• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新型反相/強(qiáng)陰離子交換混合模式材料用于磷酸化肽富集

    2017-02-06 15:52:43董立君張麗媛彭金詠董佩佩王麗莉
    分析化學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:富集

    董立君+張麗媛+彭金詠+董佩佩+王麗莉+張利娟+候曉林+趙艷艷

    摘 要 建立了新型反相/強(qiáng)陰離子交換混合模式材料(C 18/SAX)的磷酸化肽富集方法。考察了流動相組成(乙腈濃度、甲酸濃度、緩沖鹽濃度)對酪蛋白(α.Casein)酶解液中磷酸化肽分離選擇性的影響。實驗結(jié)果表明, 磷酸化肽在C 18/SAX上的保留行為受疏水和離子交換作用力的共同調(diào)控, 單磷酸化肽先于多磷酸化肽從材料上洗脫出來。隨著甲酸濃度增加, 磷酸化肽的保留減弱;隨著鹽濃度增加, 磷酸化肽保留變小。采用優(yōu)化后的流動相, 建立以20% ACN/20 mmol/L NH4Ac作為上樣溶液, 20% ACN/0.1% FA和50% ACN/100 mmol/L NH4Ac/2% FA分別作為洗脫液分段洗脫單、多磷酸化肽的方法。以α.Casein和人血清白蛋白(HSA)酶解液的混合溶液(1∶20, n/n)作為模擬樣品, 實現(xiàn)了單、多磷酸化肽的同時富集和分段洗脫, 分別檢測到4條單磷酸化肽和14條多磷酸化肽的信號。將本方法用于牛奶中的磷酸化肽檢測, 共鑒定到4條單磷酸化肽和8條多磷酸化肽信號。結(jié)果表明, 本富集方法選擇性高, 有良好的應(yīng)用前景。

    關(guān)鍵詞 磷酸化肽; 反相/強(qiáng)陰離子交換材料; 富集

    1 引 言

    磷酸化修飾是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。蛋白質(zhì)的磷酸化能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要的生命進(jìn)程[1], 具有重要的生物學(xué)意義。然而, 在通常的質(zhì)譜分析中, 磷酸化肽的信號會被其它高豐度的非磷酸化肽所抑制, 導(dǎo)致磷酸化肽難以分離鑒定[2,3]。因此有必要選擇性地富集磷酸化肽[4]。目前, 富集磷酸化肽的材料主要有固定金屬螯合色譜(IMAC)材料[5~7]、氧化鈦(TiO2)[8~10]、離子交換色譜(IXC)材料[11]、親水作用色譜材料[12]等。強(qiáng)陰離子交換色譜(SAX)在磷酸化肽選擇性富集中效果顯著。然而, SAX在富集磷酸化肽時, 帶有相同電荷的肽會被同時洗脫;另外, 單磷酸化肽信號會抑制多磷酸化肽的信號。因此, 發(fā)展能兼顧單、多磷酸化肽選擇性富集的材料非常重要。

    反相/強(qiáng)陰離子交換材料(C 18/SAX)是一種能夠同時提供疏水和強(qiáng)陰離子交換作用的新型色譜材料, 采用極性共聚的合成方法將十八烷基鍵合相和季銨堿按照一定可調(diào)控比例鍵合到硅膠表面[13]。研究表明, 此材料對于極性不強(qiáng)的陰離子小分子(例如馬兜鈴酸)具有較強(qiáng)的保留[13], 但尚未有用于磷酸化肽的選擇性富集的報道。就結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而言, 磷酸化肽在一定pH條件下也以陰離子形式存在, 但其分子量相對較大, 在C 18/SAX上的保留機(jī)制應(yīng)該與小分子有一定差異, 因此有必要考察C 18/SAX對磷酸化肽的富集效果以及保留機(jī)制。

    本研究以標(biāo)準(zhǔn)蛋白α.Casein酶解物作為模擬樣品, 考察不同流動相條件(乙腈含量、甲酸濃度、緩沖鹽濃度)對磷酸化肽在C 18/SAX材料上的富集選擇性差異, 優(yōu)化了分離富集條件。在此基礎(chǔ)上, 對牛奶中的磷酸化肽進(jìn)行富集和分析, 效果良好。本方法有望用于實際樣品中磷酸化肽選擇性富集。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    肽的分析在Nano.LC.ESI.Q.TOF/MS儀器(英國Waters MS Technologies公司)上進(jìn)行, 離子模式為正離子模式, 噴霧電壓為2.0 kV。一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集范圍為m/z 500~2000, 二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集范圍為m/z 100~2000, 二級質(zhì)譜的碰撞能為20~40 eV。

