Toll樣受體在新生兒呼吸窘迫綜合征中作用的研究

熊 維,蒲向陽(yáng)，李曉文

(1.重慶市酉陽(yáng)縣人民醫(yī)院兒科 409800；2.重慶市黔江區(qū)中心醫(yī)院兒科 409000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科 400014)

Toll樣受體在新生兒呼吸窘迫綜合征中作用的研究

熊 維1,蒲向陽(yáng)2△，李曉文3

(1.重慶市酉陽(yáng)縣人民醫(yī)院兒科 409800；2.重慶市黔江區(qū)中心醫(yī)院兒科 409000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科 400014)

目的 探討Toll樣受體在新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)中的作用。方法 選取酉陽(yáng)縣人民醫(yī)院2014年10月至2015年10月的42例NRDS患兒作為病例組，選取同期的42例非NRDS患兒作為對(duì)照組，對(duì)兩組研究對(duì)象的TLR2、TLR3和TLR4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、JNK和核因子-κB(NF-κB)血清學(xué)水平進(jìn)行檢查，TLRs/JNK/NF-κB/TNF-α信號(hào)通路進(jìn)行表達(dá)，分析TLR2、TLR3和TLR4血清學(xué)水平與NRDS發(fā)病的相關(guān)性，以及TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB與NRDS發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果 兩組患者的治療后3 d和7 d的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清學(xué)水平與治療前存在明顯差異，而且病例組的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清學(xué)水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者治療后3 d和治療后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明顯低于治療前，而且病例組治療后3 d和治療后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清學(xué)水平與NRDS發(fā)病具有良好的相關(guān)性，TLR2、TLR3和TLR4與NRDS發(fā)病具有良好相關(guān)性。結(jié)論 對(duì)NRDS的Toll樣受體分析可以更好的發(fā)現(xiàn)TLRs/JNK/ NF-κB/TNF-α信號(hào)通路與新生兒呼吸窘迫綜合征的相關(guān)性。

Toll樣受體；呼吸窘迫綜合征，新生兒；肺表面活性物質(zhì)；TLRs/JNK/ NF-κB/TNF-α信號(hào)通路

新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)是出生新生兒的一種常見(jiàn)的呼吸道重癥，而且也是早產(chǎn)兒常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因。相關(guān)的資料顯示NRDS是新生兒在出生一年內(nèi)容易患上的疾病[1-2]。此外，NRDS也是我國(guó)NICU住院期間平均費(fèi)用是新生兒呼吸衰竭疾病譜中最高[3-4]。目前一致認(rèn)為肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)缺乏是NRDS的發(fā)病機(jī)制[5]。PS相關(guān)蛋白是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷的一個(gè)重要標(biāo)志物，SP-A與急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)具有良好的負(fù)相關(guān)，而且SP-A水平下降也可以說(shuō)明ARDS也會(huì)嚴(yán)重發(fā)生，可能的原因是SP-A可以抑制C1q介導(dǎo)的補(bǔ)體活化和炎性反應(yīng)，而且還可以與先天免疫的Toll樣受體(TLRs)有著一定關(guān)系。目前有關(guān)TLRs與ARDS的研究已見(jiàn)很多報(bào)道，而NRDS中TLRs的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。對(duì)NRDS固有免疫功能的因子如粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞數(shù)量的研究可為進(jìn)一步了解在該病的發(fā)生，而且對(duì)發(fā)展過(guò)程中的特異免疫TLRs、TNF-α、IL-6等相關(guān)因子具有一定參考。因此，本課題通過(guò)對(duì)NRDS患兒體內(nèi)外周血免疫細(xì)胞有關(guān)TLRs信號(hào)通路分子的檢測(cè)統(tǒng)計(jì)分析，探討血清TLRs(TLR2～4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、JNK和核因子-κB(NF-κB)水平與NRDS發(fā)生之間的關(guān)系，分析其參與NRDS發(fā)病的機(jī)制，并進(jìn)一步觀測(cè)患兒的預(yù)后，探討TLRs與患兒病情的相關(guān)性，以尋求合適有效的指標(biāo)預(yù)測(cè)病情。

表1 兩組患者的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB的比較

a:P<0.05，與治療前比較。

表2 兩組患者的TLR2、TLR3和TLR4的比較

a：P<0.05，與治療前比較；b：P<0.05，與對(duì)照組比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年10月至2016年1月酉陽(yáng)縣人民醫(yī)院新生兒科收治的診斷為NRDS的患兒共42例作為病例組，其中，男25例，女17例，出生1～5 d，平均(1.1±2.7)d；并將同期住院的42例非NRDS患兒為對(duì)照組，其中，男24例，女18例，出生1～11 d，平均(5.6±2.5)d。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)[6]入組病例填寫(xiě)病例收集信息表和知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)出生后6 h內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難，并伴有呼氣呻吟、低氧血癥表現(xiàn)的患兒；(2)試驗(yàn)的胃液泡沫顯示陰性的患兒；(3)胸片檢查顯示肺透氣度降低和細(xì)顆粒狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血液或其他體液培養(yǎng)顯示陽(yáng)性、白細(xì)胞增高或降低、C反應(yīng)蛋白(CRP)增高等發(fā)生感染的患兒；(2)伴有先天性疾病的患兒；(3)肺和胸壁畸形；(4)臨床懷疑為代謝性疾??；(5)新生兒腦病。

