Claudin-1胞外片段Cldn-153～80的作用在乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中的研究*

彭亞琪， 蔡瑜嬌，江恩來，孫立華

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院普通外科，重慶 400037)

Claudin-1胞外片段Cldn-153～80的作用在乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中的研究*

彭亞琪， 蔡瑜嬌△，江恩來，孫立華

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院普通外科，重慶 400037)

目的 觀察Claudin-1在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，探討Claudin-1的胞外區(qū)Cldn-153～80片段在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。方法 (1)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)108例乳腺癌標(biāo)本中 Claudin-1的表達(dá)情況，并分析其與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期和分子分型間的關(guān)系；(2)在乳腺癌細(xì)胞株中摻入Cldn-153～80片段，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白Claudin-1、Claudin-2的表達(dá)。結(jié)果 (1)以是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分子分型等病理特征為依據(jù)分組中，Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=6.279，P=0.012)、TNM分期Ⅲ、Ⅳ期(χ2=7.419，P=0.024)及分子分型為Her-2過表達(dá)型(χ2=10.830，P=0.013)組中顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(2) Cldn-153～80片段的摻入可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中緊密連接蛋白Claudin-1及Claudin-2的表達(dá)下降，在轉(zhuǎn)移性高的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，這種抑制作用更為顯著。結(jié)論 緊密連接蛋白 Claudin-1的表達(dá)降低與乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而Cldn-153～80片段通過調(diào)控緊密連接蛋白的表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

乳腺腫瘤；淋巴轉(zhuǎn)移；Claudin-1；轉(zhuǎn)移機(jī)制；胞外片段；Cldn-153～80

乳腺癌的發(fā)病率在女性癌癥譜中位居首位，作為影響女性生存期及生存質(zhì)量的主要疾病已被人們所共識(shí)。在乳腺癌的診療中，控制疾病的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是影響患者生存期及生存質(zhì)量的關(guān)鍵。緊密連接是上皮細(xì)胞間連接的主要形式，它的結(jié)構(gòu)與功能的破壞與乳腺癌的轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。在正常乳腺組織中，Claudins蛋白家族參與構(gòu)成了上皮細(xì)胞間的緊密連接，維持細(xì)胞極性、黏附性，控制細(xì)胞的增殖及遷移[1-2]。而在乳腺發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的過程中，緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能顯著破壞，導(dǎo)致細(xì)胞極性、黏附性破壞，細(xì)胞的增殖及遷移能力增強(qiáng)[2]，有利于乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中，Claudin-1蛋白在維持上皮細(xì)胞緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能中至關(guān)重要[3]。本研究收集了臨床乳腺癌標(biāo)本108例，通過觀察乳腺癌組織中Claudin-1的表達(dá)與病理特征的關(guān)系，探討其胞外區(qū)Cldn-153～80片段在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2013年9月至2015年12月乳腺癌手術(shù)的大體標(biāo)本108例，術(shù)后均病理證實(shí)為浸潤(rùn)性乳腺癌。標(biāo)本均為女性，年齡27～74歲。分別為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌98例，浸潤(rùn)性小葉癌5例，髓樣癌1例，小管癌2例，腺樣囊性癌1例，黏液腺癌1例。根據(jù)乳腺癌分子分型，管腔上皮A(Luminal A)型24例，管腔上皮B(Luminal B)型45例，Her-2過表達(dá)型14例，三陰型25例。根據(jù)TNM分期，Ⅰ期13例，Ⅱ期62例，Ⅲ期32例，Ⅳ期1例。其中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。所有患者均未行術(shù)前放療、化療及內(nèi)分泌治療。標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林溶液處理后包埋固定。人類乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7由第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器 Claudin-1 抗體(Abcam公司1∶1 000)。Claudin-2 抗體(Abcam公司1∶500)。Cldn-153～80(Ac-SCVSQSTGQIQCKV-Phe-DSLLNLSSTLQAT-NH2)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 收集108例臨床乳腺癌大體標(biāo)本并作數(shù)據(jù)分析，以年齡、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分子分型等特征分組。

1.3.2 免疫組織化學(xué) 將臨床乳腺癌病理組織石蠟包埋，作4 μm切片，60 ℃下拷片1 h，脫蠟及復(fù)水；過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性；微波抗原修復(fù)；山羊血清蛋白阻斷非特異性染色；滴加一抗(4 ℃，過夜)；滴加二抗(37 ℃，20 min)；滴加鏈霉素親和素-生物素并進(jìn)行親和孵育(37 ℃，30 min)；DAB顯色。用PBS液作陰性對(duì)照。結(jié)果評(píng)定：無背景著色情況下，細(xì)胞出現(xiàn)黃色顆粒者為陽(yáng)性。計(jì)算高倍鏡下(×400)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并賦予分值：≤ 5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。觀察著色強(qiáng)度并賦予分值：無著色為0分；著淺黃色為1分；著黃色為2分；著棕黃色為3分。兩者相乘：0分為(-)；1～4分為(+)；5～8分為(++)；9～12分為(+++)。每張切片由兩名高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分后取平均值作為該病例最終評(píng)分：將評(píng)分(-)～(+)設(shè)為低表達(dá)；評(píng)分(++)～(+++)設(shè)為高表達(dá)。