    乙腈(ACN, 質(zhì)譜純, 德國Merck公司); 甲酸(FA, 色譜純, 美國Acros公司); 醋酸銨(NH4Ac, 美國Tedia公司); NH4HCO 3、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA), α.酪蛋白(Casein)、人血清白蛋白(HSA)、尿素(美國Sigma.Aldrich公司); 質(zhì)譜序列級胰蛋白酶(美國Promega公司); GELoader小柱(德國Eppendorf 公司)。C 18/SAX材料為實驗室自制[12];ZipTip C 18色譜柱(美國Millipore公司)。實驗用水為超純水(美國Millipore純水系統(tǒng));脫脂牛奶購自本地超市。

    2.2 蛋白質(zhì)的酶解

    α.Casein的酶解:1.0 mg α.Casein溶于1 mL NH4HCO 3 (50 mmol/L, pH 8.0)溶液中, 按照α.Casein/胰蛋白酶=40∶1(m/m)的比例加入胰蛋白酶, 37℃下酶解反應(yīng)18 h后, 加入0.5%甲酸終止反應(yīng)。酶解液最終蛋白濃度為1 mg/mL, 在

    20℃保存, 待測。

    HSA的酶解:將1.0 mg HSA溶于100 μL含8 mol/L 尿素的50 mmol/L NH4HCO 3, 56℃變性10 min。 加入20 μL 100 mmol/L DTT, 于56℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后, 加入20 μL 200 mmol/L IAA, 在暗處反應(yīng) 30 min。用 50 mmol/L NH4HCO 3稀釋至1 mL后, 按照蛋白質(zhì)/酶=50∶1(m/m)的比例加入胰蛋白質(zhì)酶, 37℃酶解12 h后, 加入5 μL甲酸中止反應(yīng), 酶解產(chǎn)物于

    20℃保存。

    脫脂牛奶的酶解: 用Bradford assay法測得脫脂牛奶中蛋白質(zhì)濃度為20 mg/mL, 用50 mmol/L NH4HCO 3稀釋至2 mg/mL, 取100 μL上述溶液按照HSA的酶解方法進(jìn)行處理, 但是酶解時間延長為16 h。

    2.3 磷酸化肽富集條件

    按照文獻(xiàn)[14]的方法制備GELoader小柱, 每個GELoader小柱裝填有1.5 mg C 18/SAX材料, 用于富集磷酸化肽。條件優(yōu)化實驗:α.Casein酶解液86 pmol上樣后, 分別用0.1% FA 溶液, 10%、20%、30%和40% ACN/0.1% FA 溶液各20 μL進(jìn)行洗脫, 考察流動相中乙腈濃度對富集選擇性的影響;α.Casein 酶解液上樣后, 依次用50% ACN/0.1% FA (pH 4)、0.5% FA (pH 3)、1% FA (pH 2)、2% FA(pH 1)溶液各20 μL進(jìn)行洗脫, 考察流動相甲酸濃度對富集選擇性的影響;α.Casein酶解液上樣后, 依次用50% ACN/10 mmol/L NH4Ac、20 mmol/L NH4Ac、50 mmol/L NH4Ac、100 mmol/L NH4Ac、200 mmol/L NH4Ac溶液20 μL進(jìn)行洗脫, 考察流動相中醋酸銨濃度對富集選擇性的影響。優(yōu)化實驗中各個洗脫液, 離心、濃縮干燥后, 用50% ACN/0.1% FA溶液(10 μL)復(fù)溶, ZipTip C 18脫鹽, 取5 μL進(jìn)行質(zhì)譜分析。

    在優(yōu)化的條件下, 進(jìn)行α.Casein/HSA=1∶20 (n/n)模擬樣品以及脫脂牛奶的磷酸化肽富集。將α.Casein與HSA酶解液以摩爾比為1∶20進(jìn)行混合, 上樣量按混合液中α.Casein為86 pmol計。取6 μL牛奶酶解液與20 μL上樣溶液混合作為脫脂牛奶的樣品溶液。富集后, 收集洗脫液, 離心、濃縮干燥后, 用50% ACN/0.1% FA(10 μL)復(fù)溶, ZipTip C 18脫鹽, 取5 μL進(jìn)行質(zhì)譜分析。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 乙腈濃度對磷酸化肽富集選擇性的影響