1.3 方法

1.3.1 指標(biāo)檢測(cè)[7]所有研究對(duì)象，均在納入試驗(yàn)后第2天清晨未進(jìn)食前進(jìn)行靜脈采血。等血液凝固后采用4 000 r/min離心10 min，分離血清并放置于Eppendorf管中，-40 ℃冷凍保存待用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLRs，具體步驟如下：取乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的全血100 μL，分別加入20 μL PE標(biāo)記的鼠抗人TLRs單克隆抗體，混勻后室溫避光孵育30 min；用QPREP標(biāo)本處理儀進(jìn)行白細(xì)胞固定和紅細(xì)胞破膜，室溫避光10 min，離心后棄去上清液；用2 mL 固定洗滌液洗滌2次后棄去上清液；用500 μL洗滌液重懸后就可以采用流式細(xì)胞儀行檢測(cè)。

1.3.2 血常規(guī)檢查 研究對(duì)象靜脈采血后進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，特別是中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(各亞群)檢測(cè)，并記錄收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.3 記錄患者的預(yù)后 所有患兒采用相同的治療方法治療后記錄患者不同時(shí)間點(diǎn)的預(yù)后情況。

1.4 觀察指標(biāo) (1)由股靜脈抽血采集血樣，血常規(guī)計(jì)數(shù)、WBC、PMN和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組和NRDS組研究對(duì)象血清中TLR2、TLR3和TLR4的表達(dá)情況；(2)ELISA檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB的變化情況；(3)檢測(cè)NRDS組經(jīng)治療后3 d和7 d的TLR2、TLR3和TLR4血清學(xué)水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者TNF-α、IL-6、JNF和NF-κB比較 兩組患者的治療后3 d和7 d的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清學(xué)水平與治療前存在明顯差異，而且病例組的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清學(xué)水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 兩組患者的TLR2、TLR3和TLR4的比較 兩組患者治療后3 d和治療后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明顯低于治療前，而且病例組治療后3 d和治療后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 影響NRDS的Logistic回歸分析 TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清學(xué)水平與NRDS發(fā)病具有良好相關(guān)性，以及TLR2、TLR3和TLR4與NRDS發(fā)病具有良好相關(guān)性,見(jiàn)表3。

表3 影響NRDS的Logistic回歸分析

3 討 論

NRDS的發(fā)生與肺表面活性物質(zhì)上的蛋白有一定關(guān)系。肺表面活性物質(zhì)是由磷脂、蛋白質(zhì)和中性脂肪組成，并通過(guò)肺泡Ⅱ型細(xì)胞合成、貯存及分泌[8]，可以明顯降低氣道中氣液界面的表面張力，防止肺泡和細(xì)支氣管發(fā)生萎陷，并且保持氣道的開(kāi)放狀態(tài)。SP-A是一種最先在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)的蛋白，而且其含量很豐富。此物質(zhì)的表達(dá)與呼吸窘迫綜合征的發(fā)生有密切關(guān)系，相關(guān)的報(bào)道也表明了肺表面活性物質(zhì)上TLRs的表達(dá)影響呼吸窘迫綜合征的發(fā)生，其嚴(yán)重程度需要進(jìn)一步考究。TLRs的表達(dá)主要在抗原提呈細(xì)胞，以及與先天性免疫相關(guān)的中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞有關(guān)。

TLRs是一種類似微生物的病原體侵入機(jī)體后就會(huì)激活細(xì)胞而產(chǎn)生免疫防御的天然免疫受體[9]。當(dāng)前TLR家族共有11個(gè)受體，分布于人體的各個(gè)器官的細(xì)胞中，并對(duì)不同的病原體發(fā)揮不同免疫防御作用。TLR2和TLR4是代表性受體，當(dāng)病原體入侵人體，以及天然免疫經(jīng)TLR受體激活就會(huì)誘發(fā)的炎性反應(yīng)，TLR2和TLR4在這種免疫反應(yīng)中具有主導(dǎo)作用[10]。TLR-2主要識(shí)別革蘭陽(yáng)性細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)，對(duì)此微生物比較敏感，而TLR-3 主要參與非感染性 ARDS 的病理反應(yīng)，對(duì)ARDS 引起的感染不敏感，TLR-4 是與內(nèi)毒素(LPS)結(jié)合的受體，對(duì)毒素近期的感染比較敏感[11]。NRDS是否也通過(guò) TLR 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)目前還未見(jiàn)報(bào)道。但是有研究認(rèn)為，Toll樣受體與胎齡和窒息、缺血缺氧性腦病、新生兒感染、慢性肺損傷等疾病的發(fā)生有關(guān)。因此本研究中TLR2、TLR-3 和TLR4隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，就會(huì)越來(lái)越低，也說(shuō)明患者的病情也逐漸減少。

