葛根素及黃豆苷元分離純化工藝研究

楊紫薇+王舒雅+高俊+馮遲+陳怡露+雍曉雨+周俊+劉曉寧+謝欣欣+鄭濤

摘要： 采用HPD800大孔吸附樹(shù)脂富集葛根中的葛根素及黃豆苷元，并通過(guò)溶劑萃取以及重結(jié)晶技術(shù)分離純化葛根素及黃豆苷元。試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂富集后，葛根素的純度從8.62%增加到35.26%、黃豆苷元的純度從0.276%增加到10.17%；以水飽和的正丁醇作為葛根素萃取溶劑，萃取2次萃取率可達(dá)92.32%；選取乙酸乙酯作為黃豆苷元的萃取溶劑，萃取1次萃取率達(dá)到94.75%；選取90%乙酸作為葛根素結(jié)晶的溶劑，經(jīng)過(guò)1次結(jié)晶，葛根素的純度可達(dá)91.32%，收率為12.5%，黃豆苷元的純度可達(dá)93.81%，收率為15.77%。

關(guān)鍵詞： 葛根素；黃豆苷元；大孔樹(shù)脂；富集；分離；純化

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0297-03

葛根是豆科植物葛的根，是一種在我國(guó)常見(jiàn)的中藥材，素有“亞洲人參”的美譽(yù)，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的功效[1]。我國(guó)的葛根種類有10多種，較為常見(jiàn)的有粉葛和野葛2種，其中粉葛的淀粉含量較高，常用于淀粉食品的加工；野葛主要以野生為主，異黃酮含量較高，主要用于提取有效藥用成分[2-3]。葛根中的有效藥用成分是異黃酮類物質(zhì)，主要包括葛根素和黃豆苷元[4]。葛根素具有降低血糖、改善心腦循環(huán)、抗氧化、延緩動(dòng)脈硬化、延緩衰老、抗腫瘤等作用，國(guó)內(nèi)臨床上主要用于治療心絞痛、高血壓等心腦血管疾病，有資料表明葛根素對(duì)于心腦血管疾病的治愈率可以達(dá)到 97.6%[5-7]。黃豆苷元?jiǎng)t對(duì)于治療更年期婦女綜合征、乳腺癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松有顯著的療效[8-9]。近年來(lái)中國(guó)的老齡化趨勢(shì)明顯，患心腦血管的患者增多，對(duì)葛根異黃酮類藥物原料的需求越來(lái)越大。因此，設(shè)計(jì)高效分離純化葛根素和黃豆苷元的工藝方法成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。

大孔樹(shù)脂是一類以吸附作用對(duì)有機(jī)物進(jìn)行濃縮、分離作用的高分子聚合物[10-11]。近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道采用大孔樹(shù)脂分離純化葛根素，但是葛根素的純度均不高。劉慧敏等用HPD-200A型大孔樹(shù)脂純化葛根素，得到的粗提取物的純度可以達(dá)到27.23%[12]。而且，近年來(lái)文獻(xiàn)中從葛根素異黃酮中分離純化葛根素的很多，忽略了黃豆苷元的價(jià)值。本試驗(yàn)采用HPD800大孔樹(shù)脂富集葛根素和黃豆苷元，并采用溶劑萃取法，研究萃取次數(shù)對(duì)于萃取率的影響，再通過(guò)合適的溶劑結(jié)晶得到高純度葛根素和黃豆苷元。

1 材料與方法

1.1 材料

葛根[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]購(gòu)自江蘇句容藥材市場(chǎng)，陰干，粉碎。對(duì)照品葛根素（純度≥99%）、黃豆苷元（純度≥98%），Sigma公司產(chǎn)品；測(cè)定含量用乙腈，J&K Chemical Ltd產(chǎn)品；乙酸，Sigma公司產(chǎn)品，色譜純；去離子水自制；大孔吸附樹(shù)脂HPD800，鄭州勤實(shí)科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

Agilent 1260LC高效液相色譜儀配G1311-B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311-B四元泵、G1316-A柱溫箱、G1314-F紫外檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；Milli-Q純水儀，美國(guó)Millipore公司；ZWY-110X50恒溫水浴振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；玻璃層析柱（1.5 cm×30 cm），天津玻璃儀器廠；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 分析方法