    考察了流動相中乙腈濃度對磷酸化肽富集選擇性的影響。實驗結(jié)果如圖1所示, 10% ACN/0.1%FA洗脫餾分中能夠檢測出5條磷酸化肽的信號, 分別是m/z 770.29 (2+), m/z 797.83 (2+), m/z 831.37 (2+), m/z 907.26 (3+), m/z 912.53 (3+), 參考文獻(xiàn)[8,14]并根據(jù)二級質(zhì)譜結(jié)果確定磷酸化肽的結(jié)構(gòu)信息(表1)。在20% ACN/0.1%FA洗脫餾分中檢測出9條磷酸化肽信號, 分別為m/z 733.80(2+), m/z 770.29(2+), m/z 797.84 (2+), m/z 830.88 (2+), m/z 889.44 (3+), m/z 971.47 (2+), m/z 976.45 (2+), m/z 979.55 (3+), m/z 991.53 (2+), 均帶有1~3個PO3

    4。在高有機(jī)相濃度40% ACN/0.1%FA洗脫液中檢測出5條磷酸化肽信號, 即m/z 706.69 (2+), m/z 865.32 (3+), m/z 924.32 (2+), m/z 979.36 (3+), m/z 1339.48 (2+), 均帶有2~5個PO3

    4。值得注意的是, 通常情況下, 由于多磷酸化肽極性較強(qiáng), 其在反相色譜材料上保留弱于單磷酸化肽。而在本研究中, 多磷酸化肽保留強(qiáng)于單磷酸化肽。這可能是磷酸化肽在C 18/SAX材料上的保留是疏水作用和離子交換作用的協(xié)同結(jié)果。20% ACN/0.1% FA洗脫餾分中少有多磷酸化肽信號出現(xiàn), 這可能是因為溶液pH=2.5~3.0, 材料表面基團(tuán)帶有正電, 多磷酸化肽pKa值小于流動相pH值, 帶有負(fù)電, 此時磷酸化肽的保留主要取決于陰離子交換作用, 而單磷酸化肽pKa值大于流動相pH值, 不帶電性或帶正電, 此時保留主要取決于疏水作用。上述結(jié)果表明, 通過改變流動相中乙腈濃度能夠?qū)崿F(xiàn)單、多磷酸化肽順序洗脫, 磷酸化肽的保留受到疏水和離子交換作用力的雙重調(diào)控。然而僅通過改變流動相中乙腈濃度進(jìn)行選擇性富集, 存在非磷酸化肽的信號干擾較強(qiáng)、磷酸化肽富集選擇性不高的問題。

    3.2 甲酸濃度對磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影響

    考察了流動相中甲酸濃度(pH值)對磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影響(圖2)。在保持乙腈濃度(50% ACN)不變的條件下(此濃度能夠洗脫出大多數(shù)肽), 考察了流動相中甲酸濃度(0.1%, 0.5%, 1%, 2% FA)對磷酸化肽在C 18/SAX 上保留的影響。當(dāng)甲酸的濃度為0.1% (pH 4)時, 以單磷酸化肽為主的信號出現(xiàn), 如m/z 733.79 (2+), m/z 770.30 (2+), m/z 797.83 (2+), m/z 830.43 (2+), m/z 924.34 (2+), m/z 964.31 (2+), m/z 976.43 (2+), m/z 1029.45 (2+)。當(dāng)甲酸濃度增加到0.5% (pH 3)時, 多磷酸化肽得以洗脫, 如m/z 1339.98 (2+), m/z 1002.26 (2+), m/z 983.29 (2+), m/z 964.31 (2+), m/z 893.65 (3+)。當(dāng)甲酸濃度增加到2% (pH=1)時, 仍然有多磷酸化肽信號出現(xiàn), 如m/z 964.36 (2+), m/z 1312.43 (2+), 但信號強(qiáng)度很低。上述結(jié)果表明, 采用C 18/SAX富集α.Casein中的磷酸化肽, 隨著溶液中甲酸的濃度逐漸提高(pH值逐漸降低), 磷酸化肽保留減弱;上樣和洗脫溶液中的甲酸濃度分別為0.1%和2%為宜。通過調(diào)節(jié)流動相pH值能夠?qū)崿F(xiàn)單、多磷酸化肽的分段洗脫, 是因為單磷酸化肽的pKa值大于多磷酸化肽的pKa值;當(dāng)流動相pH值小于磷酸化肽pKa時, 磷酸化肽不電離, 與SAX材料的離子交換作用減弱, 從而得以洗脫。