1.3.3 摻入Cldn-153～80片段 將MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，加入200 μmol/L濃度的Cldn-153～80小肽段，24 h， 4 ℃下孵育過夜；平衡鹽溶液、BS3交聯(lián)液洗滌，室溫孵育1 h；提取全細(xì)胞的總蛋白。

1.3.4 Western blot 取等量樣品上樣并進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜；室溫下封閉1 h，切膜;加入相應(yīng)抗體，Claudin-1(小鼠 1∶1 000)，Claudin-2(小鼠 1∶5 000)，β-actin(小鼠 1∶5 000)購(gòu)自Abcam公司;4 ℃下孵育過夜，然后1×TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗(Claudin-1抗鼠1∶3 000、Claudin-2抗鼠1∶3 000、actin抗鼠 1∶10 000)，室溫下?lián)u床孵育 2 h，用1×TBST漂洗3遍，每次30 min；經(jīng) BioRad顯影，通過凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)處理在SPSS 13.0軟件上完成。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異分析采用Studentt-test。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌中Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度與病理特征的關(guān)系 乳腺癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Claudin-1表達(dá)強(qiáng)度弱于無淋巴轉(zhuǎn)移組(χ2=6.279，P=0.012)。乳腺癌TNM分期中，Ⅰ期和Ⅱ期組之間的Claudin-1表達(dá)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ期及Ⅳ期的Claudin-1表達(dá)強(qiáng)度明顯弱于前者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.419，P=0.024)。在乳腺癌不同的分子分型中，僅Her-2過表達(dá)型的Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度弱于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.830，P=0.013)。見表1、圖1。

A：Claudin-1表達(dá)(+)；B：Claudin-1表達(dá)(++)；C：Claudin-1表達(dá)(+++)。

圖1 Claudin-1在不同乳腺癌組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)

表1 Claudin-1的表達(dá)與乳腺癌病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.2 Western blot檢測(cè)緊密連接蛋白的表達(dá) Cldn-153～80片段的摻入，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞株中Claudin-1及Claudin-2蛋白的表達(dá)均下調(diào)，其中，相對(duì)于轉(zhuǎn)移性較低的MCF-7乳腺癌細(xì)胞株而言，Claudin-1及Claudin-2蛋白在轉(zhuǎn)移性較高的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)顯著下調(diào)(圖2)。

A：Cldn-153～80片段的摻入后乳腺癌細(xì)胞中Claudin-1蛋白的表達(dá)下降。B：Cldn-153～80摻入后乳腺癌細(xì)胞中Claudin-2蛋白的表達(dá)下降。

圖2 摻入Cldn-153～80片段導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中Claudin-1、Claudin-2蛋白表達(dá)的變化

3 討 論

乳腺癌的轉(zhuǎn)移常發(fā)生在骨骼、肝臟、顱腦和肺部，并成為了該病致死的主要因素[4-5]。乳腺癌在發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中，乳腺上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，失去典型的上皮細(xì)胞黏附性及極性，并被誘導(dǎo)增殖，從而獲得遷移能力，誘使腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位通過血管和淋巴管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移包含了向細(xì)胞外基質(zhì)及基質(zhì)層細(xì)胞侵襲、入侵循環(huán)系統(tǒng)并存活于其中、溢出至靶器官、建立轉(zhuǎn)移器官中的腫瘤微環(huán)境及在轉(zhuǎn)移器官中克隆增殖等一系列細(xì)胞生物學(xué)事件[7]。

緊密連接(tight junctions,TJs)是維持上皮細(xì)胞間屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Claudins蛋白、ZO蛋白、E-cadherin蛋白等都是構(gòu)成緊密連接的重要成分。其中，Claudins家族是維持緊密連接結(jié)構(gòu)的主要跨膜蛋白。而科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)并命名Claudin-1在維持緊密連接功能和上皮細(xì)胞屏障中至關(guān)重要[8-9]。