采用高效液相色譜法檢測(cè)樣品液中葛根素及黃豆苷元含量[13]。采用以下色譜條件： Agilent ODS-C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：A相為含0.1%乙酸的乙腈溶液，B相為含0.1%乙酸的水溶液（流動(dòng)相配比見(jiàn)表1）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量5 μL。

1.4 葛根素及黃豆苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取干燥至恒質(zhì)量的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg、黃豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品3.00 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（葛根素：500 μg/mL，黃豆苷元：300 μg/mL）。用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制成以下濃度：葛根素：250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL；黃豆苷元：150、75、37.5、18.75、9.375 μg/mL。分別用0.22 μm濾膜過(guò)濾后按“1.3”節(jié)中的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣3次進(jìn)行檢測(cè)，得到液相結(jié)果后，以葛根素和黃豆苷元濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葛根素和黃豆苷元回歸方程：y=23 932x-22.81（r2=0.999 6）和y=33 927x-50.60（r2=0.999 6）。葛根素和黃豆苷元的濃度分別在10～300 μg/mL和5～250 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)葛根素和黃豆苷元的濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

1.5 葛根提取液的制備

準(zhǔn)確稱取5 g葛根粉末（過(guò)60～80目篩），按照葛根粉末 ∶ 乙醇=1 g ∶ 8 mL加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡2 h，再以90℃水浴回流提取2 h后趁熱濾去葛根渣，并收集濾液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液蒸成浸膏，并將浸膏烘干得葛根黃酮粉末，用去離子水配置成葛根素和黃豆苷元的含量分別為1.527、0.140 mg/mL的溶液備用。

1.6 葛根素及黃豆苷元富集液的制備

1.6.1 葛根素和黃豆苷元的上樣吸附 選用大孔樹(shù)脂HPD800富集葛根提取液中的葛根素及黃豆苷元，具體操作如下：稱取10.0 g預(yù)處理好的樹(shù)脂，采用濕法裝柱，測(cè)得柱體積（1 BV）為14 mL；將提取液pH值調(diào)至6，在25℃條件下進(jìn)行吸附，流速為1 BV/h。

1.6.2 葛根素及黃豆苷元富集液的制備 當(dāng)樹(shù)脂吸附飽和后，用1 BV去離子水洗滌樹(shù)脂除去雜質(zhì)，在25℃條件下用70%乙醇解吸，流速為1 BV/h，得葛根素和黃豆苷元富集液。按式（1）計(jì)算葛根素及黃豆苷元的純度：

P=CpVp Mp×100%。

（1）

式中：P為葛根素或黃豆苷元樣品純度，%；Cp為葛根素或黃豆苷元樣品濃度，mg/mL；Vp為樣品溶液的體積，mL；Mp為葛根黃酮粉末質(zhì)量，mg。

1.7 葛根素及黃豆苷元的分離純化

1.7.1 葛根素和黃豆苷元的分離 將富集液減壓濃縮至無(wú)醇味，取10 mL分別加入10 mL乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷進(jìn)行萃取[14-15]，HPLC檢測(cè)其有機(jī)溶劑中的葛根素和黃豆苷元的含量，選擇合適的萃取溶劑，按式（2）計(jì)算葛根素及黃豆苷元的萃取率：

G=CgVg Mg×100%。

（2）

式中：G為葛根素及黃豆苷元的萃取率，%；Cg為萃取劑中葛根素和黃豆苷元的濃度，mg/mL；Vg為萃取溶液的體積，mL；Mg為富集液中葛根素及黃豆苷元的質(zhì)量，mg。

1.7.2 黃豆苷元結(jié)晶 選取合適的有機(jī)溶劑作為黃豆苷元的萃取溶劑，并考察萃取次數(shù)對(duì)于黃豆苷元萃取率的影響。然后將黃豆苷元萃取液減壓蒸干得黃豆苷元粗品，稱取黃豆苷元粗品1.0 g，加入40 mL 50%乙醇溶液進(jìn)行結(jié)晶。

1.7.3 葛根素結(jié)晶 將“1.7.1”節(jié)中萃余相減壓濃縮，除去其中少量的有機(jī)溶劑，以水飽和的正丁醇為萃取溶劑萃取其中的葛根素，并考察萃取次數(shù)對(duì)于葛根素萃取率的影響。然后將葛根素萃取液減壓蒸干得葛根素粗品，稱取葛根素粗品1.0 g，加入40 mL 90%乙酸溶液進(jìn)行結(jié)晶。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根素及黃豆苷元富集液的制備