    3.3 鹽濃度對磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影響

    保持流動相中乙腈濃度(50% ACN)不變, 考察了流動相中醋酸銨濃度對磷酸化肽在C 18/SAX上保留的影響(圖3)。采用50% ACN/10 mmol/L NH4Ac為流動相時, 洗脫液中主要出現(xiàn)帶1~2個PO3

    4的磷酸化肽, 如m/z 651.63 (3+), m/z 733.78 (2+), m/z 797.82 (2+), m/z 830.87 (2+), m/z 841.86 (2+), m/z 865.30 (3+), m/z 971.53 (2+), m/z 976.94 (2+)。 隨著流動相中NH4Ac增加到50 mmol/L, 這些磷酸化肽仍然能夠洗脫出來。而當(dāng)流動相中鹽濃度提高到100 mmol/L NH4Ac時, 帶有3~5個PO3

    4的多磷酸化肽得以洗脫, 如m/z 893.65(3+), m/z 916.90 (2+), m/z 924.3294 (2+), m/z 964.31 (2+), m/z 983.28 (2+), m/z 1002.26 (2+), m/z 1339.95 (2+), m/z 1373.91 (2+)。這是因為在離子交換作用下,多磷酸化肽比單磷酸化肽在C 18/SAX上的保留更強(qiáng), 提高流動相鹽濃度能夠減弱PO3

    4與C 18/SAX材料的離子交換作用。上述結(jié)果表明, 鹽濃度的逐漸增高能夠?qū)崿F(xiàn)單、多磷酸化肽分段洗脫, 溶液中鹽濃度提高到100 mmol/L NH4Ac時,大多數(shù)多磷酸化肽能夠被洗脫。

    3.4 C 18/SAX材料的富集選擇性

    將α.Casein酶解液.HSA酶解液(1∶20, n/n)配制的混合樣品溶液作為模擬樣品, 以20% ACN/0.1% FA和50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac分別作為兩步洗脫條件, 分段洗脫單磷酸化肽和多磷酸化肽, 結(jié)果如圖4所示, 單、多磷酸化肽得到分段洗脫, 其中單磷酸化肽主要出現(xiàn)在20% ACN/0.1% FA餾分中, 共檢測到4條單磷酸化肽信號, 如m/z 797.86 (2+), m/z 830.89 (2+), m/z 924.69 (2+), m/z 976.99 (2+);而多磷酸化肽主要出現(xiàn)在50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac餾分中, 共檢測到14條多磷酸化肽信號。與文獻(xiàn)[14]的結(jié)果相比, 大量非磷酸化肽去除, 磷酸化肽信號強(qiáng)度顯著提高;在優(yōu)化條件下, 單、多磷酸化肽在C 18/SAX材料上能夠被同時富集并分段洗脫, 此結(jié)果未見文獻(xiàn)報道。上述結(jié)果表明, 采用優(yōu)化后的分離條件, 對模擬樣品的磷酸化肽富集效果較好。

    3.5 牛奶中磷酸化肽的富集

    將牛奶樣品進(jìn)行酶解, 然后采用C 18/SAX進(jìn)行富集和洗脫, 并用納升電噴霧.四級桿.飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析。從圖5可見, 20% ACN/0.1% FA餾分中出現(xiàn)了4條單磷酸化肽信號, 包括m/z 733.81(2+), m/z 797.86 (2+), m/z 831.39 (2+), m/z 976.98 (2+)。50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac餾分中出現(xiàn)了8條多磷酸化肽信號, 包括m/z 915.96 (3+), m/z 928.95 (3+), m/z 964.34 (2+), m/z 983.33 (2+), m/z 1002.30 (2+), m/z 1333.47 (2+), m/z 1339.51 (2+), m/z 1373.43 (2+)。從牛奶中鑒定出的多磷酸化肽數(shù)目高于文獻(xiàn)[5]的結(jié)果, 表明所建立方法具有較強(qiáng)的實際應(yīng)用價值。