當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)感染或疾病后，TLRs和配體就會(huì)很快結(jié)合，并產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和C-Jun氨基末端激酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，這種反應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并激活抗微生物發(fā)生天然免疫應(yīng)答[12]，從而達(dá)到免疫防御的作用。新生兒由于各種器官發(fā)育不完全、不成熟，于是特異的免疫功能就不健全，因此，更容易因?yàn)椴≡w的感染而發(fā)生疾病，而目前NRDS中TLRs的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。對(duì)NRDS固有的免疫功能如粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞數(shù)量和功能進(jìn)行研究，可以進(jìn)一步了解該病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中TLRs、TNF-α、IL-6等相關(guān)免疫因子的變化，從而更深入的研究TLRs與NRDS的關(guān)系具有重要作用。當(dāng)患者患病后患者的炎性因子也會(huì)升高，通過(guò)治療后3 d和7 d的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清學(xué)水平與治療前存在明顯差異。

本研究通過(guò)對(duì)NRDS患兒體內(nèi)外周血免疫細(xì)胞相關(guān)的TLRs信號(hào)通路分子的檢測(cè)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)血清TLRs(TLR2～4)、TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB水平與NRDS發(fā)生具有良好的關(guān)系。而且NRDS的TLRs(TLR2-4)、TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB水平與非NRDS存在明顯差異。而且在治療后3 d升高，而后下降?？梢?jiàn)，NRDS患者的Toll樣受體對(duì)發(fā)病具有重要的作用。通過(guò)Logistic回歸分析可知Toll樣受體中的TLR2，TLR3，TLR4與NRDS呈負(fù)相關(guān)，NRDS越嚴(yán)重，Toll樣受體中的TLR2、TLR3、TLR4就會(huì)降低，這也表明Toll樣受體中的TLR2、TLR3、TLR4可以激活機(jī)體細(xì)胞的免疫功能，從而起到防御作用。

綜上所述，對(duì)NRDS的Toll樣受體分析可以更好的發(fā)現(xiàn)TLRs/JNK/ NF-κB/TNF-α信號(hào)通路與NRDS的相關(guān)性。

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The study of Toll-like receptors in the neonatal respiratory distress syndrome

XiongWei1,PuXiangyang2△,LiXiaowen3

(1.DepartmentofPaediatrics,People′sHospitalofYouyangCounty,Chongqing409800,China; 2.DepartmentofPaediatrics,CentralHospitalofQianjiangDistrict,Chongqing409000,China;3.DepartmentofNewPediatric,theAffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

Objective To study the toll-like receptors in neonatal respiratory distress syndrome (NRDS).Methods Forty two cases of neonatal respiratory distress syndrome were selected as cases group from October 2014 to October 2015,42 cases of neonatal respiratory distress syndrome in the same period were selected as the control group.The TLR2,TLR3 and TLR4 serology,TLRs/JNK/nf-kappa B/TNF alpha express signal path were analyzed;the corelation between TLR2,TLR3 and TLR4 serological levels and the incidence of NRDS was analyzed,and corelation between TNF-α,IL-6,JN,NF-κB and the incidence of NRDS was analyzed,too.Results The TNF-α,IL-6,JNK and nf-kappa B serological levels at 3rd and 7th day between two groups were significantly different compared with pre-treatment levels.And the TNF-α,IL-6,JNK and nf-kappa B serological levels between the case group and the control group were significantly different,too (P<0.05);the TLR2,TLR3 and TLR4 on the 3rd and 7th day after treatment were significantly lower than that of pretreatment,and the TLR2,TLR3 and TLR4 on the 3rd and 7th day after treatment of case group were significantly lower than that of control group (P<0.05);TNF -a,IL - 6,JNK and nf-kappa B serological levels and the NRDS incidence were closely related,and TLR2,TLR3 and TLR4 and the NRDS incidence were closely related,too.Conclusion The analysis of toll-like receptors in neonatal respiratory distress syndrome can help to find the correlation between TLRs/JNK/nf-kappa B/TNF alpha signaling pathways and the neonatal respiratory distress syndrome.

Toll-like receptors;respiratory distress syndrome,newborn;lung surface active substance;TLRs/JNK/NF-kappa B/TNF alpha signaling pathways

熊維(1969-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事新生兒疾病研究?！?/p>

,E-mail:cqqjpxy@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.020

R722.6

A

1671-8348(2016)34-4814-03

2016-03-29

2016-05-13)