2.1.1 提取液的上樣吸附 本試驗(yàn)采用大孔樹(shù)脂HPD800對(duì)葛根素和黃豆苷元進(jìn)行吸附，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示：當(dāng)上樣液中葛根素及黃豆苷元的含量分別為1.527 mg/mL和0.140 mg/mL，上樣流速為1 BV/h時(shí)，上樣液用量為840 mL（60 BV），此時(shí)樹(shù)脂對(duì)葛根素及黃豆苷元的吸附均已達(dá)飽和，其飽和吸附量分別為（71.78±0.75） mg/g和（21.77±0.01）mg/g。

2.1.2 葛根素及黃豆苷元富集液的制備 以70%的乙醇溶液為解析液對(duì)樹(shù)脂上吸附的葛根素及黃豆苷元進(jìn)行解析。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：在解析流速為1 BV/h時(shí)，解析液用量為140 mL（10 BV），此時(shí)葛根素及黃豆苷元的吸附均可解析完全。經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂分離純化后，葛根素的純度從8.62%增加到35.26%、黃豆苷元的純度從0.276%增加到10.17%，且葛根素和黃豆苷元的回收率分別為81.71%和79.59%。

2.2 葛根素及黃豆苷元的分離純化

2.2.1 葛根素和黃豆苷元的分離 葛根素和黃豆苷元的極性相差較大，且在同種溶劑中的溶解度相差較大，因此本試驗(yàn)擬通過(guò)溶劑萃取技術(shù)，達(dá)到富集液中葛根素和黃豆苷元分離的效果。本試驗(yàn)考察了不同有機(jī)溶劑對(duì)葛根素和黃豆苷元萃取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。可以看出，用乙酸乙酯可以對(duì)葛根素和黃豆苷元達(dá)到很好的分離效果，對(duì)黃豆苷元的萃取率高達(dá)（96.75±1.33）%。且乙酸乙酯較三氯甲烷和乙醚安全性更高，故而選擇乙酸乙酯作為葛根素和黃豆苷元的分離溶劑。

2.2.2 萃取次數(shù)對(duì)葛根素和黃豆苷元萃取率的影響 選擇乙酸乙酯作為黃豆苷元的萃取溶劑，并考察了萃取次數(shù)對(duì)黃豆苷元萃取率的影響，結(jié)果（表3）表明，等體積乙酸乙酯萃取1次就能將溶液中大部分的黃豆苷元萃取出來(lái)， 因此選擇黃豆苷元的萃取次數(shù)為1次。選擇水飽和的正丁醇作為葛根素的萃取溶劑，并考察了萃取次數(shù)對(duì)葛根素萃取率的影響，結(jié)果（表3）表明，等體積水飽和的正丁醇萃取2次能將溶液中大部分黃豆苷元萃取出來(lái)，因此選擇葛根素萃取次數(shù)為2次。

2.2.3 葛根素結(jié)晶 將葛根素及黃豆苷元粗品分別用10%乙酸和50%乙醇結(jié)晶1次，得到葛根素和黃豆苷元產(chǎn)品，其純度分別為91.32%和93.81%，回收率分別為12.5%和15.77%。圖3給出了葛根素（A）及黃豆苷元（B）結(jié)晶后的HPLC色譜圖，可以看出，經(jīng)過(guò)不同的溶劑結(jié)晶后，葛根素及黃豆苷元樣品中的雜質(zhì)含量顯著減少。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)HPD800型大孔吸附樹(shù)脂富集后，葛根素的純度從8.62%增加到35.26%、黃豆苷元的純度從0.276%增加到10.17%，用乙酸乙酯可以對(duì)葛根素和黃豆苷元達(dá)到很好的分離效果并且同時(shí)萃取黃豆苷元，萃取的次數(shù)對(duì)于萃取率來(lái)說(shuō)也有很大的影響。以水飽和的正丁醇作為葛根素萃取溶劑，萃取2次萃取率可達(dá)92.32%。黃豆苷元用乙酸乙酯萃取1次的萃取率就可以達(dá)到94.75%。

選取90%乙酸作為葛根素重結(jié)晶的溶劑，經(jīng)過(guò)1次重結(jié)晶，葛根素的純度可達(dá)91.32%，收率為12.5%，黃豆苷元的純度可達(dá)93.81%，收率為15.77%。

本研究所提出的方法可以快速有效地分離、純化葛根素和黃豆苷元，適合用于葛根素和黃豆苷元的工業(yè)化生產(chǎn)。

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