    4 結(jié) 論

    本研究將新型分離材料C 18/SAX用于磷酸化肽的選擇性富集, 以α.Casein酶解液作為分析樣品, 系統(tǒng)考察流動相組成條件對富集選擇性的影響。結(jié)果表明, 磷酸化肽在C 18/SAX上的保留受疏水作用和離子交換作用的共同影響。在此基礎(chǔ)上,建立了單、多磷酸化肽的同時富集和分段洗脫方法, 其中20% ACN/0.1% FA洗脫餾分中主要為單磷酸化肽, 50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac洗脫餾分主要為多磷酸化肽。采用本方法可從α.Casein酶解液和HSA混合液(1∶20, n/n)中分離檢測到4條單磷酸化肽信號和14條多磷酸化肽的信號, 從牛奶中共檢測到4條單磷酸化肽和8條多磷酸化肽信號。本研究結(jié)果表明, 本方法具有較強(qiáng)的實際應(yīng)用價值 。

    Reference

    1 Benjamin R, Simone L. Expert Rev. Proteomic., 2014, 11(3): 259-267

    2 Li X S, Yuan B F, Feng Y Q. TRAC.Trend Anal. Chem., 2016, 78: 70-83

    3 Kailasa S, Wu H F. Microchim. Acta, 2014, 181(9.10): 853-864

    4 LI Juan, JIANG Wu.Hui, XU Xiao.Ying. Chem. J. Chinese Universities, 2014, 35(10): 2073-2077

    李 娟, 姜武輝, 徐曉穎. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報, 2014, 35(10): 2073-2077

    5 Zhang L Y, Zhao Q, Liang Z, Yang K G, Sun L L, Zhang L H, Zhang Y K. Chem. Commun. 2012, 48(50): 6274-6276

    6 Susy P, Anna Laura C, Chiara C, Francesca F, Roberto S, Salvatore V, Aldo L. Anal. Chim. Acta, 2016, 909: 67-74

    7 ZHANG Yu, QIN Hong.Qiang, WU Ren.An, ZOU Han.Fa. Chinese Journal of Chromatography, 2010, 28(2): 123-127

    張 宇, 秦洪強(qiáng), 吳仁安, 鄒漢法. 色譜, 2010, 28(2): 123-127

    8 ZOU Li.Juan, LI Juan, WAN Hui.Hui, LI Xiu.Ling, LIANG Xin.Miao. Chinese J. Anal. Chem. 2011, 39(12): 1781-1786

    鄒麗娟, 李 娟, 萬慧慧, 李秀玲, 梁鑫淼. 分析化學(xué), 2011, 39(12): 1781-1786

    9 Deng J R, Iulia M L. J Am. Soc. Mass. Spectrom., 2016, 27(4): 686-698

    10 SUN Li, ZHAO Hai.Feng, GUO Hong.Hua, YANG Guang.Yuan, HE Cheng.Yan, SHI Qing.Hong, WEN Xue, WANG Xiao.Ting, ZHAO Li.Chun. Chinese J. Anal. Chem. 2012, 40(10): 1500-1506

    孫 莉, 趙海豐, 郭宏華, 揚(yáng)光遠(yuǎn), 何成彥, 師慶紅, 文 雪, 王小婷, 趙麗純. 分析化學(xué), 2012, 40(10): 1500-1506

    11 Dai J, Wang L S, Wu Y B, Sheng Q H, Wu J R, Shieh C H, Zeng R. J. Proteome Res., 2009, 8: 133-141

    12 McNulty D E, Annan R S. Mol. Cell. Proteomics, 2008, 7: 971-980

    13 Wei J, Guo Z M, Zhang P J, Zhang F F, Yang B C, Liang X M. J. Chromatogr. A, 2012, 1246, 129-136

    14 Zhao Y Y, Li X L,Yan J Y, Guo Z M, Liang X M. Anal. Methods, 2012, 4: 1244-1251

    Abstract Selective enrichment before mass spectrometric analysis is very important for detection and identification of phosphopeptides. In this work, a novel method based on the reversed phase/strong anion exchange material (C 18/SAX) was established and applied in phosphopeptide enrichment. The influence of mobile phase composition (acetonitrile content, formic acid content, salt concentration) on the phosphopeptide enrichment selectivity was carried out by taking α.casein digests as model sample. It was found that the retention of phosphopeptides on C 18/SAX was ascribed to both the hydrophobic and strong anion exchange interactions. Mono.phosphopeptides were eluted earlier than multi.phosphopeptides. The retention of phosphopeptides on C 18/SAX was reduced along with the increase of formic acid content and the increase of salt content. After optimization, an enrichment method was developed with 20% ACN/20 mmol/L NH4Ac as loading buffer, 20% ACN/0.1% FA and 50% ACN/100 mmol/L NH4Ac/2% FA as two steps elution phase to fractionate mono.and multi.phosphopeptides. By using the developed method, 4 mono.phosphopeptides and 14 multi.phosphopeptides were isolated from the mixture of α.Casein and HSA at a molar ratio of 1∶20. The application of the developed method to bovine milk digests resulted in the separation and identification of 4 mono.phosphopeptide and 8 multi.phosphopeptides. These results indicated that the methods had great potential for practical application.

