2 mL，分別加入蒸餾水0、1、2、3、4、8、16 mL，搖勻，即得含原藥材2000、1333、1000、800、667、400、222 mg/mL的上樣溶液，分別置7個錐形瓶中，各加HPD100大孔樹脂2.00 g，靜態(tài)吸附3 h，時時振搖，樣品液處理后進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖2?？梢?，上樣液濃度對HPD100樹脂吸附SⅠ影響不大，但對解吸率有較大影響。上樣濃度為1000 mg原藥材/mL時，有最大解吸率，可達(dá)90.8%，故最佳上樣濃度為1000 mg原藥材/mL。

2.5.2 上樣體積 稱取HPD100大孔樹脂各1.00 g，置于5個50 mL燒杯中，精密吸取上樣液（原藥材含量為1 g/mL，SⅠ含量為1511.5 ?g/mL）各1、2、3、4、5 mL上樣，靜置吸附4 h，用適量蒸餾水洗滌，各加50%乙醇50 mL解吸3 h，進(jìn)樣檢測，計算回收率（解吸液體積×解吸液中SⅠ濃度÷吸附前樣品液中SⅠ總量×100%）。結(jié)果見圖3?？梢?，隨著上樣體積增加，SⅠ回收率降低，上樣體積在3 mL以下時，SⅠ回收率達(dá)80%以上。綜合考慮HPD100樹脂的利用效率及SⅠ回收率，選擇上樣體積為3 mL/g樹脂。

2.5.3 吸附時間 稱取HPD100樹脂各5.00 g，濕法裝柱，上樣，分別靜置吸附0.5、1、2、4 h，水洗除雜；用6 BV 50%乙醇洗脫（流速3 BV/h），分別收集洗脫液，進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖4?？梢姡綍r間在2 h時，已達(dá)較高回收率（>80%），故確定吸附時間為2 h。

2.5.4 洗脫溶劑乙醇濃度 稱取HPD100樹脂40 g，加入50 mL上樣液（0.5 g原藥材/mL），吸附6 h，抽濾至近干，各取3 g，置于5個錐形瓶中，依次加入10%、20%、30%、40%、50%乙醇各50 mL，振蕩解吸3 h后進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖5。當(dāng)乙醇濃度為40%（V/V）時，SⅠ濃度即達(dá)平臺，且隨乙醇濃度增大，更多雜質(zhì)亦會同時被洗脫下來，導(dǎo)致產(chǎn)物中SⅠ純度降低，故最佳乙醇濃度為40%。

2.5.5 徑高比 取樹脂裝柱，使徑高比分別為1∶3、1∶6、1∶9、1∶13，上樣吸附3 h，水洗脫后以6 BV 40%乙醇解吸（流速3 BV/h），收集解吸液，測定，計算回收率，結(jié)果見圖6?？芍罴褟礁弑葹?∶6。

2.5.6 洗脫體積 取上述已吸附飽和的HPD100樹脂5.00 g，濕法裝柱。8 BV蒸餾水除雜，流速2.5 BV/h，棄去，換40%乙醇洗脫，流速1 BV/h。每1 BV流出液收集1次，進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖7?？梢姡琒Ⅰ濃度峰值出現(xiàn)在3 BV，6 BV時已基本洗脫完全。故為節(jié)省洗脫溶劑及洗脫時間，僅收集前6 BV洗脫液即可。

2.5.7 洗脫流速 稱取“2.5.4”項下樹脂各5 g，濕法裝柱，40%乙醇洗脫，流速分別為1、2、4、6 BV/h，共洗脫6 BV，分別收集洗脫液，在上述色譜條件下測定，結(jié)果見圖8?？梢姡疵摿魉僭铰?，SⅠ的回收率越高，為兼顧回收率及時間效率，選擇洗脫流速為2～4 BV/h。

2.6 驗證試驗

按上述試驗確定的最佳工藝處理川芎提取物樣品，取按“2.2”項下方法制得的川芎醇提物稀釋液（原藥材含量為1 g/mL，SⅠ含量為1511.5 ?g/mL），總上樣量為50 mL，上HPD100大孔樹脂柱，樹脂總用量為150 g濕樹脂，靜置吸附2 h，水洗4 BV，收集洗脫液，減壓回收溶劑，得干浸膏。然后依次用10%、40%、70%、90%乙醇溶液各洗脫6 BV，分別收集洗脫液，減壓回收溶劑，得干浸膏。稱取上述各部位干浸膏適量，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成各含原藥材30 mg/mL的川芎供試品溶液。分別用菊形濾紙過濾，取續(xù)濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，測定含量。

結(jié)果在最佳工藝條件下，川芎中SⅠ得到有效富集。其中，川芎醇提物、水洗部位及10%、40%、70%、90%乙醇部位干浸膏中的SⅠ含量分別為0.6%、0.01%、0.02%、8.0%、0.9%、0.7%，說明上述洗脫條件合理可行，川芎提取物經(jīng)HPD100樹脂按上述最佳工藝條件處理后，苯肽類活性成分SⅠ得到了有效富集，富集后產(chǎn)物中SⅠ含量達(dá)到8.0%，是處理前的13.3倍，回收率為72%，且40%乙醇部位是富集SⅠ的目標(biāo)部位。故最佳工藝參數(shù)為：上樣濃度1 g原藥材/mL，上樣量3 mL/g濕樹脂，靜態(tài)吸附時間2 h，樹脂床徑高比1∶6，以水洗脫至洗脫液近無色后，用6 BV 40%乙醇（V/V）解吸附，洗脫流速2～4 BV/h，收集洗脫液，減壓回收溶劑，可得其干浸膏。

3 討論

大孔樹脂是選擇性有機(jī)高聚吸附劑，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用壽命長等優(yōu)點，近年來已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的純化?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道多為川芎酚酸類成分的研究[6-8]，而相關(guān)文獻(xiàn)顯示，苯酞類成分是川芎藥理藥效發(fā)揮的主要成分，SⅠ為既入血又入腦的成分[4-5]，應(yīng)用大孔樹脂對苯酞類成分純化工藝方面的研究較為少見。由于川芎所含化學(xué)成分復(fù)雜，除微量SⅠ外還含有大量生物堿等，導(dǎo)致川芎苯酞類成分難以分離純化。目前多采用反相高效液相色譜法對SⅠ進(jìn)行富集，但該方法操作復(fù)雜，成本高昂，不適用于大工業(yè)生產(chǎn)。而采用大孔樹脂富集SⅠ，方法簡便、安全、成本低廉，大幅提高了SⅠ的純度，為川芎苯酞類成分的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗依據(jù)。

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