本研究顯示，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，Claudin-1的表達(dá)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；隨著腫瘤TNM期別的延遲，Claudin-1的表達(dá)趨于減弱；Her-2過表達(dá)型的乳腺癌細(xì)胞中該蛋白的表達(dá)也有顯著性的降低。以上結(jié)果表明了Claudin-1低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中，其上皮細(xì)胞屏障功能的減弱，增加了乳腺癌細(xì)胞的侵襲力，導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。最新研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的分子分型中，除具特征性的luminal A、luminal B、Her-2過表達(dá)型、三陰性乳腺癌外，Claudin-1低表達(dá)型也可望成為具有指導(dǎo)治療評(píng)估預(yù)后的新分型[10]。這說明Claudin-1在乳腺癌中的表達(dá)狀況可望成為判斷或預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。大量研究表明，Claudin-1的低表達(dá)與乳腺癌的高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)，但其中的具體機(jī)制尚缺乏進(jìn)一步研究。

Claudin-1蛋白由兩個(gè)胞外環(huán)(extracellular loop,EL)和細(xì)胞內(nèi)的N-端和C-端組成。這兩個(gè)EL 區(qū)域?qū)Js的構(gòu)成及維護(hù)有重要意義[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-1的兩個(gè)EL區(qū)域可分為3段：Cldn-131～53、Cldn-153～80、Cldn-1146～160[13]。在對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接的研究中發(fā)現(xiàn)，外源性Cldn153～80可阻斷TJs的修復(fù)，可導(dǎo)致緊密連接中相關(guān)分子如Occludin、JAM、ZO-1等的表達(dá)及定位缺失，使TJs功能降低，從而影響緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。作者推測(cè)，在乳腺癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中，Cldn153～80可能扮演重要角色。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，和低轉(zhuǎn)移性的MCF-7細(xì)胞株中分別摻入外源性Cldn153～80片段，提示Cldn-153～80的摻入導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中Claudin-1及Claudin-2蛋白表達(dá)下降，并且相對(duì)于轉(zhuǎn)移性較低的MCF-7乳腺癌細(xì)胞株而言，該片段的作用是顯著抑制轉(zhuǎn)移性高的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株中Claudin-1及Claudin-2蛋白的表達(dá)。

有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的微環(huán)境直接影響乳腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移，在乳腺癌微環(huán)境中，存在大量的除腫瘤細(xì)胞外的細(xì)胞成分[14]，而這些具有活性的生物大分子正是引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)。本研究顯示，外源性Claudin-153～80片段的摻入，使Claudin-1、Claudin-2表達(dá)降低，相對(duì)于轉(zhuǎn)移性較低的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，在高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，Cldn-153～80片段的作用顯著下調(diào)了緊密連接蛋白Claudin-1及Claudin-2的表達(dá)。因此推斷，在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤微環(huán)境中存在Claudin-1的胞外區(qū)片段，其中包括Cldn-153～80片段，它的作用可能影響了乳腺上皮細(xì)胞緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能，使乳腺上皮細(xì)胞緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能顯著破壞，使腫瘤細(xì)胞的侵襲力得以增長(zhǎng)。本研究提出，緊密連接蛋白Claudin-1的胞外區(qū)片段Cldn-153～80可通過抑制緊密連接蛋白Claudin-1及Claudin-2的表達(dá)來提高乳腺癌細(xì)胞的侵襲力，從而增強(qiáng)乳腺癌的轉(zhuǎn)移性，闡明了Claudin-1的胞外區(qū)片段Cldn-153～80在乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用，其中機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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A Key Claudin Extracellular Loop Domain is Critical for the metastatic of breast cancer*

PengYaqi,CaiYujiao△,JiangEnlai,SunLihua

(DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedXinqiaoHospitalofThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the expressions of tight junction protein claudin-1 in breast cancer tissue and the regulation with the domaination of extracellular loop Cldn-153-80.Methods The expressions of Claudin-1 in the breast cancer samples (n=108) were detected by immunohistochemistry technology.The expressions of Claudin-1 and Claudin-2 with the inception of Cldn-153-80were detected by the technology of Western Blot.Results The expression level of Claudin-1 were associated with lymph node metastases,clinical stage and the molecular typing of breast cancer(P<0.05).Besides,the inception of Cldn-153-83lead to a lower expression of Claudin-1 and Claudin-2(P<0.05).Conclusion Claudin-1 shows a decreasing trend in development and metastases of breast cancer,and Cldn-153-80domain of claudin-1 plays a key role in the regulation of TJ function in breast cancer.

breast neoplasms;lymphatic metastasis;Claudin-1;metastatic;extracellular loop;Cldn-153-80

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.007

重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(cstc2012jjA10078)。作者簡(jiǎn)介：彭亞琪(1990-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事惡性腫瘤的放化療與綜合治療?！?/p>

，E-mail:cyj760628@163.com。

R737.9

A

1671-8348(2016)34-4772-03

2016-05-18

2016-08-06)