    Keywords Phosphopeptides; Reversed phase/strong anion exchange material; Enrichment

    猜你喜歡
    富集
    高海拔地區(qū)土壤—黨參系統(tǒng)微量元素富集特征
    銦提取與富集的技術(shù)現(xiàn)狀
    價值工程(2017年4期)2017-02-16 22:31:29
    蕹菜對鈾的富集特征及其形態(tài)分析
    黑木耳對4種重金屬的吸收富集
    云南地區(qū)不同園林植物對土壤重金屬的吸收富集特征
    樂清灣圍塘中重金屬在貝類中的富集分布
    生物成礦作用研究
    不同園林綠化植物對土壤重金屬的吸收富集研究
    葛根素及黃豆苷元分離純化工藝研究
    磁分散固相微萃取
    国内精品美女久久久久久| 中国美白少妇内射xxxbb| 99久久精品一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 中文字幕久久专区| 免费观看无遮挡的男女| av一本久久久久| 中国国产av一级| 婷婷六月久久综合丁香| av播播在线观看一区| 精品久久久久久久久亚洲| av国产免费在线观看| 热99在线观看视频| av免费在线看不卡| 99久久精品热视频| 黑人高潮一二区| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品久久久久久久末码| 水蜜桃什么品种好| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲国产最新在线播放| 国产亚洲91精品色在线| 精品国产露脸久久av麻豆 | 伦理电影大哥的女人| 最近中文字幕2019免费版| 日韩人妻高清精品专区| 伦理电影大哥的女人| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品一区二区性色av| 2022亚洲国产成人精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 激情五月婷婷亚洲| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩欧美 国产精品| 日韩三级伦理在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 色5月婷婷丁香| 日本与韩国留学比较| 夫妻午夜视频| 欧美激情在线99| 欧美bdsm另类| 精品久久久噜噜| 欧美高清性xxxxhd video| 特大巨黑吊av在线直播| 51国产日韩欧美| 午夜老司机福利剧场| 简卡轻食公司| 亚洲av不卡在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日韩电影二区| 亚洲欧美日韩东京热| 街头女战士在线观看网站| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 亚洲精品乱久久久久久| 视频区图区小说| 色吧在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 韩国高清视频一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美精品高潮呻吟av久久| 赤兔流量卡办理| 岛国毛片在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品二区激情视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 老司机影院成人| 婷婷色av中文字幕| 男人添女人高潮全过程视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产色婷婷99| 一区福利在线观看| 国产精品国产av在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久亚洲精品成人影院| 视频在线观看一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 久久国内精品自在自线图片| 91成人精品电影| 捣出白浆h1v1| 老司机影院毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费观看在线日韩| 五月开心婷婷网| 久久久亚洲精品成人影院| 日本wwww免费看| 伦理电影免费视频| 一级毛片我不卡| 最近手机中文字幕大全| av女优亚洲男人天堂| 午夜免费鲁丝| 青青草视频在线视频观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 桃花免费在线播放| 男女下面插进去视频免费观看| 男人添女人高潮全过程视频| 蜜桃在线观看..| 大香蕉久久网| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 女性被躁到高潮视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | av福利片在线| 成人黄色视频免费在线看| 观看av在线不卡| 一级片'在线观看视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品久久久久久精品古装| 免费看不卡的av| 中文欧美无线码| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲av国产av综合av卡| 色播在线永久视频| 日韩视频在线欧美| 90打野战视频偷拍视频| 男女免费视频国产| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产一区二区三区av在线| 久久99热这里只频精品6学生| 韩国精品一区二区三区| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品久久久久久av不卡| 秋霞伦理黄片| 一区二区三区精品91| 亚洲色图综合在线观看| 美女午夜性视频免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品少妇久久久久久888优播| 久久精品国产亚洲av天美| 久久人妻熟女aⅴ| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 男女免费视频国产| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日日啪夜夜爽| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲av中文av极速乱| 69精品国产乱码久久久| 亚洲国产av影院在线观看| av天堂久久9| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲视频免费观看视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美日韩精品网址| 人妻 亚洲 视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久人妻熟女aⅴ| 老鸭窝网址在线观看| 大香蕉久久成人网| 黄片无遮挡物在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 97精品久久久久久久久久精品| 不卡视频在线观看欧美| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 99热网站在线观看| 一区二区三区激情视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品一区二区在线不卡| 丝瓜视频免费看黄片| 满18在线观看网站| 国产av国产精品国产| 亚洲欧美色中文字幕在线| 香蕉精品网在线| 久久女婷五月综合色啪小说| 中国国产av一级| 伊人久久国产一区二区| 国产精品成人在线| 国产精品熟女久久久久浪| 尾随美女入室| 国产男人的电影天堂91| 人妻人人澡人人爽人人| 老汉色∧v一级毛片| 美女中出高潮动态图| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 中文字幕色久视频| 三级国产精品片| 午夜福利在线免费观看网站| 青春草亚洲视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费人妻精品一区二区三区视频| 超碰成人久久| 亚洲经典国产精华液单| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美精品一区二区免费开放| 美女国产高潮福利片在线看| 90打野战视频偷拍视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜福利视频在线观看免费| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产高清不卡午夜福利| 久久久久人妻精品一区果冻| av在线app专区| av在线观看视频网站免费| 99九九在线精品视频| 赤兔流量卡办理| 久久这里只有精品19| 曰老女人黄片| 色网站视频免费| 在线观看国产h片| 一区二区三区激情视频| 国产精品.久久久| 国产片内射在线| 男女午夜视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产乱来视频区| 欧美日韩综合久久久久久| 伦理电影免费视频| 美女中出高潮动态图| 99热国产这里只有精品6| 国产成人aa在线观看| 色94色欧美一区二区| av一本久久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 免费观看a级毛片全部| 老司机亚洲免费影院| 亚洲精品美女久久av网站| 色哟哟·www| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| www日本在线高清视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲内射少妇av| 国产在线一区二区三区精| 成人手机av| 免费日韩欧美在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品自拍成人| 9热在线视频观看99| 国产精品一区二区在线观看99| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久久精品免费免费高清| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久人人爽人人片av| 精品国产乱码久久久久久男人| 校园人妻丝袜中文字幕| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 日韩一区二区三区影片| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 日韩电影二区| 精品久久蜜臀av无| 涩涩av久久男人的天堂| 少妇人妻 视频| 热re99久久精品国产66热6| 欧美精品一区二区大全| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品一区二区在线观看99| 天堂8中文在线网| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 色吧在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩制服骚丝袜av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品第二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产免费视频播放在线视频| 九草在线视频观看| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人精品一,二区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 丝袜脚勾引网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜91福利影院| 久久久久国产网址| 看免费av毛片| 欧美日本中文国产一区发布| 成人漫画全彩无遮挡| 国产淫语在线视频| 大片电影免费在线观看免费| 美女中出高潮动态图| 成人国语在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 国产国语露脸激情在线看| 蜜桃国产av成人99| 成人黄色视频免费在线看| 国产日韩欧美视频二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久久久精品性色| 亚洲欧美精品自产自拍| 99久国产av精品国产电影| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日本爱情动作片www.在线观看| 熟女av电影| 男女国产视频网站| 18+在线观看网站| 国产男女内射视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 大码成人一级视频| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩av免费高清视频| 老女人水多毛片| 精品一区二区免费观看| 久久精品国产a三级三级三级| 69精品国产乱码久久久| 中文字幕制服av| 两性夫妻黄色片| 最近的中文字幕免费完整| 交换朋友夫妻互换小说| 国产黄色视频一区二区在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久久久网色| 成人毛片60女人毛片免费| 久久国内精品自在自线图片| 在线看a的网站| 最近手机中文字幕大全| 欧美xxⅹ黑人| 曰老女人黄片| 男女边摸边吃奶| 亚洲国产色片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 男女边摸边吃奶| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久精品夜色国产| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲综合精品二区| 午夜福利在线免费观看网站| 99久久综合免费| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲欧美一区二区三区久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品熟女久久久久浪| 免费观看av网站的网址| 五月天丁香电影| 国产成人精品无人区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久99蜜桃精品久久| 国产乱来视频区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 麻豆乱淫一区二区| 青草久久国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 一区二区av电影网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品人妻久久久影院| av在线老鸭窝| 欧美精品国产亚洲| 赤兔流量卡办理| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品一二三| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品av麻豆狂野| 伦理电影大哥的女人| 毛片一级片免费看久久久久| 国产av码专区亚洲av| 美国免费a级毛片| 看免费成人av毛片| 日韩av免费高清视频| 免费观看无遮挡的男女| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 91精品三级在线观看| 亚洲av.av天堂| 久久久久视频综合| av电影中文网址| 深夜精品福利| www.精华液| 999久久久国产精品视频| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲第一av免费看| 男人操女人黄网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲成人av在线免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩电影二区| 久久久久久伊人网av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜av观看不卡| 久热久热在线精品观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 午夜免费鲁丝| 亚洲av电影在线进入| 午夜福利影视在线免费观看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久久久国产电影| 亚洲av.av天堂| 日本欧美视频一区| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲精品美女久久av网站| 热re99久久国产66热| 久久久久久久久久久免费av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 天堂俺去俺来也www色官网| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久久网色| 在线观看免费日韩欧美大片| 999久久久国产精品视频| 日日撸夜夜添| 日韩电影二区| 久久综合国产亚洲精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 亚洲美女视频黄频| 美女午夜性视频免费| 男女高潮啪啪啪动态图| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色播在线永久视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久久久精品性色| 日本av免费视频播放| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产黄色免费在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 天堂8中文在线网| av在线app专区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品国产国语对白av| 亚洲人成网站在线观看播放| av免费观看日本| 久久国内精品自在自线图片| 国产在线免费精品| 黑人猛操日本美女一级片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久久久伊人网av| 18禁观看日本| 国产精品一国产av| 一级黄片播放器| 午夜福利网站1000一区二区三区| a级毛片黄视频| 亚洲精品,欧美精品| 自线自在国产av| 777米奇影视久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品第二区| 女性生殖器流出的白浆| 免费观看性生交大片5| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久99蜜桃精品久久| 久久精品国产a三级三级三级| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 熟女av电影| 丝袜美足系列| 天天操日日干夜夜撸| 婷婷色av中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品三级大全| 秋霞伦理黄片| 久久这里只有精品19| 久久久国产一区二区| 韩国精品一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品久久久久久久久免| 午夜日本视频在线| 97人妻天天添夜夜摸| 夫妻性生交免费视频一级片| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美人与善性xxx| 亚洲国产av新网站| 三上悠亚av全集在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品国产国语对白av| 亚洲经典国产精华液单| 精品少妇久久久久久888优播| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 18在线观看网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产成人精品无人区| 久久久久网色| 天天操日日干夜夜撸| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 成年人午夜在线观看视频| 中文天堂在线官网| 亚洲一区中文字幕在线| 电影成人av| 亚洲精品第二区| 国产熟女欧美一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 只有这里有精品99| 一区二区三区激情视频| 欧美精品一区二区免费开放| 在线观看www视频免费| 男女啪啪激烈高潮av片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 26uuu在线亚洲综合色| www.自偷自拍.com| 精品国产一区二区久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品久久蜜臀av无| 两个人免费观看高清视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 考比视频在线观看| 观看美女的网站| 岛国毛片在线播放| 久久精品国产综合久久久| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲av中文av极速乱| 性色av一级| 欧美精品一区二区免费开放| 一级黄片播放器| 在线观看免费日韩欧美大片| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品成人在线| 亚洲伊人色综图| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 男女下面插进去视频免费观看| 五月天丁香电影| 婷婷色麻豆天堂久久| 麻豆乱淫一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日韩一区二区三区影片| 制服诱惑二区| 亚洲成人一二三区av| 一区在线观看完整版| 丁香六月天网| 国产亚洲最大av| 青春草视频在线免费观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产淫语在线视频| 久久久久人妻精品一区果冻| videos熟女内射| 各种免费的搞黄视频| 午夜影院在线不卡| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲,欧美精品.| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩欧美精品免费久久| 在线天堂中文资源库| 91精品国产国语对白视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久影院123| 亚洲,欧美精品.| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 极品人妻少妇av视频| 久热久热在线精品观看| 人妻一区二区av| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡 | 啦啦啦啦在线视频资源| 免费观看a级毛片全部| 青春草视频在线免费观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人欧美| 国产激情久久老熟女| 欧美日本中文国产一区发布| 9热在线视频观看99| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲,欧美精品.| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品国产av在线观看| 婷婷色综合www| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产av一区二区精品久久| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品无大码| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲国产欧美网| 香蕉国产在线看| 精品人妻在线不人妻| 亚洲综合精品二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 少妇被粗大的猛进出69影院| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 最黄视频免费看| 亚洲人成网站在线观看播放| 春色校园在线视频观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品嫩草影院av在线观看|